系统性红斑狼疮患者外周血淋巴细胞增殖功能及其产生白细胞介素2的研究
高世明 徐星铭 魏伟 张运芳 徐叔云
摘 要 目的 研究系统性红斑狼疮(SLE)患者外周淋巴细胞(PBL)增殖反应及其产生白细胞介素2(IL-2)的情况。方法 淋巴细胞增殖法及IL-2检测法。结果 SLE患者PBL的增殖反应明显高于正常人，但SLE患者PBL产生IL-2的能力明显低于正常人。结论 SLE患者PBL增殖反应提高和其产生IL-2能力降低可能与T细胞两亚群TH1/TH2的失衡有关。
关键词：系统性红斑狼疮 外周血淋巴细胞 增殖 白细胞介素2
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一累及多个系统，病程迁延反复的自身免疫性疾病，多年来，关于其病理机制和药物治疗方案一直是研究的热点，取得了一定进展，尤其在SLE的免疫病理机制方面有些新的认识，CD+4 T细胞起着重要调节作用，T细胞通过旁路激活途径辅助B细胞多克隆激活，引起多种自身抗体的产生。TH细胞的两个亚群TH1和TH2可能分别与细胞免疫反应和抗体生成有关，TH1/TH2的平衡对自身免疫病的发生、发展及预后起重要作用[1，2]，动物实验已经证实T淋巴细胞增殖能力增强，而白细胞介素2(interleukin 2,IL-2)水平降低，提示与TH1/TH2比值失衡有关〔3〕。然而人SLE患者外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBL)增殖能力及其产生IL-2的能力报道不一。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 人PBL的制备 无菌取静脉血放入肝素抗凝管中。取10 ml离心管，预先加入2.5 ml淋巴细胞分离液，用滴管吸取抗凝血2 ml，离分层液约1 cm处，沿管壁缓慢加入。离心400×g，20 min，吸弃血浆层至淋巴细胞层0.5 cm处，将淋巴细胞和少许分离液一起移入10 ml离心管中，加入5倍体积pH 7.2无钙、镁Hanks液中混匀，以760×g离心10 min，弃上清再反复洗2次，计数后用于实验。
1.1.2 动物 BALB/c小鼠，♂，体重18～22 g，由安徽医科大学实验动物中心提供。
1.1.3 主要仪器与设备 Napco-6100 CO2培养箱，美国杜邦公司；FJ-2107型液体闪烁计数仪，西安262厂；XSZ倒置显微镜，重庆光学仪器厂；YJ-1450型医用净化工作台，苏州净化设备公司；TGL-16c台式高速离心机，上海安亭科学仪器厂；GL20A全自动高速冷冻离心机，湖南仪器仪表总厂离心机厂；EL301 Strip reader(酶标仪)，美国Bio-Tek公司。
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1.1.4 试剂与药物 RPMI 1640培养粉：美国Gibco公司产品，完全RPMI 1640培养液加25 mmol.L-1 Hepes,1 mmol.L-1丙酮酸钠，2 mmol.L-1谷氨酰胺，50 μmol.L-1二巯基乙醇，1×105 IU*L-1青霉素G，100 mg.L-1链霉素，10%(体积分数)小牛血清，pH为7.4。植物血凝素(phytohemmaglutinin,PHA)：美国Serva公司产品。刀豆蛋白A(concanavalin A，ConA)：美国Sigma公司产品。四甲基偶氮唑盐(MTT)：美国Sigma公司产品，用含5 g.L-1葡萄糖的磷酸缓冲液(0.02 mol.L-1 pH 7.2)配成5 g.L-1使用液，4℃冰箱避光保存。
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1.2 方法[4]
1.2.1 人PBL增殖反应[2] 常规制备人PBL悬液，用完全RPMI 1640培养液调成1×1010*L-1。于96孔培养板中每孔加入细胞悬液100 μl，4 mg.L-1 PHA 100 μl，置0.05 CO2、37℃培养48 h。于每孔加入5 g.L-1的MTT液100 μl，于振荡器上振荡1 min，再放入0.05 CO2、37℃培养箱中继续培养2 h。培养结束后以760×g离心10 min，吸弃上清后每孔加入酸化异丙醇120 μl，于振荡器上振荡30 s，在酶标仪上于570 nm波长处读每孔吸光度(absorbance,A)，结果以其A的均值表示。
1.2.2 IL-2的诱生与检测
, 百拇医药
1.2.2.1 人PBL IL-2的诱生 配制PBL悬液(1×1010*L-1)，于24 孔培养板每孔加入0.8 ml RPMI 1640完全培养液、0.1 ml PBL悬液和0.1 ml PHA(终浓度为4 mg.L-1)，于0.05 CO2培养箱37℃培养48 h，离心(500×g,10 min)收集上清液，放入-20℃冰箱保存待测。
1.2.2.2 上清中IL-2检测 BALB/c小鼠处死，无菌下取胸腺制成2×109*L-1单个细胞悬液，加入3 mg.L-1 Con A于0.05 CO2 37℃培养箱中培养4 d，用体积分数为5%小牛血清Hanks液洗3次，用RPMI 1640完全培养液制成1×109*L-1活化小鼠胸腺细胞悬液。用培养液稀释上清，于96孔培养板中每孔加入0.1 ml胸腺细胞悬液和0.1 ml含Con A(3 mg.L-1)的待测上清，0.05 CO2 37℃培养箱培养24 h，同前以MTT法测A值。
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1.3 统计分析 本文数据以X±s表示，以组间t检验进行统计处理。
2 结果
2.1 正常人和SLE患者PBL增殖反应 表1结果表明，SLE患者PBL的增殖反应明显高于正常人PBL的增殖反应。
Tab 1 Proliferation of PBL from patients with SLE(X±s)
Group
n
PBL proliferation/A
Human
5
, 百拇医药 0.283±0.018
SLE patients
5
0.496±0.013**
**P<0.01 vs humans
2.2 正常人和SLE患者PBL产生IL-2能力 表2结果表明，SLE患者PBL产生IL-2能力明显低于正常人PBL。
Tab 2 IL-12 production of PBL from patient with SLE(X±s)
Group
n
, 百拇医药
IL-2/A
Humans
5
0.294±0.010
SLE patients
5
0.020±0.003**
**P<0.01 vs humans
3 讨论
动物实验表明，CD+4 T细胞在SLE中起重要作用，它的两个亚群产生不同的细胞因子，TH1细胞产生IL-2和γ干扰素(INF-γ)，与细胞免疫反应有关且辅助B细胞产生某些同型免疫球蛋白；TH2细胞产生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13，与辅助B细胞的功能有关[5]。近年来，用抗IL-14、IL-10抗体治疗SLE动物模型有改善症状的作用[6]，细胞因子参与SLE病理机制的作用值得重视。
, 百拇医药
本研究为SLE免疫病理机制及其药物作用研究的一部分内容，利用SLE患者PBL初步探讨了T淋巴细胞增殖及其产生IL-2的能力，结果表明，SLE患者PBL的增殖反应增强而产生IL-2的能力降低，此与自发性动物模型中的免疫改变相近[7]，可能与TH1/TH2比值失衡有关[3]，值得深入探讨。
作者简介：高世明，男，主任医师，安徽医科大学附属医院院长；
魏伟，男，教授，博士生导师，安徽医科大学临床药理研究所副所长(联系人)
高世明(安徽医科大学附属医院，合肥 230032)
徐星铭(安徽医科大学附属医院，合肥 230032)
, http://www.100md.com 张运芳(安徽医科大学附属医院，合肥 230032)
魏伟(安徽医科大学临床药理研究所，合肥 230032)
徐叔云(安徽医科大学临床药理研究所，合肥 230032)
参考文献
1.Mosmann TR， Sad S. The expanding universe of T cell subsets:TH1、TH2 and more. Immunol Today,1996;17:138～43
2.Liblau RS,Singer SM, McDevitt HO.TH1and TH2 CD+4 T cells in the pathogenesis of organ specific autoimmune diseases. Immunol Today,1995;16:3439～46
, http://www.100md.com
3.Ishikawa S, Akakura S, Abe M et al. A subset of CD+4 T cells expressing early activation antigen CD69 in murine lupus:possible abnormal regulatory role for cytokine imblance. J Immunol,1998;157:1267～73
4.陈敏珠，魏 伟，张 泓 et al.免疫抑制药和增强药实验法.见：徐叔云，卞如濂，陈 修主编.药理实验方法学，第2版，北京：人民卫生出版社，1991：1208～45
5.Murray LJ, Lee R, Martens C. In vivo cytokine gene expression in T cell subsets of the autoimmune MRL/MP-lpr/lpr mouse. Eur J Immunol,1990;20:163～70
6.马安伦，张冬青，王树军 et al.IL-14 R在SLE患者B细胞的表达及特异性抗体对其增殖的调节作用.上海免疫学杂志，1997；17：78～80
7.Altman A, Theofilopoulos AN, Weiner R et al. Analysis of T cell function in autoimmune murine strain:defects in production and responsiveness to interleukin 2. J Exp Med,1981;154:791～802, 百拇医药
摘 要 目的 研究系统性红斑狼疮(SLE)患者外周淋巴细胞(PBL)增殖反应及其产生白细胞介素2(IL-2)的情况。方法 淋巴细胞增殖法及IL-2检测法。结果 SLE患者PBL的增殖反应明显高于正常人，但SLE患者PBL产生IL-2的能力明显低于正常人。结论 SLE患者PBL增殖反应提高和其产生IL-2能力降低可能与T细胞两亚群TH1/TH2的失衡有关。
关键词：系统性红斑狼疮 外周血淋巴细胞 增殖 白细胞介素2
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一累及多个系统，病程迁延反复的自身免疫性疾病，多年来，关于其病理机制和药物治疗方案一直是研究的热点，取得了一定进展，尤其在SLE的免疫病理机制方面有些新的认识，CD+4 T细胞起着重要调节作用，T细胞通过旁路激活途径辅助B细胞多克隆激活，引起多种自身抗体的产生。TH细胞的两个亚群TH1和TH2可能分别与细胞免疫反应和抗体生成有关，TH1/TH2的平衡对自身免疫病的发生、发展及预后起重要作用[1，2]，动物实验已经证实T淋巴细胞增殖能力增强，而白细胞介素2(interleukin 2,IL-2)水平降低，提示与TH1/TH2比值失衡有关〔3〕。然而人SLE患者外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBL)增殖能力及其产生IL-2的能力报道不一。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 人PBL的制备 无菌取静脉血放入肝素抗凝管中。取10 ml离心管，预先加入2.5 ml淋巴细胞分离液，用滴管吸取抗凝血2 ml，离分层液约1 cm处，沿管壁缓慢加入。离心400×g，20 min，吸弃血浆层至淋巴细胞层0.5 cm处，将淋巴细胞和少许分离液一起移入10 ml离心管中，加入5倍体积pH 7.2无钙、镁Hanks液中混匀，以760×g离心10 min，弃上清再反复洗2次，计数后用于实验。
1.1.2 动物 BALB/c小鼠，♂，体重18～22 g，由安徽医科大学实验动物中心提供。
1.1.3 主要仪器与设备 Napco-6100 CO2培养箱，美国杜邦公司；FJ-2107型液体闪烁计数仪，西安262厂；XSZ倒置显微镜，重庆光学仪器厂；YJ-1450型医用净化工作台，苏州净化设备公司；TGL-16c台式高速离心机，上海安亭科学仪器厂；GL20A全自动高速冷冻离心机，湖南仪器仪表总厂离心机厂；EL301 Strip reader(酶标仪)，美国Bio-Tek公司。
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1.1.4 试剂与药物 RPMI 1640培养粉：美国Gibco公司产品，完全RPMI 1640培养液加25 mmol.L-1 Hepes,1 mmol.L-1丙酮酸钠，2 mmol.L-1谷氨酰胺，50 μmol.L-1二巯基乙醇，1×105 IU*L-1青霉素G，100 mg.L-1链霉素，10%(体积分数)小牛血清，pH为7.4。植物血凝素(phytohemmaglutinin,PHA)：美国Serva公司产品。刀豆蛋白A(concanavalin A，ConA)：美国Sigma公司产品。四甲基偶氮唑盐(MTT)：美国Sigma公司产品，用含5 g.L-1葡萄糖的磷酸缓冲液(0.02 mol.L-1 pH 7.2)配成5 g.L-1使用液，4℃冰箱避光保存。
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1.2 方法[4]
1.2.1 人PBL增殖反应[2] 常规制备人PBL悬液，用完全RPMI 1640培养液调成1×1010*L-1。于96孔培养板中每孔加入细胞悬液100 μl，4 mg.L-1 PHA 100 μl，置0.05 CO2、37℃培养48 h。于每孔加入5 g.L-1的MTT液100 μl，于振荡器上振荡1 min，再放入0.05 CO2、37℃培养箱中继续培养2 h。培养结束后以760×g离心10 min，吸弃上清后每孔加入酸化异丙醇120 μl，于振荡器上振荡30 s，在酶标仪上于570 nm波长处读每孔吸光度(absorbance,A)，结果以其A的均值表示。
1.2.2 IL-2的诱生与检测
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1.2.2.1 人PBL IL-2的诱生 配制PBL悬液(1×1010*L-1)，于24 孔培养板每孔加入0.8 ml RPMI 1640完全培养液、0.1 ml PBL悬液和0.1 ml PHA(终浓度为4 mg.L-1)，于0.05 CO2培养箱37℃培养48 h，离心(500×g,10 min)收集上清液，放入-20℃冰箱保存待测。
1.2.2.2 上清中IL-2检测 BALB/c小鼠处死，无菌下取胸腺制成2×109*L-1单个细胞悬液，加入3 mg.L-1 Con A于0.05 CO2 37℃培养箱中培养4 d，用体积分数为5%小牛血清Hanks液洗3次，用RPMI 1640完全培养液制成1×109*L-1活化小鼠胸腺细胞悬液。用培养液稀释上清，于96孔培养板中每孔加入0.1 ml胸腺细胞悬液和0.1 ml含Con A(3 mg.L-1)的待测上清，0.05 CO2 37℃培养箱培养24 h，同前以MTT法测A值。
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1.3 统计分析 本文数据以X±s表示，以组间t检验进行统计处理。
2 结果
2.1 正常人和SLE患者PBL增殖反应 表1结果表明，SLE患者PBL的增殖反应明显高于正常人PBL的增殖反应。
Tab 1 Proliferation of PBL from patients with SLE(X±s)
Group
n
PBL proliferation/A
Human
5
, 百拇医药 0.283±0.018
SLE patients
5
0.496±0.013**
**P<0.01 vs humans
2.2 正常人和SLE患者PBL产生IL-2能力 表2结果表明，SLE患者PBL产生IL-2能力明显低于正常人PBL。
Tab 2 IL-12 production of PBL from patient with SLE(X±s)
Group
n
, 百拇医药
IL-2/A
Humans
5
0.294±0.010
SLE patients
5
0.020±0.003**
**P<0.01 vs humans
3 讨论
动物实验表明，CD+4 T细胞在SLE中起重要作用，它的两个亚群产生不同的细胞因子，TH1细胞产生IL-2和γ干扰素(INF-γ)，与细胞免疫反应有关且辅助B细胞产生某些同型免疫球蛋白；TH2细胞产生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13，与辅助B细胞的功能有关[5]。近年来，用抗IL-14、IL-10抗体治疗SLE动物模型有改善症状的作用[6]，细胞因子参与SLE病理机制的作用值得重视。
, 百拇医药
本研究为SLE免疫病理机制及其药物作用研究的一部分内容，利用SLE患者PBL初步探讨了T淋巴细胞增殖及其产生IL-2的能力，结果表明，SLE患者PBL的增殖反应增强而产生IL-2的能力降低，此与自发性动物模型中的免疫改变相近[7]，可能与TH1/TH2比值失衡有关[3]，值得深入探讨。
作者简介：高世明，男，主任医师，安徽医科大学附属医院院长；
魏伟，男，教授，博士生导师，安徽医科大学临床药理研究所副所长(联系人)
高世明(安徽医科大学附属医院，合肥 230032)
徐星铭(安徽医科大学附属医院，合肥 230032)
, http://www.100md.com 张运芳(安徽医科大学附属医院，合肥 230032)
魏伟(安徽医科大学临床药理研究所，合肥 230032)
徐叔云(安徽医科大学临床药理研究所，合肥 230032)
参考文献
1.Mosmann TR， Sad S. The expanding universe of T cell subsets:TH1、TH2 and more. Immunol Today,1996;17:138～43
2.Liblau RS,Singer SM, McDevitt HO.TH1and TH2 CD+4 T cells in the pathogenesis of organ specific autoimmune diseases. Immunol Today,1995;16:3439～46
, http://www.100md.com
3.Ishikawa S, Akakura S, Abe M et al. A subset of CD+4 T cells expressing early activation antigen CD69 in murine lupus:possible abnormal regulatory role for cytokine imblance. J Immunol,1998;157:1267～73
4.陈敏珠，魏 伟，张 泓 et al.免疫抑制药和增强药实验法.见：徐叔云，卞如濂，陈 修主编.药理实验方法学，第2版，北京：人民卫生出版社，1991：1208～45
5.Murray LJ, Lee R, Martens C. In vivo cytokine gene expression in T cell subsets of the autoimmune MRL/MP-lpr/lpr mouse. Eur J Immunol,1990;20:163～70
6.马安伦，张冬青，王树军 et al.IL-14 R在SLE患者B细胞的表达及特异性抗体对其增殖的调节作用.上海免疫学杂志，1997；17：78～80
7.Altman A, Theofilopoulos AN, Weiner R et al. Analysis of T cell function in autoimmune murine strain:defects in production and responsiveness to interleukin 2. J Exp Med,1981;154:791～802, 百拇医药