人类IL-3受体α亚单位与小鼠AIC2B蛋白的相互作用
作者：张日 朱子玲 常伟荣 John F.DiPersio
单位：张日 朱子玲 常伟荣(江苏省血液研究所，苏州大学附属第一医院，苏州，215006)；John F.DiPersio(美国华盛顿大学医学院)
关键词：人IL-3受体；α亚单位；AIC2B；功能重建
苏州医学院学报001003 摘要 目的 探索人类IL-3受体(IL-3R)α亚单位与小鼠内源性AIC2B蛋白在诱导细胞增殖信号表达过程中的相互作用。方法 通过PCR扩增技术，构建了IL-3Rα亚单位胞浆域缺失突变子34、22和CD，然后将野生型和突变型IL-3Rα亚单位cDNA分别转染到含小鼠IL-3R基因表达的BaF3细胞，并检测了阳性转染子的增殖信号传导和酪氨酸磷酸化。结果 表达野生型hIL-3Rα/βc的BaF3阳性对照克隆在生理浓度hIL-3诱导后即可出现细胞增殖和胞浆信号蛋白βc、Jak2及Shc磷酸化；而含野生型IL-3Rα亚单位和AIC2B的BaF3细胞可出现高浓度hIL-3刺激的细胞增殖反应，但无信号传导分子的活化；共表达突变型IL-3Rα与AIC2B的BaF3细胞及未转染的BaF3细胞则对各种浓度的hIL-3刺激均无反应。结论 尽管hIL-3Rβc亚单位在hIL-3诱导的信号传导过程中担负关键作用，但小鼠内源性AIC2B也可与hIL-3Rα重建功能性hIL-3R，这种功能的表达需要hIL-3Rα完整受体分子的存在。
, 百拇医药
中图法分类号 R392.11
Interaction of the Human IL-3 Receptor α Subunit with the Murine AIC2B
Zhang Ri,Zhu Ziling,Chang Weirong, et al
(Jiangsu Institute of Hematology,The Fist Hospital Affiliated to Suzhou University,Suzhou,215006)
Abstract Objective To investigate the interaction of the human interleukin-3 receptor (hIL-3R) α subunit with the AIC2B protein of murine endogeneous IL-3R β sununit in reducing the expression of the proliferating signal.Mehtods The cytoplasmic deletion mutants(34,22 and CD) of hIL-3R α subunit were generated by PCR amplification technique. BaF3 cells which express mouse IL-3R were transfected with either wild-type or mutant hIL-3R α cDNA and hIL-3 stimulated proliferative signal transduction and tyrosine phosphorylation of the positive transfectants were examined.Results Cell proliferation and activation of the cytoplasmic β c、Jak2 and Shc proteins of BaF3 clone co-expressed hIL-3R α/β,as the postive contrast,could be induced by physiologic concerntration of hIL-3 and BaF3 cells expressed wild-type hIL-3R α clone could confer a growth response to high concerntration of hIL-3,but fail to activate β c、Jak2 and Shc proteins despite containing endogeneous AIC2B. Untransfected or transfected BaF3 clone expressed mutant hIL-3R α failed to proliferate and show ligand-induced tyrosine phosphorylation of above signal molecules in the presence of hIL-3 with various concerntration.Conclusions Human β c is critical for hIL-3 signaling,but hIL-3R α can reconstitute a functional receptor for hIL-3 with mouse endogeneous AIC2B protein and the entire structure of hIL-3R α is essential for the functional expression of this reconstitutive receptor.
, 百拇医药
Key words human IL-3 receptor;α subunit;AIC2B;functional reconstitution
人类白细胞介素-3(human interleukin-3,hIL-3)可以刺激早期多能造血祖细胞及其粒细胞、单核细胞、巨核细胞、嗜酸细胞、嗜碱细胞和肥大细胞等子代细胞的增殖、分化与成熟，其生物学效应乃是通过与细胞膜上hIL-3受体(hIL-3R)特异性结合所介导。完整的hIL-3R由α与β两个亚单位构成，α亚单位能与配体hIL-3以低亲和力方式结合，β亚单位尽管自身不能结合配体，但可与α亚单位共同组成与配体高亲和力结合的功能受体分子，同时具有传导刺激信号功能，同时，β亚单位也可被粒-巨噬细胞集落刺激因子受体(GM-R)和白细胞介素-5受体(IL-5R)的α亚单位所共享(称为共同β或βc)[1，2]。与hIL-3R不同的是，小鼠hIL-3R虽由α和β二个亚单位组成，但β亚单位则由二个密切关联的基因AIC2A和AIC2B组成，AIC2A可与小鼠IL-3Rα特异性结合，而AIC2B则与βc亚单位结构十分相似[2]，为了探索AIC2B是否也具有与hIL-3Rα重建功能性hIL-3R的能力，我们利用分子克隆与转基因技术，对hIL-3Rα亚单位与小鼠内源性AIC2B在协调介导细胞增殖信号方面的关系进行了研究，结果报道如下。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 主要试剂与细胞系 重组hIL-3和小鼠IL-3(mIL-3)及所用单抗购于UBI公司；各种培养基、G418、LipofectAMINE和有关生化试剂购于Gibco公司；配制细胞裂解液的主要试剂购于Boehringer公司；pMX和含NeoR基因的CMV载体购于Invitrogen公司；125I-IL-3购于NEN公司；ECL药盒购于Amersham公司；赖mIL-3生长的BaF3细胞生长于含2μg/L的mIL-3和10%FCS的RPMI1640培养基中，每周传代2次。
1.2 hIL-3Rα亚单位胞浆域突变子构建和基因转染 hIL-3Rα亚单位胞浆域共由53个氨基酸组成，按照胞浆域C末端保留的核苷酸数目，利用PCR扩增技术，构建了hIL-3Rα亚单位34、22和CD共3个突变子，使突变子34缺失胞浆C末端18个氨基酸、但保留了box1保守序列；突变子22既保留了胞浆域近膜端16个氨基酸，也保留了box1保守序列；突变子CD缺失胞浆尾端绝大部分氨基酸和box1结构，仅保留近膜端4个氨基酸；然后将突变型和野生型IL-3Rα的cDNA分别插入pMX载体，并与CMV载体在BaF3细胞中进行基因共转染；同时，设立野生型pMX/IL3-Rα和含βc的CMV-β基因共转染，用作阳性对照。上述转基因细胞经G418筛选后，通过同位素125I-IL-3配体结合检测，以获得仅含hIL-3Rα表达及hIL-3Rα/βc共表达的BaF3阳性克隆。
, http://www.100md.com
1.3 细胞增殖功能检测 取表达突变型和野生型hIL-3Rα表达及hIL-3Rα/β共表达的BaF3细胞，用1xPBS洗涤3次后，在24孔板上按每孔1×104/ml细胞数培养于含10%FCS的RPMI1640培养基中，添加不同浓度的hIL-3，每天计数细胞数。每实验点同设3孔，取均数作为结果。
1.4 蛋白质免疫沉淀与Western blot分析按照我们曾报道[3，4]的方法。
2 结果
2.1 hIL-3诱导的细胞增殖特性 未转染的BaF3细胞仅生长于含1～2μg/L mIL-3刺激的培养体系中，剥夺mIL-3后6小时即见细胞开始死亡，8～12h后可见细胞大量死亡，在各种浓度的hIL-3刺激下，该类细胞均不能生长；而含hIL-3Rα/β共表达的BaF3细胞，在1μg/LhIL-3刺激后，细胞即可见增殖；含野生型hIL-3Rα表达的BaF3克隆，在≥50μg/L浓度的hIL-3刺激后，也可见到细胞增殖，在hIL-3剂量达到100μg/L时生长达到最佳状态，此后剂量反应曲线进入平台状态。有趣的是，表达hIL-3Rα的3个突变子克隆34、22和CD，经各种浓度的hIL-3诱导，均未出现细胞增殖效应(见附图)。
, http://www.100md.com
附图 表达hIL-3R的BaF3细胞受hIL-诱导4天时的增殖反应(wt：野生型；mutants：突变型，包括34，22和CD；)
2.2 含hIL-3Rα或α/β表达的BaF3克隆的酪氨酸磷酸化 为了探讨AIC2B是否能传递由Jak2及Shc介导的hIL-3刺激信号，我们利用免疫沉淀与蛋白质印迹转移技术，发现hIL-3Rα/βc克隆在100μg/L hIL-3刺激5min后，分别可见相对分子质量为130×103的βc、相对分子质量为120×103的Jak2和由分子质量为46×103、52×103和66×103共3条区带组成的Shc表达；而仅表达野生型或突变型hIL-3Rα的BaF3克隆，则未见上述信号传导分子表达，即使将hIL-3浓度增加到2mg/L、刺激时间延长至60min，亦是如此。
3 讨论
, 百拇医药
我们通过在小鼠造血细胞和非造血细胞中重建人GM-R，均证实人βc对配体诱导的细胞增殖及胞浆信号传导分子βc、Jak2和Shc酪氨酸磷酸化必不可少[3，4]。由于小鼠β亚单位中的AIC2B与人βc有70%的序列同源性[2]，Kitamura等发现，由外源性AIC2B与hIL-3Rα共同组成人鼠杂交IL-3R分子，可出现对hIL-3诱导的细胞增殖效应[5]。然而，关于内源性AIC2B是否也能与hIL-3Rα协调介导增殖信号传导，以及这一过程是否受hIL-3Rα分子结构调节的问题，尚未见报道。BaF3为含mIL-3R功能分子表达的小鼠前B细胞系，借助其细胞具有内源性AIC2B表达的特性，我们通过PCR扩增和转基因技术，将编码野生型和突变型IL-3Rα亚单位及野生型βc的cDNA分别转染到BaF3细胞中，阳性转染子的功能检测显示，表达野生型hIL-3Rα/βc的BaF3克隆在1μg/L浓度的hIL-3诱导后即可出现细胞增殖和胞浆信号蛋白βc、Jak2及Shc磷酸化，而仅含野生型IL-3Rα亚单位的BaF3细胞在内源性AIC2B参与下，也可出现对≥50μg/L高浓度hIL-3刺激的细胞增殖反应，但无信号传导分子Jak2和Shc的活化，其原因似与下列因素有关：①细胞膜上重建的人鼠杂交受体数量不足；②由于AIC2B与βc序列不完全同源，导致人鼠杂交受体与hIL-3Rα/β功能受体的三维结构不同；③hIL-3Rα/AIC2B受体增殖信号传导的途径在Jak、Shc以外的通路。这些推测有待进一步证实。
, 百拇医药
通过X-线晶体衍射等技术证实，IL-3Rα含约290个氨基酸组成的细胞外区、20个氨基酸组成的跨膜区和53个氨基酸组成的短胞浆区，细胞外区主要担负配体结合功能，尽管胞浆近膜区含有酪氨酸残基位点，但胞浆区功能尚不明确，我们的研究结果发现，即使有内源性AIC2B分子存在，但表达胞浆突变型IL-3Rα的BaF3细胞对各种浓度的hIL-3刺激均无增殖反应，也无信号传导分子的磷酸化，提示hIL-3Rα亚单位与小鼠AIC2B蛋白协调介导细胞增殖效应需要α亚单位完整受体分子结构的存在。本课题部分受国家自然科学基金(39670277)和教育部留学回国人员基金(1997-832)资助
参考文献
1，Mire Sluis A,Page LA,Wadhwa M,et al.Evidence for a signaling role for the α chains of granulocyte-macrophagecolony-stimulating factor(GM-CSF),interleukin-3(IL-3),and IL-5 receptors∶divergent signaling pathways between GM-CSF/IL-3 and IL-5.Blood,1995,86∶2679
, http://www.100md.com
2，Miyajima A.Molecular structure of the IL-3,GM-CSF and IL-5 receptors. Int J Cell Cloning,1992,10∶126
3，张 日，冯一中，朱子玲，等.人粒-巨噬细胞集落刺激因子受体在NIH3T3细胞中的功能表达.中华血液学杂志，1999，20∶567
4，张 日，朱子玲，苏成海，等.人类GM-CSF受体生物学特性的研究.苏州医学院学报，1999，19∶751
5，Kitamura T,Miyajima A.Functional reconstitution of the human interleukin-3 receptor.Blood,1992,80∶84
(2000年9月5日收稿), 百拇医药
单位：张日 朱子玲 常伟荣(江苏省血液研究所，苏州大学附属第一医院，苏州，215006)；John F.DiPersio(美国华盛顿大学医学院)
关键词：人IL-3受体；α亚单位；AIC2B；功能重建
苏州医学院学报001003 摘要 目的 探索人类IL-3受体(IL-3R)α亚单位与小鼠内源性AIC2B蛋白在诱导细胞增殖信号表达过程中的相互作用。方法 通过PCR扩增技术，构建了IL-3Rα亚单位胞浆域缺失突变子34、22和CD，然后将野生型和突变型IL-3Rα亚单位cDNA分别转染到含小鼠IL-3R基因表达的BaF3细胞，并检测了阳性转染子的增殖信号传导和酪氨酸磷酸化。结果 表达野生型hIL-3Rα/βc的BaF3阳性对照克隆在生理浓度hIL-3诱导后即可出现细胞增殖和胞浆信号蛋白βc、Jak2及Shc磷酸化；而含野生型IL-3Rα亚单位和AIC2B的BaF3细胞可出现高浓度hIL-3刺激的细胞增殖反应，但无信号传导分子的活化；共表达突变型IL-3Rα与AIC2B的BaF3细胞及未转染的BaF3细胞则对各种浓度的hIL-3刺激均无反应。结论 尽管hIL-3Rβc亚单位在hIL-3诱导的信号传导过程中担负关键作用，但小鼠内源性AIC2B也可与hIL-3Rα重建功能性hIL-3R，这种功能的表达需要hIL-3Rα完整受体分子的存在。
, 百拇医药
中图法分类号 R392.11
Interaction of the Human IL-3 Receptor α Subunit with the Murine AIC2B
Zhang Ri,Zhu Ziling,Chang Weirong, et al
(Jiangsu Institute of Hematology,The Fist Hospital Affiliated to Suzhou University,Suzhou,215006)
Abstract Objective To investigate the interaction of the human interleukin-3 receptor (hIL-3R) α subunit with the AIC2B protein of murine endogeneous IL-3R β sununit in reducing the expression of the proliferating signal.Mehtods The cytoplasmic deletion mutants(34,22 and CD) of hIL-3R α subunit were generated by PCR amplification technique. BaF3 cells which express mouse IL-3R were transfected with either wild-type or mutant hIL-3R α cDNA and hIL-3 stimulated proliferative signal transduction and tyrosine phosphorylation of the positive transfectants were examined.Results Cell proliferation and activation of the cytoplasmic β c、Jak2 and Shc proteins of BaF3 clone co-expressed hIL-3R α/β,as the postive contrast,could be induced by physiologic concerntration of hIL-3 and BaF3 cells expressed wild-type hIL-3R α clone could confer a growth response to high concerntration of hIL-3,but fail to activate β c、Jak2 and Shc proteins despite containing endogeneous AIC2B. Untransfected or transfected BaF3 clone expressed mutant hIL-3R α failed to proliferate and show ligand-induced tyrosine phosphorylation of above signal molecules in the presence of hIL-3 with various concerntration.Conclusions Human β c is critical for hIL-3 signaling,but hIL-3R α can reconstitute a functional receptor for hIL-3 with mouse endogeneous AIC2B protein and the entire structure of hIL-3R α is essential for the functional expression of this reconstitutive receptor.
, 百拇医药
Key words human IL-3 receptor;α subunit;AIC2B;functional reconstitution
人类白细胞介素-3(human interleukin-3,hIL-3)可以刺激早期多能造血祖细胞及其粒细胞、单核细胞、巨核细胞、嗜酸细胞、嗜碱细胞和肥大细胞等子代细胞的增殖、分化与成熟，其生物学效应乃是通过与细胞膜上hIL-3受体(hIL-3R)特异性结合所介导。完整的hIL-3R由α与β两个亚单位构成，α亚单位能与配体hIL-3以低亲和力方式结合，β亚单位尽管自身不能结合配体，但可与α亚单位共同组成与配体高亲和力结合的功能受体分子，同时具有传导刺激信号功能，同时，β亚单位也可被粒-巨噬细胞集落刺激因子受体(GM-R)和白细胞介素-5受体(IL-5R)的α亚单位所共享(称为共同β或βc)[1，2]。与hIL-3R不同的是，小鼠hIL-3R虽由α和β二个亚单位组成，但β亚单位则由二个密切关联的基因AIC2A和AIC2B组成，AIC2A可与小鼠IL-3Rα特异性结合，而AIC2B则与βc亚单位结构十分相似[2]，为了探索AIC2B是否也具有与hIL-3Rα重建功能性hIL-3R的能力，我们利用分子克隆与转基因技术，对hIL-3Rα亚单位与小鼠内源性AIC2B在协调介导细胞增殖信号方面的关系进行了研究，结果报道如下。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 主要试剂与细胞系 重组hIL-3和小鼠IL-3(mIL-3)及所用单抗购于UBI公司；各种培养基、G418、LipofectAMINE和有关生化试剂购于Gibco公司；配制细胞裂解液的主要试剂购于Boehringer公司；pMX和含NeoR基因的CMV载体购于Invitrogen公司；125I-IL-3购于NEN公司；ECL药盒购于Amersham公司；赖mIL-3生长的BaF3细胞生长于含2μg/L的mIL-3和10%FCS的RPMI1640培养基中，每周传代2次。
1.2 hIL-3Rα亚单位胞浆域突变子构建和基因转染 hIL-3Rα亚单位胞浆域共由53个氨基酸组成，按照胞浆域C末端保留的核苷酸数目，利用PCR扩增技术，构建了hIL-3Rα亚单位34、22和CD共3个突变子，使突变子34缺失胞浆C末端18个氨基酸、但保留了box1保守序列；突变子22既保留了胞浆域近膜端16个氨基酸，也保留了box1保守序列；突变子CD缺失胞浆尾端绝大部分氨基酸和box1结构，仅保留近膜端4个氨基酸；然后将突变型和野生型IL-3Rα的cDNA分别插入pMX载体，并与CMV载体在BaF3细胞中进行基因共转染；同时，设立野生型pMX/IL3-Rα和含βc的CMV-β基因共转染，用作阳性对照。上述转基因细胞经G418筛选后，通过同位素125I-IL-3配体结合检测，以获得仅含hIL-3Rα表达及hIL-3Rα/βc共表达的BaF3阳性克隆。
, http://www.100md.com
1.3 细胞增殖功能检测 取表达突变型和野生型hIL-3Rα表达及hIL-3Rα/β共表达的BaF3细胞，用1xPBS洗涤3次后，在24孔板上按每孔1×104/ml细胞数培养于含10%FCS的RPMI1640培养基中，添加不同浓度的hIL-3，每天计数细胞数。每实验点同设3孔，取均数作为结果。
1.4 蛋白质免疫沉淀与Western blot分析按照我们曾报道[3，4]的方法。
2 结果
2.1 hIL-3诱导的细胞增殖特性 未转染的BaF3细胞仅生长于含1～2μg/L mIL-3刺激的培养体系中，剥夺mIL-3后6小时即见细胞开始死亡，8～12h后可见细胞大量死亡，在各种浓度的hIL-3刺激下，该类细胞均不能生长；而含hIL-3Rα/β共表达的BaF3细胞，在1μg/LhIL-3刺激后，细胞即可见增殖；含野生型hIL-3Rα表达的BaF3克隆，在≥50μg/L浓度的hIL-3刺激后，也可见到细胞增殖，在hIL-3剂量达到100μg/L时生长达到最佳状态，此后剂量反应曲线进入平台状态。有趣的是，表达hIL-3Rα的3个突变子克隆34、22和CD，经各种浓度的hIL-3诱导，均未出现细胞增殖效应(见附图)。
, http://www.100md.com
附图 表达hIL-3R的BaF3细胞受hIL-诱导4天时的增殖反应(wt：野生型；mutants：突变型，包括34，22和CD；)
2.2 含hIL-3Rα或α/β表达的BaF3克隆的酪氨酸磷酸化 为了探讨AIC2B是否能传递由Jak2及Shc介导的hIL-3刺激信号，我们利用免疫沉淀与蛋白质印迹转移技术，发现hIL-3Rα/βc克隆在100μg/L hIL-3刺激5min后，分别可见相对分子质量为130×103的βc、相对分子质量为120×103的Jak2和由分子质量为46×103、52×103和66×103共3条区带组成的Shc表达；而仅表达野生型或突变型hIL-3Rα的BaF3克隆，则未见上述信号传导分子表达，即使将hIL-3浓度增加到2mg/L、刺激时间延长至60min，亦是如此。
3 讨论
, 百拇医药
我们通过在小鼠造血细胞和非造血细胞中重建人GM-R，均证实人βc对配体诱导的细胞增殖及胞浆信号传导分子βc、Jak2和Shc酪氨酸磷酸化必不可少[3，4]。由于小鼠β亚单位中的AIC2B与人βc有70%的序列同源性[2]，Kitamura等发现，由外源性AIC2B与hIL-3Rα共同组成人鼠杂交IL-3R分子，可出现对hIL-3诱导的细胞增殖效应[5]。然而，关于内源性AIC2B是否也能与hIL-3Rα协调介导增殖信号传导，以及这一过程是否受hIL-3Rα分子结构调节的问题，尚未见报道。BaF3为含mIL-3R功能分子表达的小鼠前B细胞系，借助其细胞具有内源性AIC2B表达的特性，我们通过PCR扩增和转基因技术，将编码野生型和突变型IL-3Rα亚单位及野生型βc的cDNA分别转染到BaF3细胞中，阳性转染子的功能检测显示，表达野生型hIL-3Rα/βc的BaF3克隆在1μg/L浓度的hIL-3诱导后即可出现细胞增殖和胞浆信号蛋白βc、Jak2及Shc磷酸化，而仅含野生型IL-3Rα亚单位的BaF3细胞在内源性AIC2B参与下，也可出现对≥50μg/L高浓度hIL-3刺激的细胞增殖反应，但无信号传导分子Jak2和Shc的活化，其原因似与下列因素有关：①细胞膜上重建的人鼠杂交受体数量不足；②由于AIC2B与βc序列不完全同源，导致人鼠杂交受体与hIL-3Rα/β功能受体的三维结构不同；③hIL-3Rα/AIC2B受体增殖信号传导的途径在Jak、Shc以外的通路。这些推测有待进一步证实。
, 百拇医药
通过X-线晶体衍射等技术证实，IL-3Rα含约290个氨基酸组成的细胞外区、20个氨基酸组成的跨膜区和53个氨基酸组成的短胞浆区，细胞外区主要担负配体结合功能，尽管胞浆近膜区含有酪氨酸残基位点，但胞浆区功能尚不明确，我们的研究结果发现，即使有内源性AIC2B分子存在，但表达胞浆突变型IL-3Rα的BaF3细胞对各种浓度的hIL-3刺激均无增殖反应，也无信号传导分子的磷酸化，提示hIL-3Rα亚单位与小鼠AIC2B蛋白协调介导细胞增殖效应需要α亚单位完整受体分子结构的存在。本课题部分受国家自然科学基金(39670277)和教育部留学回国人员基金(1997-832)资助
参考文献
1，Mire Sluis A,Page LA,Wadhwa M,et al.Evidence for a signaling role for the α chains of granulocyte-macrophagecolony-stimulating factor(GM-CSF),interleukin-3(IL-3),and IL-5 receptors∶divergent signaling pathways between GM-CSF/IL-3 and IL-5.Blood,1995,86∶2679
, http://www.100md.com
2，Miyajima A.Molecular structure of the IL-3,GM-CSF and IL-5 receptors. Int J Cell Cloning,1992,10∶126
3，张 日，冯一中，朱子玲，等.人粒-巨噬细胞集落刺激因子受体在NIH3T3细胞中的功能表达.中华血液学杂志，1999，20∶567
4，张 日，朱子玲，苏成海，等.人类GM-CSF受体生物学特性的研究.苏州医学院学报，1999，19∶751
5，Kitamura T,Miyajima A.Functional reconstitution of the human interleukin-3 receptor.Blood,1992,80∶84
(2000年9月5日收稿), 百拇医药