甲胎蛋白信使核糖核酸(AFPmRNA)的检测方法及其临床意义
作者：蔡兵 鲁严 严承铨 吴鸣宇 唐建英
单位：无锡市第一人民医院，江苏无锡，214002
关键词：甲胎蛋白类RNA；肝癌
苏州医学院学报001013 摘要 目的 探讨AFPmRNA对诊断原发性肝癌的意义，并评估原发性肝癌的临床分期，预测转移倾向、预后和复发以及治疗。方法 建立并改进巢式逆转录多聚酶链反应(nested RT-PCR)检测外周静脉血肝癌细胞。结果 nested RT-PCR在1ml血中含有≥5个肝癌细胞时即可检测到AFPmRNA。22例原发性肝癌中18例血液标本检测到AFPmRNA，而对照组中均未检测到AFPmRNA。AFPmRNA的检出率与肝癌分期(TNM)、血清AFP浓度、肝内转移、门静脉癌栓、肿瘤大小及远处转移有明显联系(P<0.01)。结论 nested RT-PCR是一个稳定而又敏感的检测方法，AFPmRNA可作为定性诊断原发性肝癌的血液学指标，也可作为肝癌细胞转移的标志，并可判断肝癌临床分期、转移倾向、预后和复发。
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中图法分类号 R735.704
The Method and the Clinical Significance of Detecting AFPmRNA
Cai Bing,Lu Yan, Yan Chenquan
(Wuxi No.1 People's Hospital,Jiangsu Wuxi,214002)
Abstract Objective To research the clinical significance of AFPmRNA for diagnosing primary hepatocellular carcinoma,and to evaluate the clinical stages of primary hepatocellular carcinoma,to prognosticate metastases,prognosis,recurrence and to select the methods of therapy.Methods To establish and improve the method of nested retrotanscript polymerase chain reaction (RT-PCR) for detecting hepatic cancer cells in prepheral venous blood.Results The AFPmRNA can be detected in 1ml blood with five or more than five hepatic cancer cells using nested RT-PCR.The AFPmRNA is positive in 18 blood samples out of 22 cases,whereas it is negative in all control groups.The positive rate of AFPmRNA has a significant relationship with the hepatic cancer stages (TNM),the value of AFP in blood,intrahepatic metastases,the portal vein cancer cell thrombosis,the tumor size and the extrahepatic metastases (P<0.01).Conclusion Nested RT-PCR is a stable and a sensitive detecting method,AFPmRNA can be not only a hemologic sign of diagnosing primary hepatic cancer,but also a mark of the metastases,and can be using for eveluating the clinical stages,metastases trend,prognosis and recurrence of liver cancer.
, 百拇医药
Key words AFPmRNA;Hepatocellular carcinoma
甲胎蛋白(AFP)是原发性肝癌(HCC)的肿瘤标记物，但AFP的敏感性不高，且对肝癌的临床分期、转移倾向等缺乏指导意义。我们参照komeda等[1]方法，建立并改进了巢式逆转录多聚酶链反应(nested RT-PCR)，可敏感地检测出周围血中的AFPmRNA，探讨其在定性诊断HCC及判断预后和转移倾向中的意义，并指导临床不同的治疗方法。
1 实验资料
1.1 引物 AFP引物由北京医科大学细胞生物学教研室提供(经HPLC纯化)。外引物5′ACT GAA TCC AGA ACA CTG CAT AT-3′5′TGC AGT CAA TGC ATC TTT CAC CA-3′内引物5′TGG AAT AGC TTC CAT ATT GGA TC-3′5′AAG TGG CTT CTT CAA CAA ACT GG-3′
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引物设计在hAFP基因外显子1.2.3上，PCR产物片断为101bp。
1.2 细胞株 7402人肝癌细胞株购自上海细胞所，用于本实验敏感性测试。
1.3 周围血单核细胞(PMNS)的纯化 抽周围静脉血2ml、肝素抗凝，用淋巴细胞分离液(中科院血液学研究所，天津)密度梯度离心取得PMNS，根据kor和carr的报道，血中如有肝癌细胞将与PMNS分离在同一层。
1.4 PMNS的总RNA提取 选用Chomczynski和Saccki所描述的异硫氰酸胍(serva)产品-酚-氯仿一步法提取RNA方法从PMNS中提取总RNA，存-40℃待用。
1.5 RT-PCR 反转录和第一次PCR：应用第一链cDNA合成试剂盒(德国B.M产品)和外引物的下游，先将以上所提取的总RNA逆转成cDNA，然后加入上游引物及Taq-DNA聚合酶进行扩增。通过预试验：RT期间，鸟髓母细胞增生病毒(AmV)逆转录酶的终浓度为1×106μ/L，下游引物为1.05μmol/L时效果最佳；PCR反应时，当MgCl2，上游引物的终浓度分别为1.5mmol/L和0.52μmol/L时为最佳。58℃反转录30min，94℃变性2min，然后PCR扩增(94℃30s、50℃30s、72℃40s)共32个循环。第二次 PCR：50μl 反应体系中第一次PCR产物5μl，10×PCRBuffer5μl,dNTP 0.3mmol/L，内引物20pmol，Taq酶3μ，PCR扩增条件(94℃30s、52℃40s、72℃50s)共32个循环。
, 百拇医药
2%琼脂糖电泳(含EB)，紫外灯下判读。
1.6 实验敏感性测定 抽4份正常健康志愿者血2ml(预实验证实其周围血无AFPmRNA)，在PMNS纯化中用Hanks稀释血时，分别加入7402人HCC细胞5、10、102、103、104个，此后的PMNS纯化、总RNA提取及RT-PCR方法同前。
2 结果
2.1 敏感性 含10、102、103、104个肝癌细胞的2ml正常血中，可以检测到AFPmRNA，含5个肝癌细胞的2ml血中未能检出，可见，若1ml血中含有≥5个肝癌细胞即可检出AFPmRNA。
2.2 用本法检测临床22例原发性肝癌(A组、实验组)，对照组 为肝硬化11例(B组)，转移性肝癌9例(C组)，非肝癌肿瘤15例(D组)，健康志愿者14例(E组)。22例HCC患者中有18例检测到AFPmRNA(81.8%)，T1-4均能检出(按TNM分期)[2]。AFPmRNA检出率与肝癌分期的关系见附表。对照组血液中未检出AFPmRNA。
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HCC患者临床参数与AFPmRNA检出率的关系见附表。附表 AFPmRNA检出率与不同临床参数的关系[n(%)] 临床参数
n
AFPmRNA
阳性数
TNM分期
T1
3
1
T2
5
4
, http://www.100md.com T3
6
5
T4
8
8
肿瘤大小
≥5cm
18
16(88.9)
<5cm
4
2(50.0)
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血清AFP值
≥400ng/ml
10
10(100)
<400ng/ml
12
8(66.7)
肝内转移
有
14
13(92.8)
无
8
, 百拇医药
5(62.5)
门静脉癌栓
有
10
10(100)
无
12
8(66.7)
远处转移
有
8
8(100)
无
, http://www.100md.com
14
10(71.4)
3 讨论
HCC的预后与早期确诊及正确治疗、肝癌细胞的肝内、肝外转移倾向及复发有关。如何判断癌的转移倾向仍是难题。AFP是肝癌标志物，由肝癌细胞产生并分泌到外周血中。具有肝内及肝外转移倾向的肝癌必然分别向门静脉及外周血中释放肝癌细胞。血液中游离的AFPmRNA非常脆弱不能被检出，只有完整的肝癌细胞内AFPmRNA才能被检出，因此，本研究所检测到的AFPmRNA即表示血液中具有肝癌细胞。循环性肿瘤细胞被认为是血源性播散并引起远处器官转移的预测性指标。
血清白蛋白mRNA可作为肝癌患者血循环中的肝癌细胞的标志之一。Komeda等通过nested RT-PCR方法可检测肝癌患者外周血中存在的极微量的肝癌细胞表达的AFPmRNA，并发现它与肝癌患者的预后有很好的相关性。由于nested RT-PCR采用套式引物对特异性PCR产物进行再次扩增，因而与单一的RT-PCR相比，具有灵敏度更高、特异性更强、假阳性率更低等优点。本研究建立并改进了用nested RT-PCR技术扩增AFPmRNA，从而检测肝癌患者血中极微量的肝癌细胞的方法。本法把逆转录反应和第一次PCR扩增二个步骤合为一步完成，然后进行nested PCR。结果表明，正常人外周血有核细胞无AFPmRNA表达，用nested RT-PCR可从2ml外周血中检测到10个左右7402肝癌细胞表达的AFPmRNA。另外，在内参照对比实验中，将7402肝癌细胞总RNA依次稀释为5、1、0.5、0.05、0.005、0.0005、0.00005μg；其nested RT-PCR结果显示，随着RNA量减少，AFPmRNA特异性扩增带有减弱的趋势。本方法具有灵敏度高、采血量少、省时、方便、特异性强等优点。
, 百拇医药
本研究表明，nested RT-PCR检测外周静脉血中的肝癌细胞所表达的AFPmRNA具有如下临床意义：①可鉴别肝脏病变的良恶性，AFPmRNA阳性即为恶性；②可鉴别诊断原发性肝癌和继发性肝癌，AFPmRNA阳性即可诊断原发性肝癌而排除继发性肝癌；③可估计肝癌的临床分期，AFPmRNA阳性，提示肿瘤可能较为晚期；④表明肝癌有无转移倾向，AFPmRNA阳性，即有转移倾向；⑤提示肝癌的预后，AFPmRNA阳性则预后不良；⑥可供选择理想的治疗方案，如AFPmRNA阳性选择术后化疗，AFPmRNA阴性选择全肝移值[3]。
参考文献
1，Komeda T,Fukuda Y,Sando T,et al.Sensitive defection of circulating hepatocellular carcinoma cells in peripheral venous blood.Cancer,1995，75∶2214
2，Mazzaferro V,Regalia E,Dogi R,et al.Liver transplantation for the treatment of small hepatocellular carcinoma in patients with cirrhosis.N Engl J Med,1996，334∶693
3，刘 扬，张柏和，钱光相，等.巢式道转录多聚酶链反应检测循环性肝癌细胞及其临床意义.中华外科杂志，1998，36(10)∶608
(2000年6月6日收稿), http://www.100md.com
单位：无锡市第一人民医院，江苏无锡，214002
关键词：甲胎蛋白类RNA；肝癌
苏州医学院学报001013 摘要 目的 探讨AFPmRNA对诊断原发性肝癌的意义，并评估原发性肝癌的临床分期，预测转移倾向、预后和复发以及治疗。方法 建立并改进巢式逆转录多聚酶链反应(nested RT-PCR)检测外周静脉血肝癌细胞。结果 nested RT-PCR在1ml血中含有≥5个肝癌细胞时即可检测到AFPmRNA。22例原发性肝癌中18例血液标本检测到AFPmRNA，而对照组中均未检测到AFPmRNA。AFPmRNA的检出率与肝癌分期(TNM)、血清AFP浓度、肝内转移、门静脉癌栓、肿瘤大小及远处转移有明显联系(P<0.01)。结论 nested RT-PCR是一个稳定而又敏感的检测方法，AFPmRNA可作为定性诊断原发性肝癌的血液学指标，也可作为肝癌细胞转移的标志，并可判断肝癌临床分期、转移倾向、预后和复发。
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中图法分类号 R735.704
The Method and the Clinical Significance of Detecting AFPmRNA
Cai Bing,Lu Yan, Yan Chenquan
(Wuxi No.1 People's Hospital,Jiangsu Wuxi,214002)
Abstract Objective To research the clinical significance of AFPmRNA for diagnosing primary hepatocellular carcinoma,and to evaluate the clinical stages of primary hepatocellular carcinoma,to prognosticate metastases,prognosis,recurrence and to select the methods of therapy.Methods To establish and improve the method of nested retrotanscript polymerase chain reaction (RT-PCR) for detecting hepatic cancer cells in prepheral venous blood.Results The AFPmRNA can be detected in 1ml blood with five or more than five hepatic cancer cells using nested RT-PCR.The AFPmRNA is positive in 18 blood samples out of 22 cases,whereas it is negative in all control groups.The positive rate of AFPmRNA has a significant relationship with the hepatic cancer stages (TNM),the value of AFP in blood,intrahepatic metastases,the portal vein cancer cell thrombosis,the tumor size and the extrahepatic metastases (P<0.01).Conclusion Nested RT-PCR is a stable and a sensitive detecting method,AFPmRNA can be not only a hemologic sign of diagnosing primary hepatic cancer,but also a mark of the metastases,and can be using for eveluating the clinical stages,metastases trend,prognosis and recurrence of liver cancer.
, 百拇医药
Key words AFPmRNA;Hepatocellular carcinoma
甲胎蛋白(AFP)是原发性肝癌(HCC)的肿瘤标记物，但AFP的敏感性不高，且对肝癌的临床分期、转移倾向等缺乏指导意义。我们参照komeda等[1]方法，建立并改进了巢式逆转录多聚酶链反应(nested RT-PCR)，可敏感地检测出周围血中的AFPmRNA，探讨其在定性诊断HCC及判断预后和转移倾向中的意义，并指导临床不同的治疗方法。
1 实验资料
1.1 引物 AFP引物由北京医科大学细胞生物学教研室提供(经HPLC纯化)。外引物5′ACT GAA TCC AGA ACA CTG CAT AT-3′5′TGC AGT CAA TGC ATC TTT CAC CA-3′内引物5′TGG AAT AGC TTC CAT ATT GGA TC-3′5′AAG TGG CTT CTT CAA CAA ACT GG-3′
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引物设计在hAFP基因外显子1.2.3上，PCR产物片断为101bp。
1.2 细胞株 7402人肝癌细胞株购自上海细胞所，用于本实验敏感性测试。
1.3 周围血单核细胞(PMNS)的纯化 抽周围静脉血2ml、肝素抗凝，用淋巴细胞分离液(中科院血液学研究所，天津)密度梯度离心取得PMNS，根据kor和carr的报道，血中如有肝癌细胞将与PMNS分离在同一层。
1.4 PMNS的总RNA提取 选用Chomczynski和Saccki所描述的异硫氰酸胍(serva)产品-酚-氯仿一步法提取RNA方法从PMNS中提取总RNA，存-40℃待用。
1.5 RT-PCR 反转录和第一次PCR：应用第一链cDNA合成试剂盒(德国B.M产品)和外引物的下游，先将以上所提取的总RNA逆转成cDNA，然后加入上游引物及Taq-DNA聚合酶进行扩增。通过预试验：RT期间，鸟髓母细胞增生病毒(AmV)逆转录酶的终浓度为1×106μ/L，下游引物为1.05μmol/L时效果最佳；PCR反应时，当MgCl2，上游引物的终浓度分别为1.5mmol/L和0.52μmol/L时为最佳。58℃反转录30min，94℃变性2min，然后PCR扩增(94℃30s、50℃30s、72℃40s)共32个循环。第二次 PCR：50μl 反应体系中第一次PCR产物5μl，10×PCRBuffer5μl,dNTP 0.3mmol/L，内引物20pmol，Taq酶3μ，PCR扩增条件(94℃30s、52℃40s、72℃50s)共32个循环。
, 百拇医药
2%琼脂糖电泳(含EB)，紫外灯下判读。
1.6 实验敏感性测定 抽4份正常健康志愿者血2ml(预实验证实其周围血无AFPmRNA)，在PMNS纯化中用Hanks稀释血时，分别加入7402人HCC细胞5、10、102、103、104个，此后的PMNS纯化、总RNA提取及RT-PCR方法同前。
2 结果
2.1 敏感性 含10、102、103、104个肝癌细胞的2ml正常血中，可以检测到AFPmRNA，含5个肝癌细胞的2ml血中未能检出，可见，若1ml血中含有≥5个肝癌细胞即可检出AFPmRNA。
2.2 用本法检测临床22例原发性肝癌(A组、实验组)，对照组 为肝硬化11例(B组)，转移性肝癌9例(C组)，非肝癌肿瘤15例(D组)，健康志愿者14例(E组)。22例HCC患者中有18例检测到AFPmRNA(81.8%)，T1-4均能检出(按TNM分期)[2]。AFPmRNA检出率与肝癌分期的关系见附表。对照组血液中未检出AFPmRNA。
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HCC患者临床参数与AFPmRNA检出率的关系见附表。附表 AFPmRNA检出率与不同临床参数的关系[n(%)] 临床参数
n
AFPmRNA
阳性数
TNM分期
T1
3
1
T2
5
4
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6
5
T4
8
8
肿瘤大小
≥5cm
18
16(88.9)
<5cm
4
2(50.0)
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血清AFP值
≥400ng/ml
10
10(100)
<400ng/ml
12
8(66.7)
肝内转移
有
14
13(92.8)
无
8
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5(62.5)
门静脉癌栓
有
10
10(100)
无
12
8(66.7)
远处转移
有
8
8(100)
无
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14
10(71.4)
3 讨论
HCC的预后与早期确诊及正确治疗、肝癌细胞的肝内、肝外转移倾向及复发有关。如何判断癌的转移倾向仍是难题。AFP是肝癌标志物，由肝癌细胞产生并分泌到外周血中。具有肝内及肝外转移倾向的肝癌必然分别向门静脉及外周血中释放肝癌细胞。血液中游离的AFPmRNA非常脆弱不能被检出，只有完整的肝癌细胞内AFPmRNA才能被检出，因此，本研究所检测到的AFPmRNA即表示血液中具有肝癌细胞。循环性肿瘤细胞被认为是血源性播散并引起远处器官转移的预测性指标。
血清白蛋白mRNA可作为肝癌患者血循环中的肝癌细胞的标志之一。Komeda等通过nested RT-PCR方法可检测肝癌患者外周血中存在的极微量的肝癌细胞表达的AFPmRNA，并发现它与肝癌患者的预后有很好的相关性。由于nested RT-PCR采用套式引物对特异性PCR产物进行再次扩增，因而与单一的RT-PCR相比，具有灵敏度更高、特异性更强、假阳性率更低等优点。本研究建立并改进了用nested RT-PCR技术扩增AFPmRNA，从而检测肝癌患者血中极微量的肝癌细胞的方法。本法把逆转录反应和第一次PCR扩增二个步骤合为一步完成，然后进行nested PCR。结果表明，正常人外周血有核细胞无AFPmRNA表达，用nested RT-PCR可从2ml外周血中检测到10个左右7402肝癌细胞表达的AFPmRNA。另外，在内参照对比实验中，将7402肝癌细胞总RNA依次稀释为5、1、0.5、0.05、0.005、0.0005、0.00005μg；其nested RT-PCR结果显示，随着RNA量减少，AFPmRNA特异性扩增带有减弱的趋势。本方法具有灵敏度高、采血量少、省时、方便、特异性强等优点。
, 百拇医药
本研究表明，nested RT-PCR检测外周静脉血中的肝癌细胞所表达的AFPmRNA具有如下临床意义：①可鉴别肝脏病变的良恶性，AFPmRNA阳性即为恶性；②可鉴别诊断原发性肝癌和继发性肝癌，AFPmRNA阳性即可诊断原发性肝癌而排除继发性肝癌；③可估计肝癌的临床分期，AFPmRNA阳性，提示肿瘤可能较为晚期；④表明肝癌有无转移倾向，AFPmRNA阳性，即有转移倾向；⑤提示肝癌的预后，AFPmRNA阳性则预后不良；⑥可供选择理想的治疗方案，如AFPmRNA阳性选择术后化疗，AFPmRNA阴性选择全肝移值[3]。
参考文献
1，Komeda T,Fukuda Y,Sando T,et al.Sensitive defection of circulating hepatocellular carcinoma cells in peripheral venous blood.Cancer,1995，75∶2214
2，Mazzaferro V,Regalia E,Dogi R,et al.Liver transplantation for the treatment of small hepatocellular carcinoma in patients with cirrhosis.N Engl J Med,1996，334∶693
3，刘 扬，张柏和，钱光相，等.巢式道转录多聚酶链反应检测循环性肝癌细胞及其临床意义.中华外科杂志，1998，36(10)∶608
(2000年6月6日收稿), http://www.100md.com