小肠三叶因子对盐酸诱导的大鼠胃溃疡的预防和治疗作用
口如琴 王蔚 李令媛 茹炳根
摘要 目的 探讨克隆表达的rh-ITF在模拟胃肠道条件下的稳定性和抗胃溃疡的作用机制。方法 采用质谱法及盐酸诱导的大鼠胃溃疡模型，测定rh-ITF在模拟胃肠道条件下的结构稳定性和大鼠腺胃粘膜损伤级别，损伤指数及胃酸度，胃蛋白酶活性及胃排空能力。结果 酸对rh-ITF相对分子量没有影响，胃蛋白酶仅从N端切除6个氨基酸残基。 rh-ITF可明显降低大鼠腺胃粘膜损伤级别和损伤指数，但对胃酸分泌，胃蛋白酶活性及胃排空能力没有影响。结论 rh-ITF在体外对酸和胃蛋白酶有一定的抗性，其对胃溃疡的治疗和预防作用不是通过降低攻击因子(酸和蛋白酶)和影响胃的自主运动实现的。
关键词：小肠三叶因子 胃溃疡 治疗和预防 稳定性
, 百拇医药
小肠三叶因子(intestinal trefoil factor, ITF)是新近发现的三叶因子家族(trefoil factor family, TFF)中的一个主要因子[1]，国外报道[2]口服和皮下注射pSP和ITF能有效预防和治疗吲哚美辛及无水乙醇诱导的大鼠胃溃疡，但其剂量很大。本文报道表达的rh-ITF在模拟胃肠道条件下的结构稳定性和低剂量尾静脉注射rh-ITF对盐酸诱导的大鼠胃溃疡的预防和治疗作用。
1 材料与方法
1.1 rh-ITF 为酵母表达纯化后的产物(本实验室提供，98%以上纯度)。质谱鉴定其二聚体和单体比例为87∶13[9]。
1.2 盐酸诱导的大鼠胃溃疡模型的建立 Wistar大鼠,体重100～150 g, 禁食24 h, 自由饮水，置于有网眼的铁丝笼，以防止自食粪便。预防组先每只尾静脉注射200 μg, 500 μg, 1 000 μg rh-ITF，30 min后灌胃1 ml 0.6 mol.L-1 HCl, 5 h后断颈处死。治疗组先灌胃1 ml 0.6 mol.L-1 HCl, 30 min后每只尾静脉注射200 μg，500 μg, 1 000 μg rh-ITF，5 h后断颈处死。对照组以相同体积的生理盐水代替rh-ITF。
, 百拇医药
1.3 溃疡级别及损伤指数的确定 将大鼠胃沿胃大弯剪开，仔细测量胃粘膜损伤数量，按文献[3，4]评定损伤指数。完整胃粘膜为0级，点状出血直径≥1 mm,1～5点为Ⅰ级，6～10点为Ⅱ级，10点以上为Ⅲ级，条状出血1～5条为Ⅳ级，6～10条为Ⅴ级，10条以上为Ⅵ级，以全胃各病灶长度之和作为损伤指数，以mm表示。
1.4 胃酸分析 收集大鼠胃液，用精密pH试纸测量其pH值，并用标准NaOH液滴定，酚红为指示剂，测定游离酸量。
1.5 胃蛋白酶活性测定 按文献[5]，以在pH 1.15时，室温下每分钟水解血红蛋白产生40 μg酪氨酸所需酶量定义为一个单位(U)。
1.6 大鼠胃排空实验 按文献[6]。Wistar大鼠100～150 g, 禁食24 h, 实验组和对照组分别每只尾静脉注射200 μg，500 μg, 1 000 μg rh-ITF和生理盐水，30 min后灌胃1 ml含有酚红的淀粉，30 min后断颈处死。取出胃，用剪刀剪碎，加入2 ml 0.6 mol.L-1 HCl振荡，离心，取上清560 nm比色，计算实验组和对照组大鼠胃内酚红的相对含量。
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1.7 组织病理学检测 将实验组和对照组大鼠胃于中性甲醛中固定，石腊包埋，切片，HE染色，镜检。
1.8 统计处理 实验数据以X±s表示，组间差异显著性检验采用双相t检验法。
2 结果
2.1 胃粘膜损伤级别及损伤指数 正常大鼠胃粘膜光滑无充血水肿，无溃疡出血灶。盐酸诱导的大鼠胃粘膜损伤，腺胃充血水肿，有明显出血点及点状、条索状溃疡灶或坏死灶。尾静脉注射rh-ITF组大鼠腺胃粘膜损伤级别下降，损伤指数明显降低(见图1、图2,P<0.05及P<0.01)。
2.2 胃酸度，胃蛋白酶活性及胃排空实验 尾静脉注射rh-ITF对大鼠胃酸度，胃液胃蛋白酶活性及胃排空无显著影响(P>0.05),结果见表1。
2.3 组织病理学检测结果 对照组及实验组溃疡最严重部位切片见图3。图3表明对照组溃疡严重，胃粘膜已经严重破坏，胃粘膜下肌层暴露，为多发性溃疡。实验组胃粘膜破坏程度较轻，固有层较完整。
, 百拇医药
Fig 1 Ulcer grades of control, precaution and therapy groups
.P<0.05 vs control;##P<0.01 vs control；control group:n=12,precaution group:n=12;therapy group:n=7
Fig 2 Ulcer indexes of control, precaution and therapy groups
.P<0.05 vs control;##P<0.01 vs control; control group: n=15; precaution group: n=12; therapy groups: n=7
, 百拇医药
Fig 3 Cut section of gastric tissue for microscopic examination
A: normal rat； B: control group； C: precaution group； D: therapy group
Fig 4 MALDITOF-MS of rh-ITF
a: pure sample of rh-ITF；b: rh-ITF after acid treatment；c: rh-ITF after treatment by pepsin
Tab 1 Gastric acidity, pepsin activity of gastric liquid and ability
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of gastric excretion of experimental and control group, respectively
Group
Gastric acidity
/mol.L-1
pH
pepsin activity
/kU.L-1
gastric excretion
(OD560 nm)
, 百拇医药
control(n=30)
0.027±0.003
1.5～2.0
2600±432
0.978±0.290
precaution(n=24)
0.026±0.006
1.5～2.0
2671±159
0.976±0.300
theratic(n=14)
, 百拇医药
0.028±0.004
1.5～2.0
2633±256
0.947±0.600
2.4 rh-ITF在模拟胃肠道环境中的稳定性 rh-ITF分别于0.6 mol.L-1 HCl及胃蛋白酶最适pH下37℃作用3 h, 经MALDITOF-MS测定，rh-ITF纯品二聚体和单体相对分子量分别为13153.9和6580.7，按峰面积计算，二聚体占87%，单体占13%。酸作用后rh-ITF相对分子量没有改变，但二聚体的含量下降为81%，单体的含量上升为19%。rh-ITF对胃蛋白酶的作用有一定的抗性，经胃蛋白酶作用后，呈现为两个峰，峰1为单体，相对分子量5888.0，峰2为二聚体,相对分子量11771.6。与未作用的rh-ITF相比，单体相对分子量减少了692.7，根据cDNA推出的rh-ITF的N端蛋白序列EEYVGLSANQQ与各种氨基酸残基的相对分子量推测，胃蛋白酶仅从rh-ITF的N末端切下6个氨基酸残基EEYVGL(相对分子量为708.8)。将胃蛋白酶切后产物大片段测序，其N端氨基酸为SANQQ，表明上述推测正确。说明rh-ITF对酸和胃蛋白酶有一定的抗性。因为胃中存在其它的蛋白质，所以可以这样认为rh-ITF在胃肠道环境中是稳定的。
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3 讨论
三叶肽是新近发现的一个蛋白家族，其主要成员SP，pS 2及ITF均在胃肠道表达，且具有组织器官特异性。文献报道[7]pSP能抑制五肽促胃酸激素诱导的胃酸分泌，并能抑制小肠蠕动。口服和皮下注射pSP和ITF能有效预防和治疗吲哚美辛及无水乙醇诱导的大鼠胃溃疡，但其剂量很大。本文采用盐酸诱导大鼠胃溃疡，尾静脉注射微量rh-ITF，说明rh-ITF在溃疡治疗和预防方面都有较好的疗效。
本文还表明rh-ITF对胃酸的分泌，胃蛋白酶活性及胃排空能力没有影响，说明rh-ITF对胃溃疡的治疗和预防作用不是通过降低攻击因子(酸和蛋白酶)和影响胃的自主运动实现的。文献报道[8]三叶肽在体外能促进小肠表皮细胞的迁移，因而rh-ITF很可能通过促进溃疡下层粘膜细胞的迁移而发挥作用。另外，rh-ITF在体外对酸和胃蛋白酶有一定的抗性，因而很有可能成为一种新型的治疗和预防胃溃疡的特效药。
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(肖传英老师在整个实验过程中给予了大力协助，特此致谢!)
作者简介：口如琴，女，33岁，博士生，讲师；
茹炳根，男，63岁，教授，博士生导师，卫生部新药评审委员
口如琴(北京大学生命科学学院生物化学及分子生物学系蛋白质工程国家重点实验室，北京 100871)
王蔚(北京大学生命科学学院生物化学及分子生物学系蛋白质工程国家重点实验室，北京 100871)
李令媛(北京大学生命科学学院生物化学及分子生物学系蛋白质工程国家重点实验室，北京 100871)
茹炳根(北京大学生命科学学院生物化学及分子生物学系蛋白质工程国家重点实验室，北京 100871)
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参考文献
1.Wright NA, Hoffmann W, Otto WR.Rolling in the clover: trefoil factor family (TFF)-domain peptides, cell migration and cancer. FEBS Letters, 1997;408:121～3
2.Mark WB, Michelle D, Lars T.Oral trefoil peptides protect against ethanol-and indomethacin-induced gastric injury in rats. Gastroenterology，1996;110: 489～97
3.Guth PH, Aures D, Paulsen G. Topic aspirin plus HCl gastric lesion in the rat. Gastroenterology，1979;76:88～91
, 百拇医药
4.张守仁，邵金莺，於毓文.呋喃唑酮和一些常用抗溃疡药对四种大鼠胃溃疡模型的影响.药学学报,1984; 91：5～11
5.(美)GG 吉尔鲍特. 酶法分析手册， 缪辉南，陈石根译.上海：上海科学技术出版社, 1983：136
6.Scarpignato C, Capovilla T, Bertacconi G. Actions of caerulein on gastric emptying of the conscious rat. Arch Int Pharmacodyn Ther, 1980;246:286～9
7.Jorgensen KD, Diamant B, Jorgensen KH et al. Pancreatic spasmolytic polypeptide (PSP): Ⅲ polypeptide with spasmolytic and gastric acid secretion inhibitory effects. Regul Pept, 1982;3:231～43
8.Shirley AM, Mary JV, Leonard RJ. Migration of IEC-6 cells: a model for mucosal healing. Am J Physiol，1992; 263(gastrointest liver physiol 26): G 426～35
9.口如琴，王 蔚，李令媛，茹炳根.小肠三叶因子的理化性质及光谱学行为.中国生物化学及分子生物学杂志，1999；15(5):787～91, 百拇医药
摘要 目的 探讨克隆表达的rh-ITF在模拟胃肠道条件下的稳定性和抗胃溃疡的作用机制。方法 采用质谱法及盐酸诱导的大鼠胃溃疡模型，测定rh-ITF在模拟胃肠道条件下的结构稳定性和大鼠腺胃粘膜损伤级别，损伤指数及胃酸度，胃蛋白酶活性及胃排空能力。结果 酸对rh-ITF相对分子量没有影响，胃蛋白酶仅从N端切除6个氨基酸残基。 rh-ITF可明显降低大鼠腺胃粘膜损伤级别和损伤指数，但对胃酸分泌，胃蛋白酶活性及胃排空能力没有影响。结论 rh-ITF在体外对酸和胃蛋白酶有一定的抗性，其对胃溃疡的治疗和预防作用不是通过降低攻击因子(酸和蛋白酶)和影响胃的自主运动实现的。
关键词：小肠三叶因子 胃溃疡 治疗和预防 稳定性
, 百拇医药
小肠三叶因子(intestinal trefoil factor, ITF)是新近发现的三叶因子家族(trefoil factor family, TFF)中的一个主要因子[1]，国外报道[2]口服和皮下注射pSP和ITF能有效预防和治疗吲哚美辛及无水乙醇诱导的大鼠胃溃疡，但其剂量很大。本文报道表达的rh-ITF在模拟胃肠道条件下的结构稳定性和低剂量尾静脉注射rh-ITF对盐酸诱导的大鼠胃溃疡的预防和治疗作用。
1 材料与方法
1.1 rh-ITF 为酵母表达纯化后的产物(本实验室提供，98%以上纯度)。质谱鉴定其二聚体和单体比例为87∶13[9]。
1.2 盐酸诱导的大鼠胃溃疡模型的建立 Wistar大鼠,体重100～150 g, 禁食24 h, 自由饮水，置于有网眼的铁丝笼，以防止自食粪便。预防组先每只尾静脉注射200 μg, 500 μg, 1 000 μg rh-ITF，30 min后灌胃1 ml 0.6 mol.L-1 HCl, 5 h后断颈处死。治疗组先灌胃1 ml 0.6 mol.L-1 HCl, 30 min后每只尾静脉注射200 μg，500 μg, 1 000 μg rh-ITF，5 h后断颈处死。对照组以相同体积的生理盐水代替rh-ITF。
, 百拇医药
1.3 溃疡级别及损伤指数的确定 将大鼠胃沿胃大弯剪开，仔细测量胃粘膜损伤数量，按文献[3，4]评定损伤指数。完整胃粘膜为0级，点状出血直径≥1 mm,1～5点为Ⅰ级，6～10点为Ⅱ级，10点以上为Ⅲ级，条状出血1～5条为Ⅳ级，6～10条为Ⅴ级，10条以上为Ⅵ级，以全胃各病灶长度之和作为损伤指数，以mm表示。
1.4 胃酸分析 收集大鼠胃液，用精密pH试纸测量其pH值，并用标准NaOH液滴定，酚红为指示剂，测定游离酸量。
1.5 胃蛋白酶活性测定 按文献[5]，以在pH 1.15时，室温下每分钟水解血红蛋白产生40 μg酪氨酸所需酶量定义为一个单位(U)。
1.6 大鼠胃排空实验 按文献[6]。Wistar大鼠100～150 g, 禁食24 h, 实验组和对照组分别每只尾静脉注射200 μg，500 μg, 1 000 μg rh-ITF和生理盐水，30 min后灌胃1 ml含有酚红的淀粉，30 min后断颈处死。取出胃，用剪刀剪碎，加入2 ml 0.6 mol.L-1 HCl振荡，离心，取上清560 nm比色，计算实验组和对照组大鼠胃内酚红的相对含量。
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1.7 组织病理学检测 将实验组和对照组大鼠胃于中性甲醛中固定，石腊包埋，切片，HE染色，镜检。
1.8 统计处理 实验数据以X±s表示，组间差异显著性检验采用双相t检验法。
2 结果
2.1 胃粘膜损伤级别及损伤指数 正常大鼠胃粘膜光滑无充血水肿，无溃疡出血灶。盐酸诱导的大鼠胃粘膜损伤，腺胃充血水肿，有明显出血点及点状、条索状溃疡灶或坏死灶。尾静脉注射rh-ITF组大鼠腺胃粘膜损伤级别下降，损伤指数明显降低(见图1、图2,P<0.05及P<0.01)。
2.2 胃酸度，胃蛋白酶活性及胃排空实验 尾静脉注射rh-ITF对大鼠胃酸度，胃液胃蛋白酶活性及胃排空无显著影响(P>0.05),结果见表1。
2.3 组织病理学检测结果 对照组及实验组溃疡最严重部位切片见图3。图3表明对照组溃疡严重，胃粘膜已经严重破坏，胃粘膜下肌层暴露，为多发性溃疡。实验组胃粘膜破坏程度较轻，固有层较完整。
, 百拇医药
Fig 1 Ulcer grades of control, precaution and therapy groups
.P<0.05 vs control;##P<0.01 vs control；control group:n=12,precaution group:n=12;therapy group:n=7
Fig 2 Ulcer indexes of control, precaution and therapy groups
.P<0.05 vs control;##P<0.01 vs control; control group: n=15; precaution group: n=12; therapy groups: n=7
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Fig 3 Cut section of gastric tissue for microscopic examination
A: normal rat； B: control group； C: precaution group； D: therapy group
Fig 4 MALDITOF-MS of rh-ITF
a: pure sample of rh-ITF；b: rh-ITF after acid treatment；c: rh-ITF after treatment by pepsin
Tab 1 Gastric acidity, pepsin activity of gastric liquid and ability
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of gastric excretion of experimental and control group, respectively
Group
Gastric acidity
/mol.L-1
pH
pepsin activity
/kU.L-1
gastric excretion
(OD560 nm)
, 百拇医药
control(n=30)
0.027±0.003
1.5～2.0
2600±432
0.978±0.290
precaution(n=24)
0.026±0.006
1.5～2.0
2671±159
0.976±0.300
theratic(n=14)
, 百拇医药
0.028±0.004
1.5～2.0
2633±256
0.947±0.600
2.4 rh-ITF在模拟胃肠道环境中的稳定性 rh-ITF分别于0.6 mol.L-1 HCl及胃蛋白酶最适pH下37℃作用3 h, 经MALDITOF-MS测定，rh-ITF纯品二聚体和单体相对分子量分别为13153.9和6580.7，按峰面积计算，二聚体占87%，单体占13%。酸作用后rh-ITF相对分子量没有改变，但二聚体的含量下降为81%，单体的含量上升为19%。rh-ITF对胃蛋白酶的作用有一定的抗性，经胃蛋白酶作用后，呈现为两个峰，峰1为单体，相对分子量5888.0，峰2为二聚体,相对分子量11771.6。与未作用的rh-ITF相比，单体相对分子量减少了692.7，根据cDNA推出的rh-ITF的N端蛋白序列EEYVGLSANQQ与各种氨基酸残基的相对分子量推测，胃蛋白酶仅从rh-ITF的N末端切下6个氨基酸残基EEYVGL(相对分子量为708.8)。将胃蛋白酶切后产物大片段测序，其N端氨基酸为SANQQ，表明上述推测正确。说明rh-ITF对酸和胃蛋白酶有一定的抗性。因为胃中存在其它的蛋白质，所以可以这样认为rh-ITF在胃肠道环境中是稳定的。
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3 讨论
三叶肽是新近发现的一个蛋白家族，其主要成员SP，pS 2及ITF均在胃肠道表达，且具有组织器官特异性。文献报道[7]pSP能抑制五肽促胃酸激素诱导的胃酸分泌，并能抑制小肠蠕动。口服和皮下注射pSP和ITF能有效预防和治疗吲哚美辛及无水乙醇诱导的大鼠胃溃疡，但其剂量很大。本文采用盐酸诱导大鼠胃溃疡，尾静脉注射微量rh-ITF，说明rh-ITF在溃疡治疗和预防方面都有较好的疗效。
本文还表明rh-ITF对胃酸的分泌，胃蛋白酶活性及胃排空能力没有影响，说明rh-ITF对胃溃疡的治疗和预防作用不是通过降低攻击因子(酸和蛋白酶)和影响胃的自主运动实现的。文献报道[8]三叶肽在体外能促进小肠表皮细胞的迁移，因而rh-ITF很可能通过促进溃疡下层粘膜细胞的迁移而发挥作用。另外，rh-ITF在体外对酸和胃蛋白酶有一定的抗性，因而很有可能成为一种新型的治疗和预防胃溃疡的特效药。
, http://www.100md.com
(肖传英老师在整个实验过程中给予了大力协助，特此致谢!)
作者简介：口如琴，女，33岁，博士生，讲师；
茹炳根，男，63岁，教授，博士生导师，卫生部新药评审委员
口如琴(北京大学生命科学学院生物化学及分子生物学系蛋白质工程国家重点实验室，北京 100871)
王蔚(北京大学生命科学学院生物化学及分子生物学系蛋白质工程国家重点实验室，北京 100871)
李令媛(北京大学生命科学学院生物化学及分子生物学系蛋白质工程国家重点实验室，北京 100871)
茹炳根(北京大学生命科学学院生物化学及分子生物学系蛋白质工程国家重点实验室，北京 100871)
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参考文献
1.Wright NA, Hoffmann W, Otto WR.Rolling in the clover: trefoil factor family (TFF)-domain peptides, cell migration and cancer. FEBS Letters, 1997;408:121～3
2.Mark WB, Michelle D, Lars T.Oral trefoil peptides protect against ethanol-and indomethacin-induced gastric injury in rats. Gastroenterology，1996;110: 489～97
3.Guth PH, Aures D, Paulsen G. Topic aspirin plus HCl gastric lesion in the rat. Gastroenterology，1979;76:88～91
, 百拇医药
4.张守仁，邵金莺，於毓文.呋喃唑酮和一些常用抗溃疡药对四种大鼠胃溃疡模型的影响.药学学报,1984; 91：5～11
5.(美)GG 吉尔鲍特. 酶法分析手册， 缪辉南，陈石根译.上海：上海科学技术出版社, 1983：136
6.Scarpignato C, Capovilla T, Bertacconi G. Actions of caerulein on gastric emptying of the conscious rat. Arch Int Pharmacodyn Ther, 1980;246:286～9
7.Jorgensen KD, Diamant B, Jorgensen KH et al. Pancreatic spasmolytic polypeptide (PSP): Ⅲ polypeptide with spasmolytic and gastric acid secretion inhibitory effects. Regul Pept, 1982;3:231～43
8.Shirley AM, Mary JV, Leonard RJ. Migration of IEC-6 cells: a model for mucosal healing. Am J Physiol，1992; 263(gastrointest liver physiol 26): G 426～35
9.口如琴，王 蔚，李令媛，茹炳根.小肠三叶因子的理化性质及光谱学行为.中国生物化学及分子生物学杂志，1999；15(5):787～91, 百拇医药