我国人类疾病基因控制工程基础研究的近期进展
方福德
关键词：疾病基因 克隆 鉴定 我国科技部为了推动国内有关人类疾病基因控制工程的基础研究，并与我国人类基因组研究相配合，于1994年启动了攀登项目B “人类疾病基因控制工程基础研究”。该项目由我院校基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室牵头，5年来，经过国内4个参加单位10个子课题的共同协作和努力，在科研创新和成果获得、人才培养、学术交流和管理等方面取得了很好的进展，按计划于1999年12月进行了项目结题验收。由卫生部组织的验收专家组在对该项目进行了严格、认真、全面的审查后，认为该项目组织了国内一批优秀的科研群体，建立起一支比较配套的与疾病基因控制工程基础性研究相关的队伍和研究工作体系，开展了与疾病和重要生物学功能相关的基因克隆、测序、染色体定位、功能和表达调控等研究，形成了一定的特色，一批论文已在国内外高水平学术刊物上发表，一批分离到的新基因序列进入了国际数据库，一批研究成果已获得奖励或已申请专利。验收专家组还认为，该项目所取得的成果体现出了前沿性和创新性，在国内、国际产生了一定的影响，为我国相关领域的深入发展奠定了良好的基础，也为我国基因组学的研究作出了贡献。由于该项目所取得的优异成绩，已被转入国家第一批启动的“973”项目。
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本项目的主要目标是在基因水平上探索人类疾病的防治策略、途径、技术及其理论基础。围绕这一目标，开展了三个方面的研究，取得了很好的进展，兹简要介绍如下。
新基因的分离、鉴定和功能研究
自1994年本项目启动以来，在致病基因、疾病相关基因以及与细胞周期及个体发育相关基因的分离、克隆、鉴定和功能研究方面获得了显著的成绩。主要的成果有：
维甲酸调控基因的分离、克隆和鉴定 以陈竺院士、陈赛娟教授为首的研究组为探讨全反式维甲酸(ATRA)对急性早幼粒白血病(APL)诱导分化治疗的分子机制，采用DD-PCR法从白血病细胞株NB4中克隆到4个在维甲酸作用后呈上调的新基因RIG-E、RIG-G、RIG-I和RIG-F(JEM)，序列均已为国际基因数据库GenBank所收录，它们分别定位于染色体8 q24、10 q24、9 p12-13和1q 24，其编码蛋白质产物类型不同，所参与的生化作用途径(通路)也不同。还采用了两种较新的技术：cDNA列阵和差减PCR。用前法分析了近600个具有重要功能的已知人类基因，发现其中若干基因可受维甲酸上调或下调；用后法则分离到近300个受维甲酸调控的基因，其中包括用DD-PCR法分离到的基因，证明了该法的相对特异和效率。这些克隆中有近200个已知基因，已根据其结构、功能进行分类，初步勾画出ATRA下调和上调的主要生化通路。
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与生育和不育相关新基因的筛选及结构功能分析 以王琳芳院士和缪时英教授为首的研究组采用RACE技术和基因组信息学方法完成了4个与生殖有关的cDNA片段的全长序列(HSD-1、HSD-2、HE-20和BS-17)。对HSD-1基因进行编码区基因组结构分析，证明HSD-1存在变位剪切现象，它可有效地调节精子发生不同阶段中精子蛋白的表达和功能。对HSD-1、BS-17、BE-20分别进行在E.coli中的表达，制备了相应的抗体，研究了它们在不同组织器官中的表达状况，对HSD-1和HSD-2基因进行了染色体定位。研究了HSD-2编码蛋白质(ywk-Ⅱ)的抗生育作用。利用酵母双杂交体系分别从睾丸和卵巢文库中筛选出可能与ywk-Ⅱ蛋白胞外段相互作用的3种配体，提示ywk-Ⅱ蛋白对生育调节可能存在多种机制。还从睾丸cDNA库中筛到一个长度为1 933 bp的cDNA(BS-63)，系新发现的基因序列，编码精子核孔蛋白。
与人脑发育相关的新基因的克隆和功能研究 以强伯勤院士和袁建刚教授为首的研究组采用差异显示、电脑克隆和批量化测序等技术，分离到约700个人脑组织表达的EST序列，在此基础上，筛到40多条全长cDNA。通过生物信息学技术对上述cDNA编码的蛋白质进行了亲疏水性分析，二级结构预测和同源性比较，寻找到活性区域。研究了所获得cDNA在不同组织的表达谱，发现3种基因在中枢神经系统的特异表达。研究了这些基因产物的细胞内定位，并研究了其中两个基因(ASH2L1和PHF2)在K562白血病细胞向巨核细胞分化过程中和向红系分化的早期的表达变化情况。人神经系统特异表达基因BL1和人多潜能白血病细胞分化相关基因ASH2L和PHF2已申报专利。
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疾病相关基因的校正及其
正常基因功能的重建
本部分研究的目的是探讨使外源基因在活细胞基因组特定位置上高效而又无不良影响的整合方法，为在体内恢复基因正常功能奠定基础。为此目的，首先需构建一系列高效、特异、安全的基因转移体系，在此基础上改善基因定向插入、替换和敲除技术以及转基因技术，以研究基因功能。建立细胞和动物模型，选择合适的靶基因，进行有关疾病的基因治疗和基因预防的实验研究。几年来，在上述诸项研究中已取得较好进展。
高效、特异、安全的基因转移载体和体系的建立 以侯云德院士为首的研究组开展了“人工病毒”载体，人重组单纯疱疹病毒载体(rHSV)以及AAV病毒包装体系的研究，取得了一批成果：已申请到两项“人工病毒”载体专利，这些病毒载体能自主复制、长期表达外源基因，安全，有效。已申请3项rHSV载体专利并获国家科技进步奖，这些rHSV载体比一般载体转移效率提高50%以上。已申请4项AAV载体专利，提出了两种具有创新性的AAV载体包装策略和生产方案，使大规模生产成为可能。
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转基因动物模型和基因敲除技术的建立 刘德培院士研究组、沈FDA1教授研究组和方福德教授研究组分别采用显微注射法和基因敲除技术建立了β-珠蛋白转基因鼠、白介素-2受体α基因反义敲除技术和转肾素基因鼠，为相关的研究提供了模型。
基因治疗和基因预防的实验性研究 刘德培院士研究组采用反转录病毒(N2A)介导的基因转移方法建立了3个含红系增强子IVS Ⅱ部分缺失的β-珠蛋白基因(ΔβE292，ΔβE341，ΔβE100)的产病毒细胞系，进行了小鼠骨髓和脾中人β-珠蛋白表达观察，为β地中海贫血的基因治疗提供基础。卢圣栋教授研究组进行了肝细胞导向的促红细胞生成素(EPO)基因复合物对大鼠肾性贫血的治疗，肝细胞导向的促血小板生成素(TPO)基因复合物对卡铂诱导的大鼠血小板减少症的治疗和高血压与肾病综合征基因治疗的研究，取得了可喜的进展。方福德研究组有关化学致癌的基因预防实验研究也取得了良好结果。
基因表达调控机制的研究
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为了探讨以基因为基础的疾病控制途径和方法，必先研究特定基因在时(发育阶段)、空(组织或细胞特异性)控制下，选择性和有序地表达，以便定时、定量地在人体内有选择地表达基因产物，为第二代基因治疗提供新的思路和依据。
基因转录的调控机制研究 张俊武教授研究组研究了珠蛋白Gr基因异常持续表达的机制，发现了一种与胎儿Gr珠蛋白基因在成人期持续活跃表达相关的yunnanese(Arδβ)°——地中海贫血缺失突变体，提出了“因缺失导致的增强子类顺序接近Gr基因是突变体Gr基因在成人期获持续活跃表达的原因”的假说，并用一系列实验证明了该假说是成立的。沈FDA1教授研究组以淋巴细胞和热休克蛋白基因为对象，研究了人类基因多元调控的机制，发现在hsp90β基因第一内含子的区域中存在多个新的转录起始位点和一个热诱导特异的转录起始点，以及两个典型的热休克元件是hsp90β基因依赖于热诱导的特异增强子。第一内含子参与其组成性表达。对hsp90α基因表达的顺式调节、组织特异性及信号传导控制的研究也取得了诸多成果。
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基因表达的转录后调控研究 沈FDA1研究组发现白介素-2受体α(IL-2Rα)存在变位剪接现象，并搞清了该基因中发生变位剪接的结构基础和特点，为进一步了解IL-2Rα基因组的结构和变位剪接的机制奠定了基础。沈岩教授研究组在脆性X综合征中导致智力低下的基因FMRl的研究中，发现了该基因的多种方式变位剪接，FMRP(FMR1表达产物)能与泛素转运酶及T/G碱基错配DNA糖苷酶(TDG)同源基因的表达产物相互作用。克隆了FMRl同源基因并研究了它们的变位剪接表达。以上研究为真核基因表达的转录后调控机制提供了有价值的资料。
本项目以“分子水平的设计，细胞水平的验证，整体水平的实施”为主导思想，将基因分离、功能研究和表达调控结合起来形成整体，在合适的细胞、动物模型上进行疾病控制工程的研究，对于重大疾病的防治具有重要的科学意义。通过本项目也促进了国内有关单位的强强联合和协作，对于推动国内生物医学的整体研究水平和开辟新的局面起到了积极的作用。
方福德(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室， 北京 100005), http://www.100md.com
关键词：疾病基因 克隆 鉴定 我国科技部为了推动国内有关人类疾病基因控制工程的基础研究，并与我国人类基因组研究相配合，于1994年启动了攀登项目B “人类疾病基因控制工程基础研究”。该项目由我院校基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室牵头，5年来，经过国内4个参加单位10个子课题的共同协作和努力，在科研创新和成果获得、人才培养、学术交流和管理等方面取得了很好的进展，按计划于1999年12月进行了项目结题验收。由卫生部组织的验收专家组在对该项目进行了严格、认真、全面的审查后，认为该项目组织了国内一批优秀的科研群体，建立起一支比较配套的与疾病基因控制工程基础性研究相关的队伍和研究工作体系，开展了与疾病和重要生物学功能相关的基因克隆、测序、染色体定位、功能和表达调控等研究，形成了一定的特色，一批论文已在国内外高水平学术刊物上发表，一批分离到的新基因序列进入了国际数据库，一批研究成果已获得奖励或已申请专利。验收专家组还认为，该项目所取得的成果体现出了前沿性和创新性，在国内、国际产生了一定的影响，为我国相关领域的深入发展奠定了良好的基础，也为我国基因组学的研究作出了贡献。由于该项目所取得的优异成绩，已被转入国家第一批启动的“973”项目。
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本项目的主要目标是在基因水平上探索人类疾病的防治策略、途径、技术及其理论基础。围绕这一目标，开展了三个方面的研究，取得了很好的进展，兹简要介绍如下。
新基因的分离、鉴定和功能研究
自1994年本项目启动以来，在致病基因、疾病相关基因以及与细胞周期及个体发育相关基因的分离、克隆、鉴定和功能研究方面获得了显著的成绩。主要的成果有：
维甲酸调控基因的分离、克隆和鉴定 以陈竺院士、陈赛娟教授为首的研究组为探讨全反式维甲酸(ATRA)对急性早幼粒白血病(APL)诱导分化治疗的分子机制，采用DD-PCR法从白血病细胞株NB4中克隆到4个在维甲酸作用后呈上调的新基因RIG-E、RIG-G、RIG-I和RIG-F(JEM)，序列均已为国际基因数据库GenBank所收录，它们分别定位于染色体8 q24、10 q24、9 p12-13和1q 24，其编码蛋白质产物类型不同，所参与的生化作用途径(通路)也不同。还采用了两种较新的技术：cDNA列阵和差减PCR。用前法分析了近600个具有重要功能的已知人类基因，发现其中若干基因可受维甲酸上调或下调；用后法则分离到近300个受维甲酸调控的基因，其中包括用DD-PCR法分离到的基因，证明了该法的相对特异和效率。这些克隆中有近200个已知基因，已根据其结构、功能进行分类，初步勾画出ATRA下调和上调的主要生化通路。
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与生育和不育相关新基因的筛选及结构功能分析 以王琳芳院士和缪时英教授为首的研究组采用RACE技术和基因组信息学方法完成了4个与生殖有关的cDNA片段的全长序列(HSD-1、HSD-2、HE-20和BS-17)。对HSD-1基因进行编码区基因组结构分析，证明HSD-1存在变位剪切现象，它可有效地调节精子发生不同阶段中精子蛋白的表达和功能。对HSD-1、BS-17、BE-20分别进行在E.coli中的表达，制备了相应的抗体，研究了它们在不同组织器官中的表达状况，对HSD-1和HSD-2基因进行了染色体定位。研究了HSD-2编码蛋白质(ywk-Ⅱ)的抗生育作用。利用酵母双杂交体系分别从睾丸和卵巢文库中筛选出可能与ywk-Ⅱ蛋白胞外段相互作用的3种配体，提示ywk-Ⅱ蛋白对生育调节可能存在多种机制。还从睾丸cDNA库中筛到一个长度为1 933 bp的cDNA(BS-63)，系新发现的基因序列，编码精子核孔蛋白。
与人脑发育相关的新基因的克隆和功能研究 以强伯勤院士和袁建刚教授为首的研究组采用差异显示、电脑克隆和批量化测序等技术，分离到约700个人脑组织表达的EST序列，在此基础上，筛到40多条全长cDNA。通过生物信息学技术对上述cDNA编码的蛋白质进行了亲疏水性分析，二级结构预测和同源性比较，寻找到活性区域。研究了所获得cDNA在不同组织的表达谱，发现3种基因在中枢神经系统的特异表达。研究了这些基因产物的细胞内定位，并研究了其中两个基因(ASH2L1和PHF2)在K562白血病细胞向巨核细胞分化过程中和向红系分化的早期的表达变化情况。人神经系统特异表达基因BL1和人多潜能白血病细胞分化相关基因ASH2L和PHF2已申报专利。
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疾病相关基因的校正及其
正常基因功能的重建
本部分研究的目的是探讨使外源基因在活细胞基因组特定位置上高效而又无不良影响的整合方法，为在体内恢复基因正常功能奠定基础。为此目的，首先需构建一系列高效、特异、安全的基因转移体系，在此基础上改善基因定向插入、替换和敲除技术以及转基因技术，以研究基因功能。建立细胞和动物模型，选择合适的靶基因，进行有关疾病的基因治疗和基因预防的实验研究。几年来，在上述诸项研究中已取得较好进展。
高效、特异、安全的基因转移载体和体系的建立 以侯云德院士为首的研究组开展了“人工病毒”载体，人重组单纯疱疹病毒载体(rHSV)以及AAV病毒包装体系的研究，取得了一批成果：已申请到两项“人工病毒”载体专利，这些病毒载体能自主复制、长期表达外源基因，安全，有效。已申请3项rHSV载体专利并获国家科技进步奖，这些rHSV载体比一般载体转移效率提高50%以上。已申请4项AAV载体专利，提出了两种具有创新性的AAV载体包装策略和生产方案，使大规模生产成为可能。
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转基因动物模型和基因敲除技术的建立 刘德培院士研究组、沈FDA1教授研究组和方福德教授研究组分别采用显微注射法和基因敲除技术建立了β-珠蛋白转基因鼠、白介素-2受体α基因反义敲除技术和转肾素基因鼠，为相关的研究提供了模型。
基因治疗和基因预防的实验性研究 刘德培院士研究组采用反转录病毒(N2A)介导的基因转移方法建立了3个含红系增强子IVS Ⅱ部分缺失的β-珠蛋白基因(ΔβE292，ΔβE341，ΔβE100)的产病毒细胞系，进行了小鼠骨髓和脾中人β-珠蛋白表达观察，为β地中海贫血的基因治疗提供基础。卢圣栋教授研究组进行了肝细胞导向的促红细胞生成素(EPO)基因复合物对大鼠肾性贫血的治疗，肝细胞导向的促血小板生成素(TPO)基因复合物对卡铂诱导的大鼠血小板减少症的治疗和高血压与肾病综合征基因治疗的研究，取得了可喜的进展。方福德研究组有关化学致癌的基因预防实验研究也取得了良好结果。
基因表达调控机制的研究
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为了探讨以基因为基础的疾病控制途径和方法，必先研究特定基因在时(发育阶段)、空(组织或细胞特异性)控制下，选择性和有序地表达，以便定时、定量地在人体内有选择地表达基因产物，为第二代基因治疗提供新的思路和依据。
基因转录的调控机制研究 张俊武教授研究组研究了珠蛋白Gr基因异常持续表达的机制，发现了一种与胎儿Gr珠蛋白基因在成人期持续活跃表达相关的yunnanese(Arδβ)°——地中海贫血缺失突变体，提出了“因缺失导致的增强子类顺序接近Gr基因是突变体Gr基因在成人期获持续活跃表达的原因”的假说，并用一系列实验证明了该假说是成立的。沈FDA1教授研究组以淋巴细胞和热休克蛋白基因为对象，研究了人类基因多元调控的机制，发现在hsp90β基因第一内含子的区域中存在多个新的转录起始位点和一个热诱导特异的转录起始点，以及两个典型的热休克元件是hsp90β基因依赖于热诱导的特异增强子。第一内含子参与其组成性表达。对hsp90α基因表达的顺式调节、组织特异性及信号传导控制的研究也取得了诸多成果。
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基因表达的转录后调控研究 沈FDA1研究组发现白介素-2受体α(IL-2Rα)存在变位剪接现象，并搞清了该基因中发生变位剪接的结构基础和特点，为进一步了解IL-2Rα基因组的结构和变位剪接的机制奠定了基础。沈岩教授研究组在脆性X综合征中导致智力低下的基因FMRl的研究中，发现了该基因的多种方式变位剪接，FMRP(FMR1表达产物)能与泛素转运酶及T/G碱基错配DNA糖苷酶(TDG)同源基因的表达产物相互作用。克隆了FMRl同源基因并研究了它们的变位剪接表达。以上研究为真核基因表达的转录后调控机制提供了有价值的资料。
本项目以“分子水平的设计，细胞水平的验证，整体水平的实施”为主导思想，将基因分离、功能研究和表达调控结合起来形成整体，在合适的细胞、动物模型上进行疾病控制工程的研究，对于重大疾病的防治具有重要的科学意义。通过本项目也促进了国内有关单位的强强联合和协作，对于推动国内生物医学的整体研究水平和开辟新的局面起到了积极的作用。
方福德(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室， 北京 100005), http://www.100md.com