山莨菪碱对家兔心室肌细胞L-型钙通道的影响
陈江斌 黄从新 唐其柱 李建军 许家俐 王晋明 李庚山
摘 要 目的 研究山莨菪碱(Ani)对家兔心室肌细胞L-型钙通道的电生理作用。方法 采用全细胞膜片钳(Whole cell patch clamp)技术, 当维持电位为-40 mV，刺激频率为0.5 Hz，钳制时间为250 ms，步进电压为10 mV，去极到60 mV，观察不同浓度的Ani对L-型钙通道电流(L-ICa)的影响。结果 0.1 mmol.L-1 Ani对L-ICa无影响(P>0.05)；0.2、0.4和0.8 mmol.L-1 Ani对L-ICa的抑制为36.3%, 51.1%和72.8%(P均<0.01)，且浓度愈大,其抑制作用愈强，但都不使I-U曲线的峰值发生偏移。结论 Ani能浓度依赖性阻滞L-ICa，具有钙拮抗作用。
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关键词：山莨菪碱 L-型钙通道电流 膜片钳 心肌细胞
山莨菪碱(anisodamine, Ani)是从茄科植物唐古特山莨菪根中提取的生物碱，具有抗休克，解痉止疼等作用，已被临床广泛应用，动物实验证实它尚有显著缩小心肌梗塞范围，保护心肌功能、抗血栓形成的作用[1,2], 对豚鼠乳头肌电生理和机械效应的影响提示其有钙拮抗作用[3]，并推测其具有抗心律失常作用。本研究首次采用全细胞膜片钳(Whole cell patch clamp)技术观察Ani对离体家兔单个心室肌细胞L-型钙通道电流(L-ICa)的影响，探讨其作用机制。
1 材料与方法
1.1 家兔单个心室肌细胞分离 选用健康家兔，体重1.5～2.5 kg，猛击头部致昏, 迅速取下心脏, 悬挂于改良的Langendorff灌流装置上,先用正常台氏液灌流5 min后，换用低Ca2+(20 μmol.L-1)台氏液灌流5 min, 再换用低Ca2+含0.2 g.L-1胶原酶(I型, Sigma)的台氏液灌流5 min, 然后将Ca2+浓度升至70 μmol.L-1,继续灌流5 min，此时可见心脏比原来膨胀20%～30%左右，呈樱桃色。取下心脏，沿房室沟剪下心室肌置于硅化的小三角瓶内，剪碎心室肌，在含0.1 g.L-1蛋白酶(Sigma)的KB液中缓慢吹打孵化10 min, 最后将过滤离心后所得的心肌细胞保存在KB液中备用[4]。选择表面光洁，横纹清楚的细胞作为实验对象。
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1.2 膜片钳全细胞记录方式[4,5] 微电极采用微电极拉制器(PP-83,日本光电)双步拉制而成,将尖端抛光使其光滑, 微电极充有电极内液时阻抗1～3 kΩ，使电极尖端与细胞膜表面能形成5 GΩ的封接，给电极内加一负压吸破细胞膜形成全细胞记录。对负压吸附细胞膜所产生的电容电流予以补偿，最终形成稳定电流线。
1.3 实验记录方法 Ani的作用机制一般认为与阻滞M-胆碱受体和α-受体有关, 现已在临床广泛应用。本实验用Cs+抑制时间不依赖性的内向整流K+电流(IK1)，以消除其对L-ICa的影响[6]。当Eh大于-40 mV时，能使钠通道电流和T型钙通道电流完全失活，排除了他们对L-型钙离子电流的干扰，再将Ec去极钳到某一电位，能记录到L-ICa 。脉冲发放由Pclamp软件(美国Axon Inc,7.70版)经Compaq 586 计算机控制, 数字脉冲经数/模(D/A)转换器转换成模拟电压或电流信号, 经负反馈放大器(Pclamp/whole cell patch clamp amplifier CEZ-2300, 日本光电), 通过Ag-AgCl电极导入细胞产生的电流经放大, 模/数(A/D)转换后由Pclamp软件处理。
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1.4 溶液与药品 正常台氏液成分(mmol.L-1)：NaCl 140，KCl 5.6, CaCl2 1.8, NaH2PO4 0.25, HEPES 5, Glucose 10, 用KOH将pH调至7.3; 低Ca2+台氏液成分除CaCl2浓度为70 μmol.L-1外, 其余成分与正常台氏液成分相同。KB液成分(mmol.L-1)：KOH 70, KCl 40, KH2PO4 20, L-glutamic acid 50, taurine 20, EGTA 0.5, HEPES 10, glucose 10, 用KOH将pH调至7.4; 电极内外液组成记录L-ICa的电极内液成分(mmol.L-1)：CsCl 80，ATPNa2 5，MgCl2 2，EGTA 10，HEPES 10，用HCl将pH调至7.4。电极外液成分(mmol.L-1)：choline cholride 120，CsOH 4，CaCl2 1.8，MgCl2 2，HEPES 10，glucose 10，用KOH将pH调至7.4。其中EGTA，HEPES，L-glutamic acid，taurine，CsCl，choline cholride，CsOH均为Sigma产品，余试剂为国产分析纯，Ani，由杭州民生制药厂生产。
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1.5 数据处理 采用同一细胞用药自身前后对照，计量资料数据用X±s表示，采用t检验处理。
2 实验步骤与结果
细胞外液灌流5 min，灌流量4 ml.min-1，建立全细胞膜片钳记录，将维持电位(Holding potential, Eh)置于-40 mV, 步进电压为10 mV, 钳制时间为250 ms，控制电位(Command potential, Ec)从-30 mV至60 mV, 刺激频率为0.5 Hz, 测取对照值。观察不同浓度Ani对L-ICa的影响：用累积给药法，Ani各浓度灌流液灌流皆为5 min, 当Eh为-40 mV, Ec为10 mV时, L-ICa的峰值达最大, Ani浓度为0.1 mmol.L-1时，对L-ICa无明显影响(n=15，P>0.05)，当用0.2、0.4和0.8 mmol.L-1 Ani灌流后，L-ICa峰值由(1123.5±107.2)pA分别降至(760.77±96.9)pA、(549.35±101.39)pA和(418.52±91.39)pA，抑制率分别为36.3%(n=13, P<0.01)、51.1%(n=9,P<0.01)和72.8%(n=7,P<0.01),将Ani灌流前及0.2、0.4和0.8 mmol.L-1浓度灌流后的数据行方差分析，P<0.01。在不同的钳制电压下，不同浓度Ani灌流对L-ICa抑制的电流-电压(I-U)关系曲线见图1，从图可知，L-ICa的峰值电流在Ec为10 mV时最大, Ani不使I-U曲线峰值发生偏移。
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Fig 1 Effects of Anisodamine on L-type calcium channels
of rabbit ventricular myocardium
◆—◆：0 mol.L-1； ■—■：0.1 mol.L-1；
▲—▲：0.2 mol.L-1；×—×：0.4 mol.L-1；
●—●：0.8 mol.L-1
3 讨论
本研究用膜片钳技术直接测定Ani对单个心肌细胞膜L-型钙离子电流的影响，因非长时间连续进行刺激, 避免了“Run down" 现象的发生[7]。当Ani浓度为0.1 mmol.L-1时，其对L-ICa的影响不明显，当Ani浓度为0.2 mmol.L-1时，其对L-ICa有抑制作用，且浓度愈大，其抑制作用亦愈大，说明Ani对L-ICa 的作用有剂量依赖性。此结果给Ani有负性肌力和负性频率作用，缩短慢反应动作电位时程，并降低其幅度和0期除极最大速率的结果[3]以强有力的支持，进一步说明Ani具有钙拮抗作用。不同浓度的Ani均不使L-ICa的I-U曲线峰值发生偏移，其形态亦不发生明显改变，也不改变L-ICa的阈电位和反转电位，说明Ani对钙通道的每一个膜电位在其不同浓度时均发生成比例的、同样数量的阻滞[8]。根据受体调节学说(Modulated receptor)推测Ani对静息态的慢钙通道(或与慢钙通道相邻的受体蛋白)的亲和力较低，而与激活态和/或失活态的慢钙通道亲和力则较高。随着Ani浓度的增加，慢钙通道内可与作用位点接近的Ani量增多，失活态慢钙通道相对增多，Ani结合慢钙通道的几率增加，故对通过慢钙通道离子流的抑制增大[9,10]。Ani是否尚作用于受体依赖性钙通道，有待于进一步研究。
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作者简介：陈江斌，男，32岁，硕士；
黄从新，男，48岁，教授，博士生导师
陈江斌(湖北医科大学附属第一医院心血管病研究室，武汉 430060)
黄从新(湖北医科大学附属第一医院心血管病研究室，武汉 430060)
唐其柱(湖北医科大学附属第一医院心血管病研究室，武汉 430060)
李建军(湖北医科大学附属第一医院心血管病研究室，武汉 430060)
许家俐(湖北医科大学附属第一医院心血管病研究室，武汉 430060)
王晋明(湖北医科大学附属第一医院心血管病研究室，武汉 430060)
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李庚山(湖北医科大学附属第一医院心血管病研究室，武汉 430060)
参考文献
1.姚秀娟，谭月华，许自超. 山莨菪碱对心肌缺血再灌注损伤的作用与脂质过氧化.中国药理学报，1995;16(2):152～4
2.杨 苹，张宝恒，洪 霓. 山莨菪碱抗心律失常及对植物神经系统的影响. 中国药理学报， 1991;12(2):173～6
3.任东序，可 君，翁世艾. 莨菪类药物对豚鼠乳头状肌电生理和机械效应的影响. 中国药理学报，1987;8(2):131～5
4.Kazuto Y, Muneshige K, Masashiro O et al. An improved method for isolating cardiac myocytes useful for patch clamp studies.Japa J Physiol,1990；40:157～61
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5.Homitl OP, Marty A, Neher E et al. Improved patch clamp techniques for high resolution current recording from cells and cell free membrane patches. Pflugers Arch,1981；391:85～94
6.陈江斌，李庚山, 许家俐，蒋锡嘉.碘杂环化合物IHC-72对心肌细胞慢钙通道的电压和频率依赖性阻滞效应.湖北医科大学学报，1998;19(2)：126～9
7.Belles B, Malot CO, Hescheler J et al. “Rundown” of the Ca2+ current during long whole-cell recordings in guinea pig heart cells: rale of phosnhorylation and intacellular calcium. Pflugers Arch, 1988;411:353～9
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8.Scanchez-Chapula J. Voltage-and use-dependent effects of lidocaine onsodium current in rat single ventricular cell. Circ Res, 1983;52:557～60
9.Liu QY, Karpinski E, Pang PKT. Tetrandrine inhibits both T and L calcium channel currents inventricular cells. J Cardiovasc Pharmacol, 1992;20:513～8
10.Takeda Y. Voltage-dependence of Ca2+ agonist effect of YC-170 on calcium L-type Ca2+ channels. Br J Pharmacol, 1995;116:2134～41, http://www.100md.com
摘 要 目的 研究山莨菪碱(Ani)对家兔心室肌细胞L-型钙通道的电生理作用。方法 采用全细胞膜片钳(Whole cell patch clamp)技术, 当维持电位为-40 mV，刺激频率为0.5 Hz，钳制时间为250 ms，步进电压为10 mV，去极到60 mV，观察不同浓度的Ani对L-型钙通道电流(L-ICa)的影响。结果 0.1 mmol.L-1 Ani对L-ICa无影响(P>0.05)；0.2、0.4和0.8 mmol.L-1 Ani对L-ICa的抑制为36.3%, 51.1%和72.8%(P均<0.01)，且浓度愈大,其抑制作用愈强，但都不使I-U曲线的峰值发生偏移。结论 Ani能浓度依赖性阻滞L-ICa，具有钙拮抗作用。
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关键词：山莨菪碱 L-型钙通道电流 膜片钳 心肌细胞
山莨菪碱(anisodamine, Ani)是从茄科植物唐古特山莨菪根中提取的生物碱，具有抗休克，解痉止疼等作用，已被临床广泛应用，动物实验证实它尚有显著缩小心肌梗塞范围，保护心肌功能、抗血栓形成的作用[1,2], 对豚鼠乳头肌电生理和机械效应的影响提示其有钙拮抗作用[3]，并推测其具有抗心律失常作用。本研究首次采用全细胞膜片钳(Whole cell patch clamp)技术观察Ani对离体家兔单个心室肌细胞L-型钙通道电流(L-ICa)的影响，探讨其作用机制。
1 材料与方法
1.1 家兔单个心室肌细胞分离 选用健康家兔，体重1.5～2.5 kg，猛击头部致昏, 迅速取下心脏, 悬挂于改良的Langendorff灌流装置上,先用正常台氏液灌流5 min后，换用低Ca2+(20 μmol.L-1)台氏液灌流5 min, 再换用低Ca2+含0.2 g.L-1胶原酶(I型, Sigma)的台氏液灌流5 min, 然后将Ca2+浓度升至70 μmol.L-1,继续灌流5 min，此时可见心脏比原来膨胀20%～30%左右，呈樱桃色。取下心脏，沿房室沟剪下心室肌置于硅化的小三角瓶内，剪碎心室肌，在含0.1 g.L-1蛋白酶(Sigma)的KB液中缓慢吹打孵化10 min, 最后将过滤离心后所得的心肌细胞保存在KB液中备用[4]。选择表面光洁，横纹清楚的细胞作为实验对象。
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1.2 膜片钳全细胞记录方式[4,5] 微电极采用微电极拉制器(PP-83,日本光电)双步拉制而成,将尖端抛光使其光滑, 微电极充有电极内液时阻抗1～3 kΩ，使电极尖端与细胞膜表面能形成5 GΩ的封接，给电极内加一负压吸破细胞膜形成全细胞记录。对负压吸附细胞膜所产生的电容电流予以补偿，最终形成稳定电流线。
1.3 实验记录方法 Ani的作用机制一般认为与阻滞M-胆碱受体和α-受体有关, 现已在临床广泛应用。本实验用Cs+抑制时间不依赖性的内向整流K+电流(IK1)，以消除其对L-ICa的影响[6]。当Eh大于-40 mV时，能使钠通道电流和T型钙通道电流完全失活，排除了他们对L-型钙离子电流的干扰，再将Ec去极钳到某一电位，能记录到L-ICa 。脉冲发放由Pclamp软件(美国Axon Inc,7.70版)经Compaq 586 计算机控制, 数字脉冲经数/模(D/A)转换器转换成模拟电压或电流信号, 经负反馈放大器(Pclamp/whole cell patch clamp amplifier CEZ-2300, 日本光电), 通过Ag-AgCl电极导入细胞产生的电流经放大, 模/数(A/D)转换后由Pclamp软件处理。
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1.4 溶液与药品 正常台氏液成分(mmol.L-1)：NaCl 140，KCl 5.6, CaCl2 1.8, NaH2PO4 0.25, HEPES 5, Glucose 10, 用KOH将pH调至7.3; 低Ca2+台氏液成分除CaCl2浓度为70 μmol.L-1外, 其余成分与正常台氏液成分相同。KB液成分(mmol.L-1)：KOH 70, KCl 40, KH2PO4 20, L-glutamic acid 50, taurine 20, EGTA 0.5, HEPES 10, glucose 10, 用KOH将pH调至7.4; 电极内外液组成记录L-ICa的电极内液成分(mmol.L-1)：CsCl 80，ATPNa2 5，MgCl2 2，EGTA 10，HEPES 10，用HCl将pH调至7.4。电极外液成分(mmol.L-1)：choline cholride 120，CsOH 4，CaCl2 1.8，MgCl2 2，HEPES 10，glucose 10，用KOH将pH调至7.4。其中EGTA，HEPES，L-glutamic acid，taurine，CsCl，choline cholride，CsOH均为Sigma产品，余试剂为国产分析纯，Ani，由杭州民生制药厂生产。
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1.5 数据处理 采用同一细胞用药自身前后对照，计量资料数据用X±s表示，采用t检验处理。
2 实验步骤与结果
细胞外液灌流5 min，灌流量4 ml.min-1，建立全细胞膜片钳记录，将维持电位(Holding potential, Eh)置于-40 mV, 步进电压为10 mV, 钳制时间为250 ms，控制电位(Command potential, Ec)从-30 mV至60 mV, 刺激频率为0.5 Hz, 测取对照值。观察不同浓度Ani对L-ICa的影响：用累积给药法，Ani各浓度灌流液灌流皆为5 min, 当Eh为-40 mV, Ec为10 mV时, L-ICa的峰值达最大, Ani浓度为0.1 mmol.L-1时，对L-ICa无明显影响(n=15，P>0.05)，当用0.2、0.4和0.8 mmol.L-1 Ani灌流后，L-ICa峰值由(1123.5±107.2)pA分别降至(760.77±96.9)pA、(549.35±101.39)pA和(418.52±91.39)pA，抑制率分别为36.3%(n=13, P<0.01)、51.1%(n=9,P<0.01)和72.8%(n=7,P<0.01),将Ani灌流前及0.2、0.4和0.8 mmol.L-1浓度灌流后的数据行方差分析，P<0.01。在不同的钳制电压下，不同浓度Ani灌流对L-ICa抑制的电流-电压(I-U)关系曲线见图1，从图可知，L-ICa的峰值电流在Ec为10 mV时最大, Ani不使I-U曲线峰值发生偏移。
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Fig 1 Effects of Anisodamine on L-type calcium channels
of rabbit ventricular myocardium
◆—◆：0 mol.L-1； ■—■：0.1 mol.L-1；
▲—▲：0.2 mol.L-1；×—×：0.4 mol.L-1；
●—●：0.8 mol.L-1
3 讨论
本研究用膜片钳技术直接测定Ani对单个心肌细胞膜L-型钙离子电流的影响，因非长时间连续进行刺激, 避免了“Run down" 现象的发生[7]。当Ani浓度为0.1 mmol.L-1时，其对L-ICa的影响不明显，当Ani浓度为0.2 mmol.L-1时，其对L-ICa有抑制作用，且浓度愈大，其抑制作用亦愈大，说明Ani对L-ICa 的作用有剂量依赖性。此结果给Ani有负性肌力和负性频率作用，缩短慢反应动作电位时程，并降低其幅度和0期除极最大速率的结果[3]以强有力的支持，进一步说明Ani具有钙拮抗作用。不同浓度的Ani均不使L-ICa的I-U曲线峰值发生偏移，其形态亦不发生明显改变，也不改变L-ICa的阈电位和反转电位，说明Ani对钙通道的每一个膜电位在其不同浓度时均发生成比例的、同样数量的阻滞[8]。根据受体调节学说(Modulated receptor)推测Ani对静息态的慢钙通道(或与慢钙通道相邻的受体蛋白)的亲和力较低，而与激活态和/或失活态的慢钙通道亲和力则较高。随着Ani浓度的增加，慢钙通道内可与作用位点接近的Ani量增多，失活态慢钙通道相对增多，Ani结合慢钙通道的几率增加，故对通过慢钙通道离子流的抑制增大[9,10]。Ani是否尚作用于受体依赖性钙通道，有待于进一步研究。
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作者简介：陈江斌，男，32岁，硕士；
黄从新，男，48岁，教授，博士生导师
陈江斌(湖北医科大学附属第一医院心血管病研究室，武汉 430060)
黄从新(湖北医科大学附属第一医院心血管病研究室，武汉 430060)
唐其柱(湖北医科大学附属第一医院心血管病研究室，武汉 430060)
李建军(湖北医科大学附属第一医院心血管病研究室，武汉 430060)
许家俐(湖北医科大学附属第一医院心血管病研究室，武汉 430060)
王晋明(湖北医科大学附属第一医院心血管病研究室，武汉 430060)
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参考文献
1.姚秀娟，谭月华，许自超. 山莨菪碱对心肌缺血再灌注损伤的作用与脂质过氧化.中国药理学报，1995;16(2):152～4
2.杨 苹，张宝恒，洪 霓. 山莨菪碱抗心律失常及对植物神经系统的影响. 中国药理学报， 1991;12(2):173～6
3.任东序，可 君，翁世艾. 莨菪类药物对豚鼠乳头状肌电生理和机械效应的影响. 中国药理学报，1987;8(2):131～5
4.Kazuto Y, Muneshige K, Masashiro O et al. An improved method for isolating cardiac myocytes useful for patch clamp studies.Japa J Physiol,1990；40:157～61
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6.陈江斌，李庚山, 许家俐，蒋锡嘉.碘杂环化合物IHC-72对心肌细胞慢钙通道的电压和频率依赖性阻滞效应.湖北医科大学学报，1998;19(2)：126～9
7.Belles B, Malot CO, Hescheler J et al. “Rundown” of the Ca2+ current during long whole-cell recordings in guinea pig heart cells: rale of phosnhorylation and intacellular calcium. Pflugers Arch, 1988;411:353～9
, 百拇医药
8.Scanchez-Chapula J. Voltage-and use-dependent effects of lidocaine onsodium current in rat single ventricular cell. Circ Res, 1983;52:557～60
9.Liu QY, Karpinski E, Pang PKT. Tetrandrine inhibits both T and L calcium channel currents inventricular cells. J Cardiovasc Pharmacol, 1992;20:513～8
10.Takeda Y. Voltage-dependence of Ca2+ agonist effect of YC-170 on calcium L-type Ca2+ channels. Br J Pharmacol, 1995;116:2134～41, http://www.100md.com