用RT-PCR方法定量检测中枢学习记忆功能有关基因的表达
魏小龙 张永祥 魏婉丽 徐海 郭淑华 周金黄
摘 要 目的 建立定量检测中枢学习记忆功能有关基因表达的方法。方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法定量检测了小鼠海马和皮层内学习记忆功能有关基因糖皮质激素受体(GR)、盐皮质激素受体(MR)、bcl-2、c-fos、神经细胞粘附分子(NCAM)等基因的表达水平。结果 RT-PCR具有灵敏度高、专一性好、简便快速等特点, 尤其适合于定量检测微量样品和表达水平较低的基因。结论 RT-PCR是一种较好的定量检测中枢学习记忆功能有关基因表达水平的方法。
关键词：逆转录聚合酶链反应 学习记忆 基因
近年来随着分子生物学及生物化学的飞速发展及其向神经生理等学科的渗透，大量研究初步表明中枢学习记忆过程受基因调控。已发现多种基因及其产物与中枢学习记忆的生理过程存在密切的关系，如糖皮质激素受体(GR)、盐皮质激素受体(MR)、bcl-2、c-fos、神经细胞粘附分子(NCAM)等参与了学习记忆的生理过程，在学习记忆过程中起重要的作用[1～7]。目前常规检测中枢学习记忆功能有关基因表达的方法有免疫组化方法和核酸杂交方法。这些方法往往灵敏度低、易导致假阳性, 费时费力。
, 百拇医药
本文利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)与图像分析相结合的方法定量检测了快速老化模型小鼠(senescence accelerated mouse，SAM)海马和皮层内学习记忆功能有关基因表达水平的变化, 此外还对该方法的可行性作了探讨。
1 材料和方法
1.1 动物 快速老化模型小鼠SAMP8及抗快速老化模型小鼠SAMR1, 11月龄,日本京都大学引进，本院动物中心饲养繁殖。
1.2 试剂 总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、Taq DNA聚合酶(5 000 U.L-1)、dNTP(10 mmol.L-1)、焦碳酸二乙酯、琼脂糖, 均为Promega公司产品。
1.3 仪器 9600型PCR仪，Perkin Elmer；HV3000多用电泳仪，北京东方仪器厂；TLL-C台式冷冻离心机，军事医学科学院实验仪器厂；图像分析仪，Kodak。
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1.4 引物设计 根据Genebank的序列, 用Goldkey软件分别设计中枢学习记忆功能有关基因GR、MR、bcl-2、c-fos和NCAM的引物。经检验引物内部无发夹结构, 引物之间无二聚体形成, 引物与基因库之间无非特异性同源区域。
1.5 总RNA提取[8，9] 实验分为SAMR1对照组和SAMP8实验组，每组取海马或皮层组织0.1 g (每鼠取0.025 g) 置5 ml离心管中，加预冷的异硫氰酸胍变性溶液1 ml，匀浆。加NaAc(2 mol.L-1，pH 4.0) 0.1 ml，酚-氯仿-异丙醇混合液1 ml，震荡，4℃，10 000×g离心20 min，吸取上清。加等容积异丙醇，-20℃放置2 h以上，4℃，10 000×g离心15 min，吸去上清。向沉淀中加0.5 ml变性溶液，搅拌至RNA溶解。加NaAc(2 mol.L-1，pH 4.0) 0.05 ml，酚-氯仿-异戊醇混合液0.5 ml，震荡，4℃，10 000×g离心20 min。上层水相转移到1.5 ml离心管中，加等容积异丙醇，-20℃放置2 h以上。0℃，10 000×g离心15 min，以预冷的75%乙醇0.8 ml洗涤沉淀，并按前法离心。吸去乙醇，在真空干燥器中干燥沉淀15 min，用0.3～0.5 ml无RNA酶的水溶解沉淀，-20℃保存备用；同时进行紫外定量，用甲醛变性电泳鉴定RNA的质量。
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1.6 逆转录反应[9，10] 在0.5 ml eppendorf管中加入rRNAsin (4×107 U.L-1) 0.5 μl，Oligo(dt)15引物 (0.5 g.L-1) 1 μl，总RNA 2 μg，MgCl2 (25 mmol.L-1) 4 μl，10×逆转录缓冲液2 μl，AMV逆转录酶(2.5×107 U.L-1) 0.6 μl，补加无RNA酶的水至总反应容积为20 μl，混匀，42℃反应1 h，95℃ 5 min终止反应，冰浴冷却5 min，-70℃保存。
1.7 PCR反应[9，10] 在0.5 ml eppendorf管中依次加入灭菌水32.5 μl，10×缓冲液5 μl，MgCl2 (25 mmol.L-1) 4 μl，dNTP (10 mmol.L-1) 1 μl，3′和5′端引物(2.5 μmol.L-1) 各2 μl，逆转录产物2 μl，Taq DNA聚合酶 (5 000 U.L-1) 0.25 μl，混匀。覆盖石蜡油50 μl，稍加离心，95℃变性2 min。设置反应程序：94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min 15 s，周期为34个循环(其中MR为38个循环)，最后72℃延伸10 min。
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1.8 PCR产物定量 PCR反应产物12 μl加3 μl载样缓冲液，以1×TBE为电泳缓冲液，在1.5%琼脂糖凝胶上50 V电压电泳约1 h。电泳完毕后，将琼脂糖凝胶用图像分析仪进行图像分析。然后计算待测基因与 β-actin光密度的比值，比较各组间gene /β-actin比值的大小。
1.9 统计学处理 数据以X±s表示，两组间均数比较用t检验。
2 结果
2.1 总RNA的鉴定 获得相当纯度和完整的RNA是核酸杂交成功的前提, 本实验提取的RNA经紫外测得A260/A280及A260/A230比值分别为1.75～1.85及2.20～2.30, 表明所提RNA纯度高, 污染低。从Fig 1甲醛变性凝胶电泳上可清晰看到28S和18S两条带, 其亮度之比约为2∶1, 并隐约可见5S条带。表明RNA带完整,没有降解, 可作为逆转录反应的模板。
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Fig 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA extracted
from the brain of 11-month SAM
Lane 1, 2, 3, 4, corresponds to R1(h), P8(h), R1(c), P8(c)， respectively. R1, P8, h and c represent SAMR1, SAMP8, hippocampus and cerebral cortex, respectively
2.2 实验样品的检测结果 利用RT-PCR技术和设定的两对引物, 在上述选定的实验条件下, 分别得到GR(356 bp)、MR(472 bp)、bcl-2(329 bp)、c-fos(242 bp)、NCAM(538 bp)和β-actin(742 bp)的扩增产物(Fig 2)。然后对琼脂糖凝胶电泳图谱上基因条带进行图像分析, 计算genes与β-actin吸收峰面积之比值。与SAMR1对照组相比, SAMP8海马内GR、MR的表达水平明显降低，bcl-2的表达水平明显升高，统计学处理差异有显著性(图3)。
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Fig 2 Photographs of representative RT-PCR products electro-
phoresed on 1.5% agarose gels stained with ethidium bromide
(A) Lane 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, corresponds to PCR marker,GR(R1), GR(P8),MR(R1),MR(P8),bcl-2(R1),bcl-2(P8),c-fos(R1),c-fos(P8),NCAM(R1), NCAM(P8), respectively. (B) Lane 1, 2, corresponds to β-actin(R1),β-actin(P8),respectively.R1 and P8 represent 11-month SAMR1 and SAMP8,respectively
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Fig 3 Levels of learning and memory function-related gene
expression in the hippocampus and cerebral cortex of 11-month SAM
A and B represent hippocampus and cerebral cortex, respectively. n=3, x±s. *P< 0.05, **P< 0.01, vs SAMR1
3 讨论
用RT-PCR定量检测脑内学习记忆功能有关基因的表达灵敏度高、特异性好、简便快速, 尤其适合于检测微量样品和表达水平很低的基因。本实验选择了在大多数细胞内均为高表达的β-actin作为对照, 避免了许多因素的干扰, 使测定的结果准确、可靠。
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目前认为海马是脑内与学习记忆功能关系最为密切的部位。在AD等神经退行性疾病患者的脑内，都存在严重的海马机能障碍，其海马的损伤程度与其学习记忆功能的衰退有明显的相关性[11，12]，说明海马机能障碍同AD的认知功能衰退具有密切的关系。SAMP8是SAM的亚系之一，有类似于AD的某些特征，其突出的特征是在增龄过程中，中枢学习记忆功能明显衰退，到11月龄时中枢学习记忆功能已受到明显的损害[13～16]。RT-PCR检测结果表明, 与同龄SAMR1对照组相比，11月龄SAMP8海马GR和MR的表达水平明显降低、bcl-2的表达水平升高，反应了中枢学习记忆功能衰退的趋势。GR和MR与学习记忆功能密切相关。GR在记忆的形成和获得过程中起重要作用，而MR则与记忆的保持密切相关[17，18]。使用GR、MR拮抗剂，小鼠的学习记忆能力受到明显的损害[19]，这与本实验的结果相一致。作为一个抗凋亡基因，bcl-2可能通过阻断神经细胞的损伤与丢失而影响学习记忆功能[20]。本实验中bcl-2表达水平的升高是一种神经元受损伤、脑老化后的代偿性升高。我们的实验说明RT-PCR是一种较好的定量检测脑内学习记忆功能有关基因表达水平的方法。此外,本实验也为建立定量检测脑内微量样品中其它基因的表达奠定了基础。
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*国家重点基础研究发展规划项目(No G1999054401),国家自然科学基金重点资助课题(No 39830450)及“九五”国家攀登计划预选项目资助课题
作者简介：魏小龙，男，35岁，博士；
张永祥，男，41岁，博士，日本东京大学博士后，研究员，副所长
魏小龙(军事医学科学院毒物药物研究所、放射医学研究所, 北京 100850)
张永祥(军事医学科学院毒物药物研究所、放射医学研究所, 北京 100850)
魏婉丽(军事医学科学院毒物药物研究所、放射医学研究所, 北京 100850)
徐海(军事医学科学院毒物药物研究所、放射医学研究所, 北京 100850)
, 百拇医药
郭淑华(军事医学科学院毒物药物研究所、放射医学研究所, 北京 100850)
周金黄(军事医学科学院毒物药物研究所、放射医学研究所, 北京 100850)
参考文献
1，Pugh CR, Fleshner M, Rudy JW. Type Ⅱ glucocorticoid receptor antagonists impair contextual but not anditory-cue fear conditioning in juvenile rats. Nourobiol Learn Mem, 1997;67(1):75～9
2，Oitzl MS, Fluttert M, de Kloet ER. Acute blockade of hippocampal glucocorticoid receptors facilitates spatial learning in rats. Brain Res, 1998;797(1):159～62
, 百拇医药
3，Douma BR, Korte SM, Buwalda B et al. Repeated blockade of mineralocorticoid receptors, but not of glucocorticoid receptors impairs food rewarded spatial learning. Psychoneuroendocrinology, 1998; 23(1):33～44
4，Burne JF, Staple JK, Raff MC. Glial cells are increased proportionally in transgenic optic nerves with increased numbers of axons. J Neurosci, 1996;16(6):2064～73
5，Mileusnic R, Anokhin K, Rose SP. Antisense oligodeoxynucleotides to c-fos are amnestic for passive avoidance in the chick. Neuroreport, 1996;7(7):1269～72
, 百拇医药
6，Paylor R, Johnson RS, Papaioannou V et al. Behavioral assessment of c-fos mutant mice. Brain Res, 1994;651(1～2):275～82
7，Chen A, Reyes A, Akeson R. Transcription initiation sites and structural organization of the extreme 5' region of the rat neural cell adhesion molecule gene. Mol Cell Biol, 1990;10(7):3314～24
8，Chomczynski P， Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987;162:156～9
, http://www.100md.com
9，魏小龙，茹祥斌. 低分子量地黄多糖对p53基因表达的影响. 中国药理学报，1997；18(5)：471～4
10，Dukas K, Sarfati P, Vaysse N et al. Quantitation of changes in the expression of multiple genes by simultaneous polymerase chain reaction. Anal Biochem, 1993;215:66～72
11，Mann DMA. The neuropathology of Alzheimers disease: a review with pathologenetic, etiological and therapeutic considerations. Mech Aging Dev, 1985;31:213～55
12，Wisniewski HM， Merz GS. Neuropathology of the aging brain and dementia of the Alzheimer's disease. In: Gaitz CM and Samorajski T Eds. Our health care destiny. Vol. 1. Biomedical Issues, New York, Springer-Verlag, 1985：231～43
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13，宋 涛，张永祥，周金黄. 六味地黄汤口服4个月对早衰小鼠(SAM)学习记忆的影响. 中国药理学通讯，1996；13(3)：21
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18，Sandi C, Loscertales M, Guaza C. Experience-dependent facilitating effect of corticosterone on spatial memory formation in the water maze. Eur J Neurosci, 1997;9:637～42
19，Pugh CR, Fleshner P, Rudy JW. Type Ⅱ glucocorticoid receptor antagonists impair contextual but not auditory-cue fear conditioning in juvenile rats. Neurobiol Learn Mem, 1997;67:75～9
20，Phelps CH. Neural plasticity in aging and Alzheimers disease: some selected comments. Prog Brain Res, 1990;86:3～9, 百拇医药
摘 要 目的 建立定量检测中枢学习记忆功能有关基因表达的方法。方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法定量检测了小鼠海马和皮层内学习记忆功能有关基因糖皮质激素受体(GR)、盐皮质激素受体(MR)、bcl-2、c-fos、神经细胞粘附分子(NCAM)等基因的表达水平。结果 RT-PCR具有灵敏度高、专一性好、简便快速等特点, 尤其适合于定量检测微量样品和表达水平较低的基因。结论 RT-PCR是一种较好的定量检测中枢学习记忆功能有关基因表达水平的方法。
关键词：逆转录聚合酶链反应 学习记忆 基因
近年来随着分子生物学及生物化学的飞速发展及其向神经生理等学科的渗透，大量研究初步表明中枢学习记忆过程受基因调控。已发现多种基因及其产物与中枢学习记忆的生理过程存在密切的关系，如糖皮质激素受体(GR)、盐皮质激素受体(MR)、bcl-2、c-fos、神经细胞粘附分子(NCAM)等参与了学习记忆的生理过程，在学习记忆过程中起重要的作用[1～7]。目前常规检测中枢学习记忆功能有关基因表达的方法有免疫组化方法和核酸杂交方法。这些方法往往灵敏度低、易导致假阳性, 费时费力。
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本文利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)与图像分析相结合的方法定量检测了快速老化模型小鼠(senescence accelerated mouse，SAM)海马和皮层内学习记忆功能有关基因表达水平的变化, 此外还对该方法的可行性作了探讨。
1 材料和方法
1.1 动物 快速老化模型小鼠SAMP8及抗快速老化模型小鼠SAMR1, 11月龄,日本京都大学引进，本院动物中心饲养繁殖。
1.2 试剂 总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、Taq DNA聚合酶(5 000 U.L-1)、dNTP(10 mmol.L-1)、焦碳酸二乙酯、琼脂糖, 均为Promega公司产品。
1.3 仪器 9600型PCR仪，Perkin Elmer；HV3000多用电泳仪，北京东方仪器厂；TLL-C台式冷冻离心机，军事医学科学院实验仪器厂；图像分析仪，Kodak。
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1.4 引物设计 根据Genebank的序列, 用Goldkey软件分别设计中枢学习记忆功能有关基因GR、MR、bcl-2、c-fos和NCAM的引物。经检验引物内部无发夹结构, 引物之间无二聚体形成, 引物与基因库之间无非特异性同源区域。
1.5 总RNA提取[8，9] 实验分为SAMR1对照组和SAMP8实验组，每组取海马或皮层组织0.1 g (每鼠取0.025 g) 置5 ml离心管中，加预冷的异硫氰酸胍变性溶液1 ml，匀浆。加NaAc(2 mol.L-1，pH 4.0) 0.1 ml，酚-氯仿-异丙醇混合液1 ml，震荡，4℃，10 000×g离心20 min，吸取上清。加等容积异丙醇，-20℃放置2 h以上，4℃，10 000×g离心15 min，吸去上清。向沉淀中加0.5 ml变性溶液，搅拌至RNA溶解。加NaAc(2 mol.L-1，pH 4.0) 0.05 ml，酚-氯仿-异戊醇混合液0.5 ml，震荡，4℃，10 000×g离心20 min。上层水相转移到1.5 ml离心管中，加等容积异丙醇，-20℃放置2 h以上。0℃，10 000×g离心15 min，以预冷的75%乙醇0.8 ml洗涤沉淀，并按前法离心。吸去乙醇，在真空干燥器中干燥沉淀15 min，用0.3～0.5 ml无RNA酶的水溶解沉淀，-20℃保存备用；同时进行紫外定量，用甲醛变性电泳鉴定RNA的质量。
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1.6 逆转录反应[9，10] 在0.5 ml eppendorf管中加入rRNAsin (4×107 U.L-1) 0.5 μl，Oligo(dt)15引物 (0.5 g.L-1) 1 μl，总RNA 2 μg，MgCl2 (25 mmol.L-1) 4 μl，10×逆转录缓冲液2 μl，AMV逆转录酶(2.5×107 U.L-1) 0.6 μl，补加无RNA酶的水至总反应容积为20 μl，混匀，42℃反应1 h，95℃ 5 min终止反应，冰浴冷却5 min，-70℃保存。
1.7 PCR反应[9，10] 在0.5 ml eppendorf管中依次加入灭菌水32.5 μl，10×缓冲液5 μl，MgCl2 (25 mmol.L-1) 4 μl，dNTP (10 mmol.L-1) 1 μl，3′和5′端引物(2.5 μmol.L-1) 各2 μl，逆转录产物2 μl，Taq DNA聚合酶 (5 000 U.L-1) 0.25 μl，混匀。覆盖石蜡油50 μl，稍加离心，95℃变性2 min。设置反应程序：94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min 15 s，周期为34个循环(其中MR为38个循环)，最后72℃延伸10 min。
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1.8 PCR产物定量 PCR反应产物12 μl加3 μl载样缓冲液，以1×TBE为电泳缓冲液，在1.5%琼脂糖凝胶上50 V电压电泳约1 h。电泳完毕后，将琼脂糖凝胶用图像分析仪进行图像分析。然后计算待测基因与 β-actin光密度的比值，比较各组间gene /β-actin比值的大小。
1.9 统计学处理 数据以X±s表示，两组间均数比较用t检验。
2 结果
2.1 总RNA的鉴定 获得相当纯度和完整的RNA是核酸杂交成功的前提, 本实验提取的RNA经紫外测得A260/A280及A260/A230比值分别为1.75～1.85及2.20～2.30, 表明所提RNA纯度高, 污染低。从Fig 1甲醛变性凝胶电泳上可清晰看到28S和18S两条带, 其亮度之比约为2∶1, 并隐约可见5S条带。表明RNA带完整,没有降解, 可作为逆转录反应的模板。
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Fig 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA extracted
from the brain of 11-month SAM
Lane 1, 2, 3, 4, corresponds to R1(h), P8(h), R1(c), P8(c)， respectively. R1, P8, h and c represent SAMR1, SAMP8, hippocampus and cerebral cortex, respectively
2.2 实验样品的检测结果 利用RT-PCR技术和设定的两对引物, 在上述选定的实验条件下, 分别得到GR(356 bp)、MR(472 bp)、bcl-2(329 bp)、c-fos(242 bp)、NCAM(538 bp)和β-actin(742 bp)的扩增产物(Fig 2)。然后对琼脂糖凝胶电泳图谱上基因条带进行图像分析, 计算genes与β-actin吸收峰面积之比值。与SAMR1对照组相比, SAMP8海马内GR、MR的表达水平明显降低，bcl-2的表达水平明显升高，统计学处理差异有显著性(图3)。
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Fig 2 Photographs of representative RT-PCR products electro-
phoresed on 1.5% agarose gels stained with ethidium bromide
(A) Lane 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, corresponds to PCR marker,GR(R1), GR(P8),MR(R1),MR(P8),bcl-2(R1),bcl-2(P8),c-fos(R1),c-fos(P8),NCAM(R1), NCAM(P8), respectively. (B) Lane 1, 2, corresponds to β-actin(R1),β-actin(P8),respectively.R1 and P8 represent 11-month SAMR1 and SAMP8,respectively
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Fig 3 Levels of learning and memory function-related gene
expression in the hippocampus and cerebral cortex of 11-month SAM
A and B represent hippocampus and cerebral cortex, respectively. n=3, x±s. *P< 0.05, **P< 0.01, vs SAMR1
3 讨论
用RT-PCR定量检测脑内学习记忆功能有关基因的表达灵敏度高、特异性好、简便快速, 尤其适合于检测微量样品和表达水平很低的基因。本实验选择了在大多数细胞内均为高表达的β-actin作为对照, 避免了许多因素的干扰, 使测定的结果准确、可靠。
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目前认为海马是脑内与学习记忆功能关系最为密切的部位。在AD等神经退行性疾病患者的脑内，都存在严重的海马机能障碍，其海马的损伤程度与其学习记忆功能的衰退有明显的相关性[11，12]，说明海马机能障碍同AD的认知功能衰退具有密切的关系。SAMP8是SAM的亚系之一，有类似于AD的某些特征，其突出的特征是在增龄过程中，中枢学习记忆功能明显衰退，到11月龄时中枢学习记忆功能已受到明显的损害[13～16]。RT-PCR检测结果表明, 与同龄SAMR1对照组相比，11月龄SAMP8海马GR和MR的表达水平明显降低、bcl-2的表达水平升高，反应了中枢学习记忆功能衰退的趋势。GR和MR与学习记忆功能密切相关。GR在记忆的形成和获得过程中起重要作用，而MR则与记忆的保持密切相关[17，18]。使用GR、MR拮抗剂，小鼠的学习记忆能力受到明显的损害[19]，这与本实验的结果相一致。作为一个抗凋亡基因，bcl-2可能通过阻断神经细胞的损伤与丢失而影响学习记忆功能[20]。本实验中bcl-2表达水平的升高是一种神经元受损伤、脑老化后的代偿性升高。我们的实验说明RT-PCR是一种较好的定量检测脑内学习记忆功能有关基因表达水平的方法。此外,本实验也为建立定量检测脑内微量样品中其它基因的表达奠定了基础。
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*国家重点基础研究发展规划项目(No G1999054401),国家自然科学基金重点资助课题(No 39830450)及“九五”国家攀登计划预选项目资助课题
作者简介：魏小龙，男，35岁，博士；
张永祥，男，41岁，博士，日本东京大学博士后，研究员，副所长
魏小龙(军事医学科学院毒物药物研究所、放射医学研究所, 北京 100850)
张永祥(军事医学科学院毒物药物研究所、放射医学研究所, 北京 100850)
魏婉丽(军事医学科学院毒物药物研究所、放射医学研究所, 北京 100850)
徐海(军事医学科学院毒物药物研究所、放射医学研究所, 北京 100850)
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郭淑华(军事医学科学院毒物药物研究所、放射医学研究所, 北京 100850)
周金黄(军事医学科学院毒物药物研究所、放射医学研究所, 北京 100850)
参考文献
1，Pugh CR, Fleshner M, Rudy JW. Type Ⅱ glucocorticoid receptor antagonists impair contextual but not anditory-cue fear conditioning in juvenile rats. Nourobiol Learn Mem, 1997;67(1):75～9
2，Oitzl MS, Fluttert M, de Kloet ER. Acute blockade of hippocampal glucocorticoid receptors facilitates spatial learning in rats. Brain Res, 1998;797(1):159～62
, 百拇医药
3，Douma BR, Korte SM, Buwalda B et al. Repeated blockade of mineralocorticoid receptors, but not of glucocorticoid receptors impairs food rewarded spatial learning. Psychoneuroendocrinology, 1998; 23(1):33～44
4，Burne JF, Staple JK, Raff MC. Glial cells are increased proportionally in transgenic optic nerves with increased numbers of axons. J Neurosci, 1996;16(6):2064～73
5，Mileusnic R, Anokhin K, Rose SP. Antisense oligodeoxynucleotides to c-fos are amnestic for passive avoidance in the chick. Neuroreport, 1996;7(7):1269～72
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6，Paylor R, Johnson RS, Papaioannou V et al. Behavioral assessment of c-fos mutant mice. Brain Res, 1994;651(1～2):275～82
7，Chen A, Reyes A, Akeson R. Transcription initiation sites and structural organization of the extreme 5' region of the rat neural cell adhesion molecule gene. Mol Cell Biol, 1990;10(7):3314～24
8，Chomczynski P， Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987;162:156～9
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