HIV-1型中国株E、B亚型gag基因的克隆与表达
HIV-1型中国株E、B亚型gag基因的克隆与表达
张洪涛 邵一鸣 肖瑶 潘品良 季阳
摘 要 目的 克隆和表达人免疫缺陷病毒(HIV)Ⅰ型中国株E、B亚型代表株的结构基因gag。方法 在分子流行病学调查的基础上，选择1份经部分gp120基因测序判定为E亚型和1份经部分gp120基因测序判定为B亚型的代表性样品，利用套式聚合酶链反应(PCR)，扩增外周血中的前病毒，获得了结构基因gag全长片断，并先后克隆到plin8Pr55和pFastBacl载体中，我们首次克隆到全长的中国株E亚型gag基因。采用双脱氧链末端终止法测定全部DNA序列。采用昆虫细胞-杆状病毒表达系统，构建了中国HIV-1 gag基因的杆状病毒表达质粒，得到了表达HIV-1E和B亚型gag的重组杆状病毒。结果 克隆到的E、B亚型gag基因具有完整的阅读框架，无大的缺失和插入，gag重组杆状病毒感染昆虫细胞表达了由gag形成的病毒样颗粒，并分泌到上清中，Western blot显示感染的昆虫细胞表达相应的gag基因。超薄电镜显示用gag基因的重组昆虫杆状病毒感染昆虫细胞可形成病毒样颗粒，这些颗粒为空心的大约100 nm颗粒样物定位在胞内，明显不同于昆虫杆状病毒本身形成的颗粒。结论 克隆到的E、B亚型代表株的gag基因具有完整的结构和功能，我们得到了针对我国HIV-1流行株的病毒样颗粒候选疫苗抗原。
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关键词：HIV-1 基因,gag 克隆，病毒 聚合酶链反应
在分子流行病学调查的基础上，我们克隆到中国艾滋病毒E、B亚型代表株的结构基因gag，为疫苗研制而设计的克隆路线是从未经培养的HIV-1阳性的外周血中直接扩增全长的gag，而以往的文献多集中于从培养病毒中克隆全长的gag和gp120基因[1～3]。有文献[1～3]表明，不论是从cDNA还是从前病毒DNA克隆获得的HIV-1的全长基因有一部分是缺陷的[2，3]，因此，有必要选择合适的表达系统来表达所克隆的基因以初步判定所克隆的基因是否完整或缺陷。我们采用昆虫细胞-杆状病毒表达系统，构建了中国HIV-1 gag基因的杆状病毒表达质粒，并利用GIBCO公司的Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，得到了表达HIV-1E和B亚型gag的重组杆状病毒。gag重组杆状病毒感染昆虫细胞表达了由gag蛋白形成的病毒样颗粒，并分泌到上清中。
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1 材料和方法
1.1 试剂及标本来源 HIV-1阳性外周血为1996年分子流行病学调查收集的全血样品。1例全血样品取自广东，编号为GD008；有1例取自河南，编号为Hen48。经Env外膜蛋白的部分测序(C2-V3)，前1例判定为E亚型，后1例判定为B亚型。使用Qiqen公司QiaAmo Blood试剂提取细胞DNA，Taq酶及PCR试剂购自华美生物制品公司。质粒pFstBacl、CellFectin、致敏菌DH10Bac(含有杆状病毒基因组的大质粒-Bacmid及转座辅助质粒)均购自GIBCO公司。plin8Pr55为含有HBX2gag基因的pUC18载体的衍生质粒，为参比实验室保存。T-easy Vector、dNTP、T4DNA连接酶、限制性内切酶和SP6、T7测序引物购自Promega公司。昆虫细胞株Sf9(Spodoptera frugiperida)和核多角体野毒株(AcMNPV)为参比实验室保存。昆虫细胞用含10%的TC-100培养液或Sf900-Ⅱ无血清培养液(购自GIBCO公司)于27℃孵箱培养。HIV-1阳性血清为本室保存。HRP标记的羊抗人IgG购自同正生物制品公司。
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1.2 克隆策略及引物设计 gag克隆引物(内侧引物)的5′端引入限制性内切酶对(XbaⅠ/SalⅠ)以便于定向克隆。引物及其序列如下：GagL，在HBX2定位687-706，5′-CGACGCAGGACTCGGCTTGC-3′；pol b,在HBX2定位2577～2593，5′CCTGGCTTAATTTAC-3′；Gag-1，在HBX2定位789～807，5′-GATACTCTAGAATTCGCCGCCACCATGGGTGC-GAGAGCGTCA-3′；QP6，在HBX2定位2481～2494，5′-GCTCTAGATCGTCGACAGGTGTAG-GTCCTAC-3′。
1.3 PCR反应及产物的克隆 采用套式PCR法扩增HIV-1 gag全长基因，第1次扩增取5 μl PBMCs作为DNA模板，第2次扩增取5μl第1次扩增的产物作为模板。两次扩增反应条件相同，第一个循环为94℃ 30 s；94℃ 30 s，55℃，30 s，72℃2 min，共30个循环。最后72℃延伸4 min。扩增HIV-1全长gag，Gag L/pol b为外侧引物，Gag-1/QP6为内侧引物，扩增反应体系为50 μl。gag基因的PCR产物经XbaⅠ和SalⅠ双酶切后，用T4DNA连接酶连接将回收片段连接于XbaⅠ和SalⅠ双酶切处理的plin 8Pr55载体，用连接产物转化DH5α感受态细菌，快提转化子的质粒DNA，经酶切鉴定挑选重组子。
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1.4 测序策略 将gag基因重新克隆到T-easy Vector上，以质粒为模板，采用SP6、T7测序引物测其两端，并在gag基因内部设计不同的引物测序(sk40，在HBX2定位1673～1652，5′-CCTTGTCTTATGTCCA-3′；gag-g；在HBX2定位152-2167 5′-CTGGTGGGGCTGTTGG-3′)
1.5 基因序列的测定 采用Plus Minipreps DNA Purification Systems提取质粒DNA作为测序模板，以不同的引物(见1.4)，采用掺入荧光标记PCR测序试剂盒进行测序反应，用ABI377测序仪测定序列。
1.6 基因序列的分析 用DNA、DNASIS及GCG软件进行序列的编辑、校对、全基因序列的连接、对应氨基酸的翻译和序列间的比较，国际参考序列下载于美国Los Alamos HIV序列数据库。
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1.7 gag系列杆状病毒表达质粒的构建 将gag、基因片段用EcoRⅠ和SalⅠ从克隆载体上酶切下，回收纯后分别克隆到杆状病毒表达质粒pFastBacl的EcoRⅠ/SalⅠ位点，从而得到相应的中国株gag系列杆状病毒表达质粒。
1.8 重组杆状病毒的构建及PCR鉴定 按Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的操作程序进行。
1.9 重组的Bacmid转染昆虫细胞 按照GIBCO公司Bac-to-Bac系统说明进行。
1.10 重组HIV-1蛋白的表达和检测 用重组的杆状病毒感染对数生长期的Sf9细胞，72 h后分别收集上清和细胞，取部分上清加2×SDS-PAGE上样缓冲液，100℃5 min，进行SDS-PAGE电泳。细胞悬浮于10倍的预冷的裂解液TNE-Triton (10 mmol/L Tris-Cl, pH8.0; 1 mmol/L EDTA; 150 mmol/L NaCl; 0.2% Triton-X100)，低温裂解30 min，离心取上清用作SDS-PAGE电泳分析。将上述SDS-PAGE凝胶分离的蛋白电转移到硝基纤维素膜上，用HIV-1阳性血清、HRP标记的羊抗入IgG作Western blot分析。
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1.11 重组HIV-1病毒样颗粒的形态学观察 用重组的杆状病毒感染Sf9细胞，48 h后离心收集细胞，用4%的戊二醛-PBS溶液4℃固定后，经组织学处理制作电镜超薄切片，进行电镜观察。
2 结果
2.1 中国HIV-1毒株gag基因的PCR扩增及克隆gag基因重组质粒的构建 见图1。克隆质粒的限制性内切酶分析见图2。
图1 gag基因克隆质粒的构建
Fig.1 Process of constructing plasmid of gag gene clones
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图2 重组质粒的限制性内切酶分析
Fig.2 Restriction endonuclease analysis of recombinant plasmids
2.2 HIV-1 gag系列杆状病毒表达质粒的构建 为构建表达上述HIV-1 gag的病毒颗粒样抗原的重组杆状病毒(见图3)，用EcoRⅠ和SalⅠ从克隆载体上切下来的gag，回收纯化后分别连接到杆状病毒表达质粒pFastBacl的EcoRⅠ/SalⅠ位点上，转化DH5α致敏菌，快速小量制备转化子，从而得到相应的中国株gag系列杆状病毒表达质粒。
图3 gag基因杆状病毒表达质粒的构建
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Fig.3 Construction of baculovirus expression plasmids of HIV-1 gag gene
2.3 重组HIV-1 gag蛋白在昆虫细胞中的表达 用重组的gag杆状病毒感染对数生长期的Sf9细胞，72 h后分别收集上清，经SDS-PAGE电泳，然后将SDS-PAGE凝胶分离的蛋白电转移到硝酸纤维素膜上，用HIV-1阳性血清、HRP标记的羊抗人IgG作Western-blot分析，检测到相对分子质量为55 000的HIV-1阳性抗原条带。
2.4 重组HIV-1病毒样颗粒的形态学观察 用上述重组的杆状病毒感染Sf9细胞，48 h收集细胞，用4%的戊二醛-PBS溶液4℃固定后，经组织学处理制作电镜超薄切片，电镜观察发现，gag重组杆状病毒感染可以观察到病毒样颗粒(图4)。
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1：不成熟的病毒样颗粒(×31 000)； 2：正常细胞对照(×4 400)； 3：野生型杆状病毒(×44 004)； 4：不成熟的病毒样颗粒(×4 400)
图4 HIV-1病毒样颗粒的超薄切片电镜观察
Fig.4 EM of Sf9 insect cell infected with recombinant baculovirus
1: Immature intracellular VLPs (×31 000). 2: Sf9 cellas control(×4 400). 3: Wild type baculovirus(×4 400). 4: Immature VLPs(×4 400)
4 讨论
早在80年代中期，就有“培养病毒即干扰病毒”的论断，而以往的文献多集中于从培养病毒中克隆全长的gag和gp120基因[3～5]，我们成功地从未经培养的HIV-1阳性的外周血中直接扩增并克隆到全长的gag或许能更真实地得到在体内HIV-1亚群的优势株。克隆到的E亚型代表株的gag基因长度为1 497个核苷酸，编码499个氨基酸，克隆到的B亚型gag基因长度为1 503个核苷酸，编码501个氨基酸，gag基因具有完整的阅读框架，无大的缺失和插入。有文献报道插入和缺失主要发生在p17、p6和p7，而p24长度比较保守。我们所克隆到的E亚型gag基因仅在p6上有1次1个氨基酸残基的缺失和1次1个氨基酸残基的插入；我们所克隆到的B亚型gag基因未见缺失和插入。从理论上讲，所克隆到的E、B亚型gag基因具有完整的阅读框架和功能性区域，可用于E、B亚型构建病毒样颗粒疫苗载体。
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感染正常人的HIV-1病毒颗粒内部为核蛋白颗粒，外包绕了含有外膜蛋白(gp120)和跨膜蛋白(gp41)的脂质双层膜，gp120和gp41通过非共价键相互作用相连，包绕的脂质双层膜来源于感染的细胞。成熟的病毒颗粒的核心骨架包括两拷贝的病毒基因组RNA和相关的tRNA分子及成熟的gag和pol的蛋白产物。已有资料表明，gag的MA与脂质双层膜的内层相连，gag的CA形成病毒核蛋白复合物的结构核心，gag的NC蛋白选择性地结合病毒基因组RNA，Vpr通过与p6作用而加入到颗粒中；宿主细胞的Cyclophilin A通过与CA作用而加入到颗粒中，Cyclophilin A与病毒的生产性感染有关[4]。根据gag基因的自装配功能[4，5]，我们用已克隆到的具有完整阅读框架的E及B亚型的HIV-1代表株的gag基因构建了病毒样颗粒候选疫苗，用昆虫细胞-杆状病毒表达系统成功地表达HIV-1中国株A、B亚型的gag基因，表达产物的相对分子质量大约在55 000左右。
以中国流行株HIV-1的E、B亚型的gag基因赋予所表达的产物以稳定性、颗粒性。本文对重组的HIV-1的gag基因自装配为病毒样颗粒进行了电镜观察，观察到了重组的gag基因在细胞膜上及胞内液泡膜上组装成病毒样颗粒，这种颗粒是一种大约100 nm大小的空心样结构。这种颗粒缺乏对应的由gag的NC蛋白选择性地结合病毒基因组RNA，因此不具有感染性，但具有较好的安全性而且作为包膜内抗原，而且作为包膜内抗原，gag基因产物上有T和B细胞决定簇[6，7]。同时在重组的昆虫杆状病毒感染的昆虫细胞中看到定位于核内的杆状病毒，它的形态、大小明显不同与非感染性的病毒样颗粒。如同真正的HIV-1颗粒一样，病毒样颗粒出胞后必然带有宿主的脂质双层膜。所带的昆虫细胞的脂质双层膜对人体的安全性还是个未知数。使用昆虫表达系统有它的优点，昆虫细胞可以悬浮培养，利于大规模制备。
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我们的研究也为以后对HIV-1的gag基因基因的生物学功能研究和诊断试剂的开发打下基础。
作者单位：张洪涛(610081 成都，中国医学科学院输血研究所)
季阳(610081 成都，中国医学科学院输血研究所)
邵一鸣(卫生部艾滋病预防与控制中心)
肖瑶(卫生部艾滋病预防与控制中心)
潘品良(卫生部艾滋病预防与控制中心)
参考文献
1，Gao F, Morrison SG, Robertson D, et al.. Molecular cloning and analysis of functional envelope genes from human immunodeficiency virus type 1 sequence subtype A through G. J Virol, 1996, 70:1651-1657.
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2，Goman CR, Fernandez JR, Iglesias E, et al.. Complete DNA sequence of the gene encoding the external glycoprotein (gp120) from a Cuban HIV Type 1 isolate. AIDS Res Human Retroviruses, 1996, 12:533-535.
3，Douglas NW, Knight AI, Hayhurst A, et al.. An efficient method for the rescue and analysis of functional HIV-1 env genes: evidence for recombination in the vicinity of the tat/rev splice site. AIDS, 1996, 10:39-46.
4，Wills JW, Craven RC. Form, function, and use of retroviral Gag proteins. AIDS, 1991, 5:639-654.
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5，Royer M, Hong SS, Gay B, et al. Expression and extracellular release of human immunodeficiency virus type 1 gag precursors by recombinant baculovirus infected cells. J Virol, 1992, 66: 3230-3235.
6，Nixon DF, Townsend AR, Elvin JG, et al. HIV-1 gag specific cytotoxic T-lymphocytes defined with recombinant vaccinia virus and synthetic peptides. Nature, 1988, 336: 484-487.
7，Papsidero LD, Sheu M, Ruscetti F W, et al. Human immunodeficiency virus type 1 neutralizing monoclonal antibodies which react with p17 core protein: characterization and epitope mapping. J Virol, 1989, 63: 267-272., 百拇医药
张洪涛 邵一鸣 肖瑶 潘品良 季阳
摘 要 目的 克隆和表达人免疫缺陷病毒(HIV)Ⅰ型中国株E、B亚型代表株的结构基因gag。方法 在分子流行病学调查的基础上，选择1份经部分gp120基因测序判定为E亚型和1份经部分gp120基因测序判定为B亚型的代表性样品，利用套式聚合酶链反应(PCR)，扩增外周血中的前病毒，获得了结构基因gag全长片断，并先后克隆到plin8Pr55和pFastBacl载体中，我们首次克隆到全长的中国株E亚型gag基因。采用双脱氧链末端终止法测定全部DNA序列。采用昆虫细胞-杆状病毒表达系统，构建了中国HIV-1 gag基因的杆状病毒表达质粒，得到了表达HIV-1E和B亚型gag的重组杆状病毒。结果 克隆到的E、B亚型gag基因具有完整的阅读框架，无大的缺失和插入，gag重组杆状病毒感染昆虫细胞表达了由gag形成的病毒样颗粒，并分泌到上清中，Western blot显示感染的昆虫细胞表达相应的gag基因。超薄电镜显示用gag基因的重组昆虫杆状病毒感染昆虫细胞可形成病毒样颗粒，这些颗粒为空心的大约100 nm颗粒样物定位在胞内，明显不同于昆虫杆状病毒本身形成的颗粒。结论 克隆到的E、B亚型代表株的gag基因具有完整的结构和功能，我们得到了针对我国HIV-1流行株的病毒样颗粒候选疫苗抗原。
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关键词：HIV-1 基因,gag 克隆，病毒 聚合酶链反应
在分子流行病学调查的基础上，我们克隆到中国艾滋病毒E、B亚型代表株的结构基因gag，为疫苗研制而设计的克隆路线是从未经培养的HIV-1阳性的外周血中直接扩增全长的gag，而以往的文献多集中于从培养病毒中克隆全长的gag和gp120基因[1～3]。有文献[1～3]表明，不论是从cDNA还是从前病毒DNA克隆获得的HIV-1的全长基因有一部分是缺陷的[2，3]，因此，有必要选择合适的表达系统来表达所克隆的基因以初步判定所克隆的基因是否完整或缺陷。我们采用昆虫细胞-杆状病毒表达系统，构建了中国HIV-1 gag基因的杆状病毒表达质粒，并利用GIBCO公司的Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，得到了表达HIV-1E和B亚型gag的重组杆状病毒。gag重组杆状病毒感染昆虫细胞表达了由gag蛋白形成的病毒样颗粒，并分泌到上清中。
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1 材料和方法
1.1 试剂及标本来源 HIV-1阳性外周血为1996年分子流行病学调查收集的全血样品。1例全血样品取自广东，编号为GD008；有1例取自河南，编号为Hen48。经Env外膜蛋白的部分测序(C2-V3)，前1例判定为E亚型，后1例判定为B亚型。使用Qiqen公司QiaAmo Blood试剂提取细胞DNA，Taq酶及PCR试剂购自华美生物制品公司。质粒pFstBacl、CellFectin、致敏菌DH10Bac(含有杆状病毒基因组的大质粒-Bacmid及转座辅助质粒)均购自GIBCO公司。plin8Pr55为含有HBX2gag基因的pUC18载体的衍生质粒，为参比实验室保存。T-easy Vector、dNTP、T4DNA连接酶、限制性内切酶和SP6、T7测序引物购自Promega公司。昆虫细胞株Sf9(Spodoptera frugiperida)和核多角体野毒株(AcMNPV)为参比实验室保存。昆虫细胞用含10%的TC-100培养液或Sf900-Ⅱ无血清培养液(购自GIBCO公司)于27℃孵箱培养。HIV-1阳性血清为本室保存。HRP标记的羊抗人IgG购自同正生物制品公司。
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1.2 克隆策略及引物设计 gag克隆引物(内侧引物)的5′端引入限制性内切酶对(XbaⅠ/SalⅠ)以便于定向克隆。引物及其序列如下：GagL，在HBX2定位687-706，5′-CGACGCAGGACTCGGCTTGC-3′；pol b,在HBX2定位2577～2593，5′CCTGGCTTAATTTAC-3′；Gag-1，在HBX2定位789～807，5′-GATACTCTAGAATTCGCCGCCACCATGGGTGC-GAGAGCGTCA-3′；QP6，在HBX2定位2481～2494，5′-GCTCTAGATCGTCGACAGGTGTAG-GTCCTAC-3′。
1.3 PCR反应及产物的克隆 采用套式PCR法扩增HIV-1 gag全长基因，第1次扩增取5 μl PBMCs作为DNA模板，第2次扩增取5μl第1次扩增的产物作为模板。两次扩增反应条件相同，第一个循环为94℃ 30 s；94℃ 30 s，55℃，30 s，72℃2 min，共30个循环。最后72℃延伸4 min。扩增HIV-1全长gag，Gag L/pol b为外侧引物，Gag-1/QP6为内侧引物，扩增反应体系为50 μl。gag基因的PCR产物经XbaⅠ和SalⅠ双酶切后，用T4DNA连接酶连接将回收片段连接于XbaⅠ和SalⅠ双酶切处理的plin 8Pr55载体，用连接产物转化DH5α感受态细菌，快提转化子的质粒DNA，经酶切鉴定挑选重组子。
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1.4 测序策略 将gag基因重新克隆到T-easy Vector上，以质粒为模板，采用SP6、T7测序引物测其两端，并在gag基因内部设计不同的引物测序(sk40，在HBX2定位1673～1652，5′-CCTTGTCTTATGTCCA-3′；gag-g；在HBX2定位152-2167 5′-CTGGTGGGGCTGTTGG-3′)
1.5 基因序列的测定 采用Plus Minipreps DNA Purification Systems提取质粒DNA作为测序模板，以不同的引物(见1.4)，采用掺入荧光标记PCR测序试剂盒进行测序反应，用ABI377测序仪测定序列。
1.6 基因序列的分析 用DNA、DNASIS及GCG软件进行序列的编辑、校对、全基因序列的连接、对应氨基酸的翻译和序列间的比较，国际参考序列下载于美国Los Alamos HIV序列数据库。
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1.7 gag系列杆状病毒表达质粒的构建 将gag、基因片段用EcoRⅠ和SalⅠ从克隆载体上酶切下，回收纯后分别克隆到杆状病毒表达质粒pFastBacl的EcoRⅠ/SalⅠ位点，从而得到相应的中国株gag系列杆状病毒表达质粒。
1.8 重组杆状病毒的构建及PCR鉴定 按Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的操作程序进行。
1.9 重组的Bacmid转染昆虫细胞 按照GIBCO公司Bac-to-Bac系统说明进行。
1.10 重组HIV-1蛋白的表达和检测 用重组的杆状病毒感染对数生长期的Sf9细胞，72 h后分别收集上清和细胞，取部分上清加2×SDS-PAGE上样缓冲液，100℃5 min，进行SDS-PAGE电泳。细胞悬浮于10倍的预冷的裂解液TNE-Triton (10 mmol/L Tris-Cl, pH8.0; 1 mmol/L EDTA; 150 mmol/L NaCl; 0.2% Triton-X100)，低温裂解30 min，离心取上清用作SDS-PAGE电泳分析。将上述SDS-PAGE凝胶分离的蛋白电转移到硝基纤维素膜上，用HIV-1阳性血清、HRP标记的羊抗入IgG作Western blot分析。
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1.11 重组HIV-1病毒样颗粒的形态学观察 用重组的杆状病毒感染Sf9细胞，48 h后离心收集细胞，用4%的戊二醛-PBS溶液4℃固定后，经组织学处理制作电镜超薄切片，进行电镜观察。
2 结果
2.1 中国HIV-1毒株gag基因的PCR扩增及克隆gag基因重组质粒的构建 见图1。克隆质粒的限制性内切酶分析见图2。
图1 gag基因克隆质粒的构建
Fig.1 Process of constructing plasmid of gag gene clones
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图2 重组质粒的限制性内切酶分析
Fig.2 Restriction endonuclease analysis of recombinant plasmids
2.2 HIV-1 gag系列杆状病毒表达质粒的构建 为构建表达上述HIV-1 gag的病毒颗粒样抗原的重组杆状病毒(见图3)，用EcoRⅠ和SalⅠ从克隆载体上切下来的gag，回收纯化后分别连接到杆状病毒表达质粒pFastBacl的EcoRⅠ/SalⅠ位点上，转化DH5α致敏菌，快速小量制备转化子，从而得到相应的中国株gag系列杆状病毒表达质粒。
图3 gag基因杆状病毒表达质粒的构建
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Fig.3 Construction of baculovirus expression plasmids of HIV-1 gag gene
2.3 重组HIV-1 gag蛋白在昆虫细胞中的表达 用重组的gag杆状病毒感染对数生长期的Sf9细胞，72 h后分别收集上清，经SDS-PAGE电泳，然后将SDS-PAGE凝胶分离的蛋白电转移到硝酸纤维素膜上，用HIV-1阳性血清、HRP标记的羊抗人IgG作Western-blot分析，检测到相对分子质量为55 000的HIV-1阳性抗原条带。
2.4 重组HIV-1病毒样颗粒的形态学观察 用上述重组的杆状病毒感染Sf9细胞，48 h收集细胞，用4%的戊二醛-PBS溶液4℃固定后，经组织学处理制作电镜超薄切片，电镜观察发现，gag重组杆状病毒感染可以观察到病毒样颗粒(图4)。
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1：不成熟的病毒样颗粒(×31 000)； 2：正常细胞对照(×4 400)； 3：野生型杆状病毒(×44 004)； 4：不成熟的病毒样颗粒(×4 400)
图4 HIV-1病毒样颗粒的超薄切片电镜观察
Fig.4 EM of Sf9 insect cell infected with recombinant baculovirus
1: Immature intracellular VLPs (×31 000). 2: Sf9 cellas control(×4 400). 3: Wild type baculovirus(×4 400). 4: Immature VLPs(×4 400)
4 讨论
早在80年代中期，就有“培养病毒即干扰病毒”的论断，而以往的文献多集中于从培养病毒中克隆全长的gag和gp120基因[3～5]，我们成功地从未经培养的HIV-1阳性的外周血中直接扩增并克隆到全长的gag或许能更真实地得到在体内HIV-1亚群的优势株。克隆到的E亚型代表株的gag基因长度为1 497个核苷酸，编码499个氨基酸，克隆到的B亚型gag基因长度为1 503个核苷酸，编码501个氨基酸，gag基因具有完整的阅读框架，无大的缺失和插入。有文献报道插入和缺失主要发生在p17、p6和p7，而p24长度比较保守。我们所克隆到的E亚型gag基因仅在p6上有1次1个氨基酸残基的缺失和1次1个氨基酸残基的插入；我们所克隆到的B亚型gag基因未见缺失和插入。从理论上讲，所克隆到的E、B亚型gag基因具有完整的阅读框架和功能性区域，可用于E、B亚型构建病毒样颗粒疫苗载体。
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感染正常人的HIV-1病毒颗粒内部为核蛋白颗粒，外包绕了含有外膜蛋白(gp120)和跨膜蛋白(gp41)的脂质双层膜，gp120和gp41通过非共价键相互作用相连，包绕的脂质双层膜来源于感染的细胞。成熟的病毒颗粒的核心骨架包括两拷贝的病毒基因组RNA和相关的tRNA分子及成熟的gag和pol的蛋白产物。已有资料表明，gag的MA与脂质双层膜的内层相连，gag的CA形成病毒核蛋白复合物的结构核心，gag的NC蛋白选择性地结合病毒基因组RNA，Vpr通过与p6作用而加入到颗粒中；宿主细胞的Cyclophilin A通过与CA作用而加入到颗粒中，Cyclophilin A与病毒的生产性感染有关[4]。根据gag基因的自装配功能[4，5]，我们用已克隆到的具有完整阅读框架的E及B亚型的HIV-1代表株的gag基因构建了病毒样颗粒候选疫苗，用昆虫细胞-杆状病毒表达系统成功地表达HIV-1中国株A、B亚型的gag基因，表达产物的相对分子质量大约在55 000左右。
以中国流行株HIV-1的E、B亚型的gag基因赋予所表达的产物以稳定性、颗粒性。本文对重组的HIV-1的gag基因自装配为病毒样颗粒进行了电镜观察，观察到了重组的gag基因在细胞膜上及胞内液泡膜上组装成病毒样颗粒，这种颗粒是一种大约100 nm大小的空心样结构。这种颗粒缺乏对应的由gag的NC蛋白选择性地结合病毒基因组RNA，因此不具有感染性，但具有较好的安全性而且作为包膜内抗原，而且作为包膜内抗原，gag基因产物上有T和B细胞决定簇[6，7]。同时在重组的昆虫杆状病毒感染的昆虫细胞中看到定位于核内的杆状病毒，它的形态、大小明显不同与非感染性的病毒样颗粒。如同真正的HIV-1颗粒一样，病毒样颗粒出胞后必然带有宿主的脂质双层膜。所带的昆虫细胞的脂质双层膜对人体的安全性还是个未知数。使用昆虫表达系统有它的优点，昆虫细胞可以悬浮培养，利于大规模制备。
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我们的研究也为以后对HIV-1的gag基因基因的生物学功能研究和诊断试剂的开发打下基础。
作者单位：张洪涛(610081 成都，中国医学科学院输血研究所)
季阳(610081 成都，中国医学科学院输血研究所)
邵一鸣(卫生部艾滋病预防与控制中心)
肖瑶(卫生部艾滋病预防与控制中心)
潘品良(卫生部艾滋病预防与控制中心)
参考文献
1，Gao F, Morrison SG, Robertson D, et al.. Molecular cloning and analysis of functional envelope genes from human immunodeficiency virus type 1 sequence subtype A through G. J Virol, 1996, 70:1651-1657.
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