北京地区TT病毒分离株全基因的克隆及序列测定
北京地区TT病毒分离株全基因的克隆及序列测定
何忠平 周育森 张启云 彭国爱 王海涛 崔振宇
摘 要 目的 克隆和测定北京地区TT病毒(TTV)分离株全基因序列。方法 采用聚合酶链反应(PCR)技术从1例临床非甲～庚型肝炎病人血清中分段扩增TTV全基因，获得5个互相重叠的片段，分别长199 bp(1-199)，1 267bp(90-1 356)，878 bp(1 354-2 231)，1 129 bp(2 178-3 306)，434 bp(3 306-3 739)，用标准的分子生物学方法测定了这5个序列，从而得到全长TTV基因序列。结果 北京地区TTV分离株全基因长3 739个核苷酸，含2个开放读码框架(ORF)。第1个ORF位于589至2 902位核苷酸，编码770个氨基酸，第2个ORF位于107至715位核苷酸，编码202个氨基酸。TTV基因的5′和3′末端为非编码区，分别有106和837个核苷酸。在该基因中A占31.2%，C占25.4%，G占22.5%，T占20.9%。北京地区TTV分离株与日本分离株的核苷酸和氨基酸同源性均在95%以上。结论 北京地区TTV分离株和日本株属同一基因型。
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关键词：基因，病毒 聚合酶链反应 碱基序列 TTV
已知6种肝炎病毒(A～E，G)都有其特异的检测方法，但仍有未知病原的肝炎发生，提示有新的肝炎致病因子存在。1995年庚型肝炎病毒(HGV)的发现，使大约10%～20%的非甲～戊型肝炎的病因得到可能的解释。1997年日本学者报道一种与肝功能异常有关的DNA病毒，并把此病毒命名为TT病毒(TTV)。我们的初步研究表明，我国不同人群和不同肝炎病人中存在TTV感染。为了解TTV北京地区分离株的基因结构与特征，建立适合我国肝炎病人的诊断方法以及了解我国TTV的基因变异情况，我们测定了1株北京地区非甲～戊型肝炎病人的TTV全基因序列。
1 材料和方法
1.1 血清标本 血清标本采自北京地坛医院的1例非甲～庚型肝炎病人。
1.2 实验试剂 克隆载体(T-vector)、XL1-Blue菌为美国Invitrogen公司产品。Taq酶、dNTPs、T4DNA为华美公司产品。STG试剂盒购自Biotronic公司，QIAprep MiniPrep质粒提取试剂为QIAgen公司产品。
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1.3 TTV全基因的克隆 用PCR技术分段扩增克隆TTV全基因并测定其核苷酸序列。
1.4 引物设计 参考日本已发表TTV的全基因序列(AB008394)设计一套引物。所设计合成的下述重叠引物贯穿了参考序列的全序列。引物序列为：P1/P2(1-199),P1:5′-ATTTGCTACGTCACTAACC-3′;P2:5′-GTGTGTAAACTCACCTTCGT-3′。P3/P4(90-1356),P3:5′-AGTAAGTGCACTTCCGAATG-3′;P4:5′-TGAGCCGAACGGATATTGCA-3′。P5/P6(1354-2231),P5:5′-TCACCACTAACTGACTCTGT-3′;p6:5′-GGATACCATTTTAAAGAGTA-3′。P7/P8(2178/3306),P7:5′-AATGCCAGGAGGTAGTAGTA-3′;P8:5′-GCCATTGGACTCAGGAGCT-3′。P9/P10(3306-3739),P9:5′-TAGCTCCTGAGTCCAATGGC-3′;P10:5′-GCCGACGGTTTTTTGGCGC-3′。
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1.5 TTV DNA的提取 100 μl血清加130 μl STG缓冲液，混匀，100℃变性5 min，2 500 r/min离心10 min，挑除变性蛋白，加180 μl异丙醇沉淀，室温离心，沉淀物干燥后用无菌水20 μl溶解备用。
1.6 PCR扩增条件 在0.5 ml的离心管内加入10×PCR缓冲液3 μl，P1/P2(或P3/P4，P5/P6，P7/P8，P9/P10)引物各0.2 μmol/L，dNTPs100 μmol/L，Taq酶1 U，总体积30 μl。按下述条件扩增：94℃180 s，94℃50 s，55℃50 s，72℃60 s，30个循环，最后72℃延伸10 min。取10 μlPCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯下观察结果。
1.7 克隆及测序方法 扩增阳性的PCR产物纯化后，直接与T载体(pBluescript-T vector)连接，转化XL1-Blue宿主菌。挑取白色菌落用PCR和酶切鉴定，对阳性菌落接种培养，提取质粒DNA。采用ABI377型自动测序仪测序。每个克隆均双向测序。
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1.8 DNA序列的计算机分析 采用CLUSTAWL的ALIGNMENT程序进行多个序列的比较，引物设计及分析使用GOLDKEY和OLIGO软件。
2 结果
2.1 北京地区TTV全基因克隆及序列测定 用PCR技术分段扩增出5个互相重叠的片段，纯化后直接与T vector连接后进行克隆、双向测序。北京地区TTV(TTV BDH1)DNA的核苷酸全序列见图1。此序列已注册GenBank,序列号为AF116842。该序列全长3 739个核苷酸，有2个开放读码框架。第1个ORF位于589至2 902位核苷酸，编码770个氨基酸，第2个ORF位于107至715位核苷酸，编码202个氨基酸。两端为非编码区，5′端为106 bp，3′端为837 bp个核苷酸。4种碱基在基因组中所占的比例为：A 31.2%(1 168/3 739)，T 20.9%(781/3 739)，G 22.5%(840/3 739)，C 25.4%(950/3 739)；G+C占47.9%，A+T占52.1%。
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图1 北京地区TTV分离株的核苷酸全序列
Fig.1 Complete nucleotide sequence of TTV isolate in Beijing region
2.2 北京地区TTV分离株与其他TTV分离株核苷酸和氨基酸的同源性比较 将测定的序列用BLAST程序与GenBank中的序列进行比较，结果表明，我国北京地区TTV分离株与日本发表的TTV全基因序列(AB008394)具有极高的同源性。核苷酸和氨基酸同源性均大于95%，表明两者同属于同一基因型。
3 讨论
病毒性肝炎是危害人类健康的重要疾病之一。已知的甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒是导致人类急、慢性肝炎的最主要的病原因子。自从1989年美国疾病控制中心(CDC)的Bradley等首次报道从NANB肝炎病毒感染的黑猩猩的血液及肝脏中克隆了NANBH相关的病毒基因片段，即著名的5-1-1片段。这一片段被认为是丙型肝炎的病原的基因片段，故将其命名为丙型肝炎病毒(HCV)[1]。自此，拉开了寻找新型肝炎致病因子的序幕。1990年，这一研究小组从病毒的基因克隆入手，克隆了肠道传播的非甲非乙型肝炎的病毒基因片段[2]。但是，在排除上述五种肝炎病毒感染、巨细胞病毒、EB病毒感染外，约有10%～20%的病毒性肝炎病人病因不明，提示标志肝炎的字母符号还需扩展[3，5]。1996年，Leary和Linnen等人[6，7]分别发现了HGV/GBV-C，并克隆和测定了全基因序列，但目前对HGV/GBV-C的致病性看法不同[12]。1997年10月，日本学者Nishizawa等[8]采用代表性差异技术，从一个输血后肝炎病人中克隆到一个500 bp的片段(N22)。通过分子流行病学研究，证实N22与输血后肝炎有高度特异性。同年，Okamoto等[9]测定了TTV全基因序列，首次系统地揭示了TTV的基本特征。至此，NANBH的病原学研究取得了突破性进展。
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TTV与已知的动物单股DNA病毒相似的有圆环副链DNA病毒(圆环病毒科如鸡贫血病毒)，线状细小病毒科(如人细小病毒HPV B19，腺联病毒AAV)。Okamoto等人的资料显示，TTV是一个3.7 kb的无包膜的单股DNA病毒，可能属于细小病毒科。TTV含两个开放读码框架(ORF)、ORF1位于该基因组的589-2 898位核苷酸，编码770个氨基酸，其N端是富含精氨酸的高亲水区；ORF2位于107-712位核苷酸，编码202个氨基酸。其基因全长3 739个核苷酸，其中A占31%(1163)，C占26%(954)，G占23%(842)，T占21%(780)，有12个TATA序列，两个多腺苷酸化信号(AATAAA)，这些特征与细小病毒相似。TTV在各种人群中分布极为广泛，在非甲～戊爆发型肝炎中，TTV阳性率为47%(9/19)；非甲～戊慢性肝病中，TTV阳性率为46%(41/90)，其中慢性肝炎47%(15/32)，肝硬化48%(19/40)，肝癌39%(7/18)；血友病人TTV阳性率为46%(26/57)，献血员病人TTV阳性率为12%(34/290)[8，9]。
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在非甲～庚型肝炎病人中，TTV阳性率为43%(48/112)，甲～戊型肝炎病人中，TTV阳性率为5.3%(9/270)，ALT升高的献血员中，TTV的阳性率为34.6%(9/26)，ALT正常的献血员中为16.8%(28/166)[10，11]。可见TTV与非甲～庚型肝炎以及肝功能异常有密切关系。
Okamoto等[9]根据78个TTV部分序列分析结果，将序列之间的差异达30%分为两群，G1群有76个分离株，G2群有2个分离株；序列之间差异在10%～15%分为亚群，分别为G1a、G1b和G2a、G2b。这些资料提示，TTV可能存在不同的基因型和变异株。我们测定的北京地区TTV全基因序列，全长3 739个核苷酸，有2个开放读码框架(ORF)。ORF1(nt 589-2902)和ORF2(nt 107-715)分别编码770和202个氨基酸。两端为非编码区，5′端3′端分别为106和837 bp。基因组中G+C占47.9%(G 22.5%，C 25.4%)，A+T占52.1%(A 31.2%，T 20.9%)。与日本TTV分离株(AF008304)全序列比较，两者之间的核苷酸和氨基酸同源性都超过95%，基因变异甚小，可能属于同一基因型。有关TTV的起源、分型和基因变异情况，还需更多的全序列比较研究。
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我们对16例TTV PCR和斑点杂交均阳性的非甲～庚型肝炎病人的临床资料总结表明，此型肝炎的临床特点为：症状轻，黄疸轻微，以单相血清转氨酶轻、中度增高为主，病程稍长，少数病人病程可超过两年，血清转氨酶可有波动。TTV传播方式是以输血传播为主，还是以肠道传播为主，是否属于肠道传染性肝炎病毒，以及TTV在人体的分布，如TTV在外周血单核细胞(PBMC)和肝组织的感染和复制情况等，有待于进一步通过临床分子流行病学调查及原子杂交和原位PCR技术对TTV的临床致病机理进行研究。
作者单位：何忠平(100011，北京，北京地坛医院病毒研究中心)
张启云(100011，北京，北京地坛医院病毒研究中心)
彭国爱(100011，北京，北京地坛医院病毒研究中心)
崔振宇(100011，北京，北京地坛医院病毒研究中心)
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周育森(军事医学科学院微生物流行病学研究所11室)
王海涛(军事医学科学院微生物流行病学研究所11室)
参考文献
1 Choo QL,Kuo G, Weiner AJ, et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science, 1989, 244: 359-365.
2 Reyes GR, Purdy MA, Kim JP, et al. Isolation of a cDNA from the virus responsible for enterically transmitted non-A, non B hepatitis. Science, 1990, 247: 1335-40.
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3 Marcellin P. Chronic non-B, non-C hepatitis among blood donors assayed with HCV third generation test and polymerase chain reaction. J Hepatol,1993,19:167-72.
4 Buti M. Etiology of acute sporadic hepatitis in Spain. J Hepatol, 1994, 20:589-596.
5 Sallie R. Hepatitis C and E in non-A, non-B fulminant hepatic failure. J Med Virol, 1994, 580-586.
6 Leary TP, Muerhoff SA, Simons JN, et al. Sequence and genomic organization of GBV-C:A novel member of the flaviviridae associated with human non A-E hepatitis. J Med Virol, 1996,48:60-7.
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7 Linnen J, Wages J, Zhang-keck ZY, et al. Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus: A transfusion-transmissible agent. Science, 1996, 271: 505-8.
8 Nishizawa T, Okamato H, Konishi K, et al. A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Biochem Biophys Res commun, 1997, 241: 92-7.
9 Okamako H, Nishiawa T, Kayto N, et al. Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus (TTV) associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Hepatol Res, 1998,10:1-16.
10 周育森，何忠平，董京芳，等.中国人TTV部分基因克隆及序列测定.军事医学科学院院刊，1998，22：107-110.
11 王培之，何忠平，周育森，等.从抗-HCV阳性的输血后肝炎血清中检测出5例TT病毒患者的临床初步报道.中华实验和临床病毒学杂志，1999，13：84.
12 何忠平，张启云，彭国爱.病毒性肝炎患者血清中抗庚型肝炎病毒抗体的检测.中华实验和临床病毒学杂志，1999，13：100., 百拇医药
何忠平 周育森 张启云 彭国爱 王海涛 崔振宇
摘 要 目的 克隆和测定北京地区TT病毒(TTV)分离株全基因序列。方法 采用聚合酶链反应(PCR)技术从1例临床非甲～庚型肝炎病人血清中分段扩增TTV全基因，获得5个互相重叠的片段，分别长199 bp(1-199)，1 267bp(90-1 356)，878 bp(1 354-2 231)，1 129 bp(2 178-3 306)，434 bp(3 306-3 739)，用标准的分子生物学方法测定了这5个序列，从而得到全长TTV基因序列。结果 北京地区TTV分离株全基因长3 739个核苷酸，含2个开放读码框架(ORF)。第1个ORF位于589至2 902位核苷酸，编码770个氨基酸，第2个ORF位于107至715位核苷酸，编码202个氨基酸。TTV基因的5′和3′末端为非编码区，分别有106和837个核苷酸。在该基因中A占31.2%，C占25.4%，G占22.5%，T占20.9%。北京地区TTV分离株与日本分离株的核苷酸和氨基酸同源性均在95%以上。结论 北京地区TTV分离株和日本株属同一基因型。
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关键词：基因，病毒 聚合酶链反应 碱基序列 TTV
已知6种肝炎病毒(A～E，G)都有其特异的检测方法，但仍有未知病原的肝炎发生，提示有新的肝炎致病因子存在。1995年庚型肝炎病毒(HGV)的发现，使大约10%～20%的非甲～戊型肝炎的病因得到可能的解释。1997年日本学者报道一种与肝功能异常有关的DNA病毒，并把此病毒命名为TT病毒(TTV)。我们的初步研究表明，我国不同人群和不同肝炎病人中存在TTV感染。为了解TTV北京地区分离株的基因结构与特征，建立适合我国肝炎病人的诊断方法以及了解我国TTV的基因变异情况，我们测定了1株北京地区非甲～戊型肝炎病人的TTV全基因序列。
1 材料和方法
1.1 血清标本 血清标本采自北京地坛医院的1例非甲～庚型肝炎病人。
1.2 实验试剂 克隆载体(T-vector)、XL1-Blue菌为美国Invitrogen公司产品。Taq酶、dNTPs、T4DNA为华美公司产品。STG试剂盒购自Biotronic公司，QIAprep MiniPrep质粒提取试剂为QIAgen公司产品。
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1.3 TTV全基因的克隆 用PCR技术分段扩增克隆TTV全基因并测定其核苷酸序列。
1.4 引物设计 参考日本已发表TTV的全基因序列(AB008394)设计一套引物。所设计合成的下述重叠引物贯穿了参考序列的全序列。引物序列为：P1/P2(1-199),P1:5′-ATTTGCTACGTCACTAACC-3′;P2:5′-GTGTGTAAACTCACCTTCGT-3′。P3/P4(90-1356),P3:5′-AGTAAGTGCACTTCCGAATG-3′;P4:5′-TGAGCCGAACGGATATTGCA-3′。P5/P6(1354-2231),P5:5′-TCACCACTAACTGACTCTGT-3′;p6:5′-GGATACCATTTTAAAGAGTA-3′。P7/P8(2178/3306),P7:5′-AATGCCAGGAGGTAGTAGTA-3′;P8:5′-GCCATTGGACTCAGGAGCT-3′。P9/P10(3306-3739),P9:5′-TAGCTCCTGAGTCCAATGGC-3′;P10:5′-GCCGACGGTTTTTTGGCGC-3′。
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1.5 TTV DNA的提取 100 μl血清加130 μl STG缓冲液，混匀，100℃变性5 min，2 500 r/min离心10 min，挑除变性蛋白，加180 μl异丙醇沉淀，室温离心，沉淀物干燥后用无菌水20 μl溶解备用。
1.6 PCR扩增条件 在0.5 ml的离心管内加入10×PCR缓冲液3 μl，P1/P2(或P3/P4，P5/P6，P7/P8，P9/P10)引物各0.2 μmol/L，dNTPs100 μmol/L，Taq酶1 U，总体积30 μl。按下述条件扩增：94℃180 s，94℃50 s，55℃50 s，72℃60 s，30个循环，最后72℃延伸10 min。取10 μlPCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯下观察结果。
1.7 克隆及测序方法 扩增阳性的PCR产物纯化后，直接与T载体(pBluescript-T vector)连接，转化XL1-Blue宿主菌。挑取白色菌落用PCR和酶切鉴定，对阳性菌落接种培养，提取质粒DNA。采用ABI377型自动测序仪测序。每个克隆均双向测序。
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1.8 DNA序列的计算机分析 采用CLUSTAWL的ALIGNMENT程序进行多个序列的比较，引物设计及分析使用GOLDKEY和OLIGO软件。
2 结果
2.1 北京地区TTV全基因克隆及序列测定 用PCR技术分段扩增出5个互相重叠的片段，纯化后直接与T vector连接后进行克隆、双向测序。北京地区TTV(TTV BDH1)DNA的核苷酸全序列见图1。此序列已注册GenBank,序列号为AF116842。该序列全长3 739个核苷酸，有2个开放读码框架。第1个ORF位于589至2 902位核苷酸，编码770个氨基酸，第2个ORF位于107至715位核苷酸，编码202个氨基酸。两端为非编码区，5′端为106 bp，3′端为837 bp个核苷酸。4种碱基在基因组中所占的比例为：A 31.2%(1 168/3 739)，T 20.9%(781/3 739)，G 22.5%(840/3 739)，C 25.4%(950/3 739)；G+C占47.9%，A+T占52.1%。
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图1 北京地区TTV分离株的核苷酸全序列
Fig.1 Complete nucleotide sequence of TTV isolate in Beijing region
2.2 北京地区TTV分离株与其他TTV分离株核苷酸和氨基酸的同源性比较 将测定的序列用BLAST程序与GenBank中的序列进行比较，结果表明，我国北京地区TTV分离株与日本发表的TTV全基因序列(AB008394)具有极高的同源性。核苷酸和氨基酸同源性均大于95%，表明两者同属于同一基因型。
3 讨论
病毒性肝炎是危害人类健康的重要疾病之一。已知的甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒是导致人类急、慢性肝炎的最主要的病原因子。自从1989年美国疾病控制中心(CDC)的Bradley等首次报道从NANB肝炎病毒感染的黑猩猩的血液及肝脏中克隆了NANBH相关的病毒基因片段，即著名的5-1-1片段。这一片段被认为是丙型肝炎的病原的基因片段，故将其命名为丙型肝炎病毒(HCV)[1]。自此，拉开了寻找新型肝炎致病因子的序幕。1990年，这一研究小组从病毒的基因克隆入手，克隆了肠道传播的非甲非乙型肝炎的病毒基因片段[2]。但是，在排除上述五种肝炎病毒感染、巨细胞病毒、EB病毒感染外，约有10%～20%的病毒性肝炎病人病因不明，提示标志肝炎的字母符号还需扩展[3，5]。1996年，Leary和Linnen等人[6，7]分别发现了HGV/GBV-C，并克隆和测定了全基因序列，但目前对HGV/GBV-C的致病性看法不同[12]。1997年10月，日本学者Nishizawa等[8]采用代表性差异技术，从一个输血后肝炎病人中克隆到一个500 bp的片段(N22)。通过分子流行病学研究，证实N22与输血后肝炎有高度特异性。同年，Okamoto等[9]测定了TTV全基因序列，首次系统地揭示了TTV的基本特征。至此，NANBH的病原学研究取得了突破性进展。
, http://www.100md.com
TTV与已知的动物单股DNA病毒相似的有圆环副链DNA病毒(圆环病毒科如鸡贫血病毒)，线状细小病毒科(如人细小病毒HPV B19，腺联病毒AAV)。Okamoto等人的资料显示，TTV是一个3.7 kb的无包膜的单股DNA病毒，可能属于细小病毒科。TTV含两个开放读码框架(ORF)、ORF1位于该基因组的589-2 898位核苷酸，编码770个氨基酸，其N端是富含精氨酸的高亲水区；ORF2位于107-712位核苷酸，编码202个氨基酸。其基因全长3 739个核苷酸，其中A占31%(1163)，C占26%(954)，G占23%(842)，T占21%(780)，有12个TATA序列，两个多腺苷酸化信号(AATAAA)，这些特征与细小病毒相似。TTV在各种人群中分布极为广泛，在非甲～戊爆发型肝炎中，TTV阳性率为47%(9/19)；非甲～戊慢性肝病中，TTV阳性率为46%(41/90)，其中慢性肝炎47%(15/32)，肝硬化48%(19/40)，肝癌39%(7/18)；血友病人TTV阳性率为46%(26/57)，献血员病人TTV阳性率为12%(34/290)[8，9]。
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在非甲～庚型肝炎病人中，TTV阳性率为43%(48/112)，甲～戊型肝炎病人中，TTV阳性率为5.3%(9/270)，ALT升高的献血员中，TTV的阳性率为34.6%(9/26)，ALT正常的献血员中为16.8%(28/166)[10，11]。可见TTV与非甲～庚型肝炎以及肝功能异常有密切关系。
Okamoto等[9]根据78个TTV部分序列分析结果，将序列之间的差异达30%分为两群，G1群有76个分离株，G2群有2个分离株；序列之间差异在10%～15%分为亚群，分别为G1a、G1b和G2a、G2b。这些资料提示，TTV可能存在不同的基因型和变异株。我们测定的北京地区TTV全基因序列，全长3 739个核苷酸，有2个开放读码框架(ORF)。ORF1(nt 589-2902)和ORF2(nt 107-715)分别编码770和202个氨基酸。两端为非编码区，5′端3′端分别为106和837 bp。基因组中G+C占47.9%(G 22.5%，C 25.4%)，A+T占52.1%(A 31.2%，T 20.9%)。与日本TTV分离株(AF008304)全序列比较，两者之间的核苷酸和氨基酸同源性都超过95%，基因变异甚小，可能属于同一基因型。有关TTV的起源、分型和基因变异情况，还需更多的全序列比较研究。
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我们对16例TTV PCR和斑点杂交均阳性的非甲～庚型肝炎病人的临床资料总结表明，此型肝炎的临床特点为：症状轻，黄疸轻微，以单相血清转氨酶轻、中度增高为主，病程稍长，少数病人病程可超过两年，血清转氨酶可有波动。TTV传播方式是以输血传播为主，还是以肠道传播为主，是否属于肠道传染性肝炎病毒，以及TTV在人体的分布，如TTV在外周血单核细胞(PBMC)和肝组织的感染和复制情况等，有待于进一步通过临床分子流行病学调查及原子杂交和原位PCR技术对TTV的临床致病机理进行研究。
作者单位：何忠平(100011，北京，北京地坛医院病毒研究中心)
张启云(100011，北京，北京地坛医院病毒研究中心)
彭国爱(100011，北京，北京地坛医院病毒研究中心)
崔振宇(100011，北京，北京地坛医院病毒研究中心)
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周育森(军事医学科学院微生物流行病学研究所11室)
王海涛(军事医学科学院微生物流行病学研究所11室)
参考文献
1 Choo QL,Kuo G, Weiner AJ, et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science, 1989, 244: 359-365.
2 Reyes GR, Purdy MA, Kim JP, et al. Isolation of a cDNA from the virus responsible for enterically transmitted non-A, non B hepatitis. Science, 1990, 247: 1335-40.
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3 Marcellin P. Chronic non-B, non-C hepatitis among blood donors assayed with HCV third generation test and polymerase chain reaction. J Hepatol,1993,19:167-72.
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5 Sallie R. Hepatitis C and E in non-A, non-B fulminant hepatic failure. J Med Virol, 1994, 580-586.
6 Leary TP, Muerhoff SA, Simons JN, et al. Sequence and genomic organization of GBV-C:A novel member of the flaviviridae associated with human non A-E hepatitis. J Med Virol, 1996,48:60-7.
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