肝细胞肝癌组织中丙型肝炎病毒核心区基因及其表达产物的检测
肝细胞肝癌组织中丙型肝炎病毒核心区基因及其表达产物的检测
李江 王文亮 于欣欣 郑建勇
摘 要 目的 采用多种方法检测丙型肝炎病毒(HCV)核心区基因和表达产物在肝细胞肝癌(HCC)组织中的分布及其在HCC发生和发展中的作用。方法 对39例HCC患者进行免疫组化和原位杂交的检测。IS-RT-PCR法用于检测并定位HCV RNA。微切组织的RT-PCR法分别检测癌与癌旁组织中的HCV RNA，以便能够控制扩增产物的来源。同时还进行血清学ELISA和RT-PCR的检测。结果 血清ELISA的阳性率(30.8%)并不总与RT-PCR的阳性率(43.6%)一致，后者对于反映HCR RNA存在更为敏感和准确。免疫组化结果显示HCV核心抗原的表达率为38.5%。阳性信号位于癌旁肝细胞的胞浆，而在癌组织中发生了显著的核转位表达(73.3%)。IS-RT-PCR结果显示阳性信号位于肝(癌)细胞的胞浆。阳性率(53.8%)与血清中的HCV RNA的水平显著相关。但有4例肝内HCV RNA高表达而血清HCV RNA的水平很低或是阴性，提示血清中HCV RNA的水平并不总能反映肝内HCV RNA的水平。微切组织RT-PCR法的检测结果显示癌与癌旁组织中HCV RNA的阳性率一致，为59.0%。结论 HCV RNA在HCC组织中的高表达提示HCV RNA在肝细胞恶性转化中起着重要的作用。IS-RT-PCR是一个理想的检测并定位HCV RNA的方法。微切组织的RT-PCR具有与众不同的优点，我们期待这种方法为确定HCV在肝细胞恶性转化中是起直接或是间接作用而提供重要证据。
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关键词：肝炎病毒，丙型 肝细胞瘤 聚合酶链反应 原位杂交 免疫组织化学
丙型肝炎病毒(HCV)是一种单股正链RNA病毒，通过负链中间体进行复制。它不是逆转录病毒，不能整合到宿主细胞的基因组中。然而，HCV可以在肝细胞中长期存在，在肝(癌)细胞中均检测到HCV正、负链RNA，因此推测HCV RNA可能在肝细胞的恶性转化中起着重要的作用[1]。HCV核心(C)区编码的基因具有较高的保守性。其表达产物核心蛋白是HCV聚蛋白前体经细胞内信号酶剪切而形成的非糖基化蛋白，由191个氨基酸组成，相对分子质量为19 000～22 000。最近有研究表明，核心蛋白在肝细胞肝癌(HCC)组织中发生核转位表达，推测可能与HCC的发生有关[2]。本文采用多种方法检测HCC中HCV C区基因及其表达产物的分布，以探讨C区基因在HCC发生和发展中的作用。
1 材料和方法
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1.1 病例选择 39例HBV阴性的肝组织标本来源于第四军医大学西京医院肝胆外科于1994～1997年间进行肝癌切除术的患者。平均年龄为(43.7±8.2)岁，其中男性35例，女性4例。经病理诊断证实HCC Ⅰ期18例，Ⅱ期13例，Ⅲ期8例(WHO诊断标准)，均有癌旁组织。术前采集这些患者的血清5 ml，即刻送检血清学ELISA和RT-PCR。术后切除的肝组织经10%甲醛固定，石蜡包埋。5 μm连续切片，裱于预先APES(Sigma,USA)涂抹的载玻片上，分别进行常规的HE染色、免疫组化、原位杂交(ISH)、或原位逆转录PCR(IS-RT-PCR)。死于非肝脏疾患的尸检胎肝标本做正常对照。
1.2 免疫组化 ABC法(Vector Lab,USA)检测HCV C区抗原。HCV核心区2B株单克隆抗体来源于军事医学科学院基础所。根据操作手册进行。除核染色外，均用苏木素衬染，然后脱水透明封片。对照实验：阳性对照选择血清HCV RNA阳性的肝穿组织，阴性对照选检尸检胎肝组织，并做替代、空白对照，以保证结果的特异可靠。
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1.3 血清学检查 采用厦门新创科技有限公司生产的HCV抗体ELISA检测试剂盒，其中包被的抗原含有HCV C区。血清HCV RNA的检测采用华美生物工程公司生产的HCV RT-PCR检测试剂盒，只是在进行PCR反应时，选用自行设计的HCV C区引物。引物的设计是根据已报道的HCV C区引物，通过DNA SIS 软件与Genebank中HCV各个亚型进行同源性比较，选择大部分能够检出的引物序列，即(5—3)：正链bp,GCTCTAGACAAATCCTAAACCTC;负链bp,GTCCTAGACATGAGGTCGGCG。在DNA合成仪(391 DNA Synthesizer,ABI Biosystem,USA)上合成。
1.4 微切肝组织的RT-PCR[3] 每例甲醛固定，石蜡包埋的HCC组织，5 μm连续切片，根据HE染色结果镜下确定HCC的癌组织和癌旁组织，然后用手术刀片分离，分别置于离心管中，加500 μlDEPC处理过的TE缓冲液(pH6.9)。RNA的提取采用酸、硫氰酸胍、异戊醇-酚-氯仿法。然后乙醇沉淀，真空干燥，冻于-20℃，临用前溶于DEPC处理过的水中。逆转录和PCR：在0.5 ml离心管中加入1×RT缓冲液，1 mmol/L每种dNTP(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)，2 μg随机引物，15 U RNasin和5 U的AMV RTase至总体积为20 μl。反应混合物在42℃作用60 min，然后升温至94 ℃反应5 min。PCR循环反应总体积为50 μl，包括1×PCR缓冲液，1.5 mmol/LMgCl2，0.2 mmol/L每种dNTP混合物，20 pmol上下游引物，反应在热循环仪(PE450，Perkin-Elmer Cetus,USA)上进行，94℃，5 min“热启动”，然后加入2.5 U的Taq DNA聚合酶，PCR扩增，94℃ 30 s,58℃ 30 s，72 ℃ 45 s。取10 μl扩增产物于1.5%的琼脂糖凝胶电泳，与Takara DNA分子量标准DL-2000进行比较出现400 bp左右条带证明为阳性。分别选取已证实有HCV抗原表达阳性的肝硬变和尸检胎肝做阳性和阴性对照，每次RT-PCR反应均做对照，只有同一标本两次检测同时阳性者才确定为阳性。RT-PCR所用酶和其他生化试剂均为Promega(USA)产品。
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1.5 ISH[1]和IS-RT-PCR[4] 切片的预处理 甲醛固定石蜡包埋的肝组织切片60℃烤片2h后，经过脱蜡至水，0.2 mol/LHCl(RT,20 min)增加通透性，40 μl/ml蛋白酶K(Merck ,USA),37℃消化30 min，4%多聚甲醛固定后，再经三乙醇胺处理10 min。从陕西地区1例HCV RNA阳性携带者的血清中扩增C区片段，连接到p GEM-T-easy(Promega,USA),测序，EcoR Ⅰ酶切后进行探针的标记。ISH：探针的标记和杂交均采用Boehringer Mannheim (Germany)原位探针标记和检测试剂盒(Cat.No.1093657),详见说明书。显微镜下观察，蓝紫色为阳性信号。IS-RT-PCR：在自产的原位PCR仪上进行。RT-PCR的具体步骤同抽提组织的RT-PCR，其中直接掺入Dig-dUTP(Boehringer Mannheim,Germany)。Taq酶增加到5 U。4%多聚甲醛后固定，之后步骤同ISH。对照的设置：1.阳性对照是以血清学和免疫组化均证实为HCV阳性的肝组织作为阳性片。2.空白对照是分别以无HCV C区cDNA探针或C区引物、无逆转录酶、无Taq酶的阳性切片作对照。
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1.6 统计学分析 χ2检验，显著性差异定义为P<0.05。
2 结果
2.1 血清的ELISA和RT-PCR检测 HCC患者血清ELISA的检测结果显示，39例中有12例抗HCV抗体阳性，阳性率为30.8%。血清HCV RNA，RT-PCR检测结果显示，39例中有17例阳性，阳性率为43.6%。有7例患者血清HCV RNA阳性，而HCV抗体为阴性。有2例患者血清HCV RNA阴性，而HCV 抗体阳性。两种方法检测的共同阳性率仅为25.6%，提示血清中HCV RNA与HCV抗体水平存在不一致(表1)。
表1 39例HCC患者血清中抗HCV抗体与HCV RNA的关系
Tab.1 Relationship between anti-HCV and HCV RNA among 39 HCC patients
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HCV RNA RT-PCR
总计
Total
+
-
ELISA
+
10
2
12
-
7
20
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27
总计 Total
17
22
39
χ2=11.1，P<0.05，共同阳性率为25.6%.Common positive rate is 25.6%
2.2 免疫组化检测HCV C抗原
应用HCV C区抗原2B株单克隆抗体检测HCC中的相应抗原发现，阳性信号见于HCC细胞的胞质和胞核中，呈细颗粒状均匀分布(图版ⅠB，图1a,1b)。在癌组织中，C抗原以弥漫或灶状核阳性分布为多见，也可见胞质阳性的HCC细胞。癌旁组织为弥漫或灶状分布的胞质阳性。HCC组织中HCV C抗原的阳性率为38.5%(15/39)。提示HCV C抗原的表达与HCC的关系密切。χ2检验表明，癌组织中的C抗原的核阳性率(73.3%，11/15)明显高于癌旁肝组织(6.7%，1/15)中的核阳性率(P<0.05)(表2)。提示HCV核心抗原在HCC中发生了显著的转位表达。
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图1 在HCC组织中,核心抗原阳性信号见于HCC细胞的胞核,呈细颗粒状均匀分布(a);在癌旁组织中阳性信号呈弥漫或灶状分布的胞质性性(b)(400×)
Fig.1 Detection of HCV core protein in HCC by immunohistochemistry(Original magnification 400×).HCC core protein is seen in cytoplasm of HCC cells as fine granular particles cvenly diotoibuteol(a).In pericancerouo cells,the positive signals dirtributed dellacely or focally in cytoplasm(b)
表2 HCV核心抗原在HCC及其癌旁组织中的分布
Tab.2 Distribution of HCV core antigen in cancerous and pericancerous tissues of HCC
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HCV核心抗原 HCV core antigen
总计
Total
细胞核
Nuclei
细胞浆
Cytoplasm
两者共有
Present in both
癌组织
Cancerous tissues
8/15
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4/15
3/15
15
癌旁组织
Pericancerous tissues
0/15
14/15
1/15
15
2.3 ISH和IS-RT-PCR检测HCV RNA IS-RT-PCR及ISH检测HCV RNA在HCC中的阳性率分别为53.8%(21/39)和30.8%(12/39)。χ2检验表明，IS-RT-PCR的检出率明显高，P<0.05。HCV RNA阳性信号呈蓝紫色颗粒，位于肝(癌)细胞的胞浆或胞浆内(图版ⅠB，图2，3)，以胞浆阳性为主，分布呈片状和簇状。汇管区的单核细胞，胆管细胞均未见阳性信号。有趣的是有4例肝内HCV RNA高复制的HCC患者血清中HCV RNA水平低或是阴性，提示血清中HCV RNA的水平并不总能够反映肝内HCV RNA的水平。ISH检测的阳性信号在分布上与IS-RT-PCR一致，但是阳性强度要弱和阳性细胞个数要少很多。阳性对照出现阳性信号，空白对照为阴性，表明上述结果是特异的。
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图2 IS-RT-PCR法检测HCC组织中的HCV RNA.阳性信号位于HCC细胞的胞质,呈蓝紫色颗粒状核周分布,间质组织中未见阳性信号(400×)
Fug.2 Detection of HCV RNA in HCC using IS-RT-PCR.An area with a large number of positive cells is shown.The positive signals are distributed in the cytoplasm and around the nuclei of cancer cells.Note that positive signals are not observed in mesenchymal cells(Original magnification 400×)
图3 ISH法检测HCC中的HCV RNA.阳性信号邮于HCC细胞的胞质,蓝紫色颗粒状(400×),分布类似于IS-RT-PCR,但是阳性信号较弱
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Fig.3 Detection of HCV RNA in HCC using IS-PCR
The positive signals are distributed in the cytoplasm of cancer cells.distribution pattern of positive cells in the same as that by IS-RT-PCR.However,tumor cells show weakly positive signals,forming into a cluster(Original magnification 400×)
2.4 微切组织的HCV RT-PCR 在39例HCC组织中，癌组织和癌旁肝组织中HCV RNA阳性结果一致，电泳均出现450 bp左右的条带，见图1。阳性率为59.0%(23/39)。与血清HCV RNA相比，肝内HCV RNA的阳性率明显增加，提示在HCC组织中，HCV RNA能够在癌组织中长期持续存在，并且血清中的HCV RNA水平并不能够反映出肝内HCV RNA的水平(见表3)。
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图1 微切组织的RT-PCR法检测HCC癌及癌旁组织中的HCV RNA
Fig.1 The result of detecting HCV RNA in cancerous and pericancerous tissues by microdissection RT-PCR
1,3,5:From cancerous tissues. 2,4,6:From pericancerous tissues. 7:Takara DNA marker DL-2000
表3 39例HCC患者中血清与肝组织中HCV RNA的关系
Tab.3 Relationship between serum and hepatic HCV RNA among 39 cases of HCC
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Hepatic HCV RNA
肝组织 HCV RNA
总计
Total
+
-
血清HCV RNA
+
16
1
17
Serum HCV RNA
-
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7
15
22
总计 Total
23
16
39
χ2=19.9,P<0.05,共同阳性率为41.0%.Common positive rate is 41.0%3 讨论
HCV感染人体后，部分患者慢性化，转变为肝硬变，甚至变成HCC。目前对HCV感染人体后的具体生物学行为及与病情变化的关系尚不清楚。我们应用免疫组化，ISH，IS-RT-PCR，以及微切组织的RT-PCR技术在HCC的癌和癌旁组织中分别检测到HCV核心抗原和HCV RNA，并且感染率较高。说明HCV RNA在肝癌组织中的持续性存在。HCV C抗原有胞质表达，也有胞核表达，且在癌组织中的胞核阳性率明显高于癌旁组织中的核阳性率。目前逐渐有关于HCV C抗原核阳性表达的报道。Suzuki认为HCV核心抗原的核表达与HCV核心剪切蛋白的形成有关。他提出假说即表达全长cDNA的HCV核心蛋白(Mr22 000)定位于胞质，是由于在C末段功能域中存在锚着序列，它可使HCV核心蛋白锚着于内质网膜上，而当C末段功能域受到细胞或病毒蛋白酶的编辑处理后，核心蛋白会转位到核内，并且发现PRRGPR(38-43残基)的序列作为核定位信号起着重要的作用，这一序列在各种HCV株中都非常保守[5]。另有研究表明HCV核心蛋白可能是一种基因调节蛋白，HCV可能通过其表达的蛋白产物间接致癌[6]。因此，以HCV核心蛋白为研究的突破口，探索其在HCV致病和致癌机理中的确切作用，并进而为研究针对HCC的防治措施提供重要的理论和临床依据。
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甲醛固定，石蜡包埋的肝组织切片为我们提供了有价值的存档组织来源。早期的研究表明我们可以从这些组织中提取DNA或RNA，然后用PCR扩大。但是从存档蜡块中提取的核酸经PCR后的产量要比从新鲜冰冻组织中提取的低100至1000倍[7]。由于甲醛固定造成核蛋白与DNA或RNA交联，这种交联干扰了DNA聚合酶或逆转录酶催化的引物介导的沿着模板链的延伸，因此降低了DNA扩增的敏感性。适当蛋白酶K的预处理能够克服上述的不足，使得检测HCV RNA的敏感性提高，而未降低特异性。
许多学者用ISH检测HCV RNA，其结果不能完全令人满意。IS-RT-PCR是最近发展起来的一项新技术。我们知道在感染个体中HCV的水平很低，在宿主和培养细胞中这种低水平的病毒复制意味着RT-PCR是唯一有效的检测病毒RNA的方法。尽管IS-RT-PCR技术能够检测出大部分HCC组织中的HCV RNA，但有一定的漏检率。这与组织处理过程中RNA的降解以及IS-RT-PCR的操作有关，比如切片的厚度，蛋白酶K的处理，PCR的条件，逆转录酶以及Taq酶的浓度等[7]。虽然IS-RT-PCR是一项复杂和技巧性极高的检测技术，但是只要掌握主要环节，还是能够成功的运用它。IS-RT-PCR的重要性不仅在于诊断，而且在疾病发展的不同阶段通过活检组织研究靶基因的变化，从而指导治疗。微切组织的RT-PCR技术最早由Saito K报道，与直接从大块组织中抽提HCV RNA然后RT-PCR的方法相比，这种微切RT-PCR技术具有与众不同的优点。对于研究HCV在HCC恶性转化中的作用非常有价值，因为它能够分别从非瘤组织，癌前组织，或癌组织中抽提HCV RNA，扩增，克隆，测序并比较序列，确定HCV RNA在恶性转化中的作用[3]。本文研究表明39例HCC组织中，癌组织和癌旁组织中HCV RNA阳性结果一致，RT-PCR均出现400 bp左右的条带，阳性率为59.0%(23/39)。进一步研究将采用RT-PCR-SSCP或分别克隆和测序，以确定癌与癌旁肝组织中HCV RNA的差异，从而追溯病毒在病情演进过程中的变异情况及这种变异对病情发展的影响。目前这种方法也用于其他一些肿瘤诸如结肠癌，霍其金氏病及乳腺癌[8]。我们期待着这项技术为确定HCV在HCC发病机制中所起的确切作用而提供有力证据。
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作者单位：李江(710032 西安，第四军医大学病理学教研室)
王文亮(710032 西安，第四军医大学病理学教研室)
郑建勇(肝胆外科)
于欣欣(第一军医大学分子生物学研究室)
参考文献
1，Tang L,Tanaka Y,Enomoto N,et al.Detection of hepatitis C virus RNA in hepatocellular carcinoma by in situ hybridization.Cancer,1995,76:2211-2216.
2，Suzuki R,Matsura Y,Suzuki T,et al.Molecular basis of subcellular localization of HCV core protein.Liver,1996,16:221-224.
, http://www.100md.com
3，Saito K,Sullivan D,Haruna Y,et al.Detection of hepatitis C virus RNA sequences in hepatocellular carcinoma and its precursors by microdissection polymerase chain reaction.Arch Pathol Lab Med,1997,121:400-403.
4，Lau GK,Fang JW, Wu PC,et al.Detection of hepatitis C virus genome in formalin-fixed paraffin-embedded liver tissue by in situ reverse transcription polymerase chain reaction.J Med Virol,1994,44:406-409.
5，Suzuki T,Matsura Y,Harada T,et al.Nuclear localization of the truncated hepatitis C virus core protein with its hydrophobic C-terminus deleted.J Gen Virol,1995,16:52-61.
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6，Ray RB,Lagging LM,Meyer K,et al.Hepatitis C virus core protein cooperates with ras and transforms primary rat embryo fibroblasts to tumorigenetic phenotype.J Virol,1996,70:4438-4443.
7，Lau GKK,Davis GL,Wu SPC, et al.Hepatic expression of hepatitis C virus RNA in chronic hepatitis C:a sutdy by in situ reverse-transcription polymerase chain reaction.Hepatology,1996,23:1318-1323.
8，Hummel M,Ziemann K,Lammert H,et al.Hodgkin's disease with monoclonal and polyclonal populations of Reed-Sternberg cells.N Engl J Med,1995,333:901-906., 百拇医药
李江 王文亮 于欣欣 郑建勇
摘 要 目的 采用多种方法检测丙型肝炎病毒(HCV)核心区基因和表达产物在肝细胞肝癌(HCC)组织中的分布及其在HCC发生和发展中的作用。方法 对39例HCC患者进行免疫组化和原位杂交的检测。IS-RT-PCR法用于检测并定位HCV RNA。微切组织的RT-PCR法分别检测癌与癌旁组织中的HCV RNA，以便能够控制扩增产物的来源。同时还进行血清学ELISA和RT-PCR的检测。结果 血清ELISA的阳性率(30.8%)并不总与RT-PCR的阳性率(43.6%)一致，后者对于反映HCR RNA存在更为敏感和准确。免疫组化结果显示HCV核心抗原的表达率为38.5%。阳性信号位于癌旁肝细胞的胞浆，而在癌组织中发生了显著的核转位表达(73.3%)。IS-RT-PCR结果显示阳性信号位于肝(癌)细胞的胞浆。阳性率(53.8%)与血清中的HCV RNA的水平显著相关。但有4例肝内HCV RNA高表达而血清HCV RNA的水平很低或是阴性，提示血清中HCV RNA的水平并不总能反映肝内HCV RNA的水平。微切组织RT-PCR法的检测结果显示癌与癌旁组织中HCV RNA的阳性率一致，为59.0%。结论 HCV RNA在HCC组织中的高表达提示HCV RNA在肝细胞恶性转化中起着重要的作用。IS-RT-PCR是一个理想的检测并定位HCV RNA的方法。微切组织的RT-PCR具有与众不同的优点，我们期待这种方法为确定HCV在肝细胞恶性转化中是起直接或是间接作用而提供重要证据。
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关键词：肝炎病毒，丙型 肝细胞瘤 聚合酶链反应 原位杂交 免疫组织化学
丙型肝炎病毒(HCV)是一种单股正链RNA病毒，通过负链中间体进行复制。它不是逆转录病毒，不能整合到宿主细胞的基因组中。然而，HCV可以在肝细胞中长期存在，在肝(癌)细胞中均检测到HCV正、负链RNA，因此推测HCV RNA可能在肝细胞的恶性转化中起着重要的作用[1]。HCV核心(C)区编码的基因具有较高的保守性。其表达产物核心蛋白是HCV聚蛋白前体经细胞内信号酶剪切而形成的非糖基化蛋白，由191个氨基酸组成，相对分子质量为19 000～22 000。最近有研究表明，核心蛋白在肝细胞肝癌(HCC)组织中发生核转位表达，推测可能与HCC的发生有关[2]。本文采用多种方法检测HCC中HCV C区基因及其表达产物的分布，以探讨C区基因在HCC发生和发展中的作用。
1 材料和方法
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1.1 病例选择 39例HBV阴性的肝组织标本来源于第四军医大学西京医院肝胆外科于1994～1997年间进行肝癌切除术的患者。平均年龄为(43.7±8.2)岁，其中男性35例，女性4例。经病理诊断证实HCC Ⅰ期18例，Ⅱ期13例，Ⅲ期8例(WHO诊断标准)，均有癌旁组织。术前采集这些患者的血清5 ml，即刻送检血清学ELISA和RT-PCR。术后切除的肝组织经10%甲醛固定，石蜡包埋。5 μm连续切片，裱于预先APES(Sigma,USA)涂抹的载玻片上，分别进行常规的HE染色、免疫组化、原位杂交(ISH)、或原位逆转录PCR(IS-RT-PCR)。死于非肝脏疾患的尸检胎肝标本做正常对照。
1.2 免疫组化 ABC法(Vector Lab,USA)检测HCV C区抗原。HCV核心区2B株单克隆抗体来源于军事医学科学院基础所。根据操作手册进行。除核染色外，均用苏木素衬染，然后脱水透明封片。对照实验：阳性对照选择血清HCV RNA阳性的肝穿组织，阴性对照选检尸检胎肝组织，并做替代、空白对照，以保证结果的特异可靠。
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1.3 血清学检查 采用厦门新创科技有限公司生产的HCV抗体ELISA检测试剂盒，其中包被的抗原含有HCV C区。血清HCV RNA的检测采用华美生物工程公司生产的HCV RT-PCR检测试剂盒，只是在进行PCR反应时，选用自行设计的HCV C区引物。引物的设计是根据已报道的HCV C区引物，通过DNA SIS 软件与Genebank中HCV各个亚型进行同源性比较，选择大部分能够检出的引物序列，即(5—3)：正链bp,GCTCTAGACAAATCCTAAACCTC;负链bp,GTCCTAGACATGAGGTCGGCG。在DNA合成仪(391 DNA Synthesizer,ABI Biosystem,USA)上合成。
1.4 微切肝组织的RT-PCR[3] 每例甲醛固定，石蜡包埋的HCC组织，5 μm连续切片，根据HE染色结果镜下确定HCC的癌组织和癌旁组织，然后用手术刀片分离，分别置于离心管中，加500 μlDEPC处理过的TE缓冲液(pH6.9)。RNA的提取采用酸、硫氰酸胍、异戊醇-酚-氯仿法。然后乙醇沉淀，真空干燥，冻于-20℃，临用前溶于DEPC处理过的水中。逆转录和PCR：在0.5 ml离心管中加入1×RT缓冲液，1 mmol/L每种dNTP(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)，2 μg随机引物，15 U RNasin和5 U的AMV RTase至总体积为20 μl。反应混合物在42℃作用60 min，然后升温至94 ℃反应5 min。PCR循环反应总体积为50 μl，包括1×PCR缓冲液，1.5 mmol/LMgCl2，0.2 mmol/L每种dNTP混合物，20 pmol上下游引物，反应在热循环仪(PE450，Perkin-Elmer Cetus,USA)上进行，94℃，5 min“热启动”，然后加入2.5 U的Taq DNA聚合酶，PCR扩增，94℃ 30 s,58℃ 30 s，72 ℃ 45 s。取10 μl扩增产物于1.5%的琼脂糖凝胶电泳，与Takara DNA分子量标准DL-2000进行比较出现400 bp左右条带证明为阳性。分别选取已证实有HCV抗原表达阳性的肝硬变和尸检胎肝做阳性和阴性对照，每次RT-PCR反应均做对照，只有同一标本两次检测同时阳性者才确定为阳性。RT-PCR所用酶和其他生化试剂均为Promega(USA)产品。
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1.5 ISH[1]和IS-RT-PCR[4] 切片的预处理 甲醛固定石蜡包埋的肝组织切片60℃烤片2h后，经过脱蜡至水，0.2 mol/LHCl(RT,20 min)增加通透性，40 μl/ml蛋白酶K(Merck ,USA),37℃消化30 min，4%多聚甲醛固定后，再经三乙醇胺处理10 min。从陕西地区1例HCV RNA阳性携带者的血清中扩增C区片段，连接到p GEM-T-easy(Promega,USA),测序，EcoR Ⅰ酶切后进行探针的标记。ISH：探针的标记和杂交均采用Boehringer Mannheim (Germany)原位探针标记和检测试剂盒(Cat.No.1093657),详见说明书。显微镜下观察，蓝紫色为阳性信号。IS-RT-PCR：在自产的原位PCR仪上进行。RT-PCR的具体步骤同抽提组织的RT-PCR，其中直接掺入Dig-dUTP(Boehringer Mannheim,Germany)。Taq酶增加到5 U。4%多聚甲醛后固定，之后步骤同ISH。对照的设置：1.阳性对照是以血清学和免疫组化均证实为HCV阳性的肝组织作为阳性片。2.空白对照是分别以无HCV C区cDNA探针或C区引物、无逆转录酶、无Taq酶的阳性切片作对照。
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1.6 统计学分析 χ2检验，显著性差异定义为P<0.05。
2 结果
2.1 血清的ELISA和RT-PCR检测 HCC患者血清ELISA的检测结果显示，39例中有12例抗HCV抗体阳性，阳性率为30.8%。血清HCV RNA，RT-PCR检测结果显示，39例中有17例阳性，阳性率为43.6%。有7例患者血清HCV RNA阳性，而HCV抗体为阴性。有2例患者血清HCV RNA阴性，而HCV 抗体阳性。两种方法检测的共同阳性率仅为25.6%，提示血清中HCV RNA与HCV抗体水平存在不一致(表1)。
表1 39例HCC患者血清中抗HCV抗体与HCV RNA的关系
Tab.1 Relationship between anti-HCV and HCV RNA among 39 HCC patients
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HCV RNA RT-PCR
总计
Total
+
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ELISA
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27
总计 Total
17
22
39
χ2=11.1，P<0.05，共同阳性率为25.6%.Common positive rate is 25.6%
2.2 免疫组化检测HCV C抗原
应用HCV C区抗原2B株单克隆抗体检测HCC中的相应抗原发现，阳性信号见于HCC细胞的胞质和胞核中，呈细颗粒状均匀分布(图版ⅠB，图1a,1b)。在癌组织中，C抗原以弥漫或灶状核阳性分布为多见，也可见胞质阳性的HCC细胞。癌旁组织为弥漫或灶状分布的胞质阳性。HCC组织中HCV C抗原的阳性率为38.5%(15/39)。提示HCV C抗原的表达与HCC的关系密切。χ2检验表明，癌组织中的C抗原的核阳性率(73.3%，11/15)明显高于癌旁肝组织(6.7%，1/15)中的核阳性率(P<0.05)(表2)。提示HCV核心抗原在HCC中发生了显著的转位表达。
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图1 在HCC组织中,核心抗原阳性信号见于HCC细胞的胞核,呈细颗粒状均匀分布(a);在癌旁组织中阳性信号呈弥漫或灶状分布的胞质性性(b)(400×)
Fig.1 Detection of HCV core protein in HCC by immunohistochemistry(Original magnification 400×).HCC core protein is seen in cytoplasm of HCC cells as fine granular particles cvenly diotoibuteol(a).In pericancerouo cells,the positive signals dirtributed dellacely or focally in cytoplasm(b)
表2 HCV核心抗原在HCC及其癌旁组织中的分布
Tab.2 Distribution of HCV core antigen in cancerous and pericancerous tissues of HCC
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HCV核心抗原 HCV core antigen
总计
Total
细胞核
Nuclei
细胞浆
Cytoplasm
两者共有
Present in both
癌组织
Cancerous tissues
8/15
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4/15
3/15
15
癌旁组织
Pericancerous tissues
0/15
14/15
1/15
15
2.3 ISH和IS-RT-PCR检测HCV RNA IS-RT-PCR及ISH检测HCV RNA在HCC中的阳性率分别为53.8%(21/39)和30.8%(12/39)。χ2检验表明，IS-RT-PCR的检出率明显高，P<0.05。HCV RNA阳性信号呈蓝紫色颗粒，位于肝(癌)细胞的胞浆或胞浆内(图版ⅠB，图2，3)，以胞浆阳性为主，分布呈片状和簇状。汇管区的单核细胞，胆管细胞均未见阳性信号。有趣的是有4例肝内HCV RNA高复制的HCC患者血清中HCV RNA水平低或是阴性，提示血清中HCV RNA的水平并不总能够反映肝内HCV RNA的水平。ISH检测的阳性信号在分布上与IS-RT-PCR一致，但是阳性强度要弱和阳性细胞个数要少很多。阳性对照出现阳性信号，空白对照为阴性，表明上述结果是特异的。
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图2 IS-RT-PCR法检测HCC组织中的HCV RNA.阳性信号位于HCC细胞的胞质,呈蓝紫色颗粒状核周分布,间质组织中未见阳性信号(400×)
Fug.2 Detection of HCV RNA in HCC using IS-RT-PCR.An area with a large number of positive cells is shown.The positive signals are distributed in the cytoplasm and around the nuclei of cancer cells.Note that positive signals are not observed in mesenchymal cells(Original magnification 400×)
图3 ISH法检测HCC中的HCV RNA.阳性信号邮于HCC细胞的胞质,蓝紫色颗粒状(400×),分布类似于IS-RT-PCR,但是阳性信号较弱
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Fig.3 Detection of HCV RNA in HCC using IS-PCR
The positive signals are distributed in the cytoplasm of cancer cells.distribution pattern of positive cells in the same as that by IS-RT-PCR.However,tumor cells show weakly positive signals,forming into a cluster(Original magnification 400×)
2.4 微切组织的HCV RT-PCR 在39例HCC组织中，癌组织和癌旁肝组织中HCV RNA阳性结果一致，电泳均出现450 bp左右的条带，见图1。阳性率为59.0%(23/39)。与血清HCV RNA相比，肝内HCV RNA的阳性率明显增加，提示在HCC组织中，HCV RNA能够在癌组织中长期持续存在，并且血清中的HCV RNA水平并不能够反映出肝内HCV RNA的水平(见表3)。
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图1 微切组织的RT-PCR法检测HCC癌及癌旁组织中的HCV RNA
Fig.1 The result of detecting HCV RNA in cancerous and pericancerous tissues by microdissection RT-PCR
1,3,5:From cancerous tissues. 2,4,6:From pericancerous tissues. 7:Takara DNA marker DL-2000
表3 39例HCC患者中血清与肝组织中HCV RNA的关系
Tab.3 Relationship between serum and hepatic HCV RNA among 39 cases of HCC
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Hepatic HCV RNA
肝组织 HCV RNA
总计
Total
+
-
血清HCV RNA
+
16
1
17
Serum HCV RNA
-
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7
15
22
总计 Total
23
16
39
χ2=19.9,P<0.05,共同阳性率为41.0%.Common positive rate is 41.0%3 讨论
HCV感染人体后，部分患者慢性化，转变为肝硬变，甚至变成HCC。目前对HCV感染人体后的具体生物学行为及与病情变化的关系尚不清楚。我们应用免疫组化，ISH，IS-RT-PCR，以及微切组织的RT-PCR技术在HCC的癌和癌旁组织中分别检测到HCV核心抗原和HCV RNA，并且感染率较高。说明HCV RNA在肝癌组织中的持续性存在。HCV C抗原有胞质表达，也有胞核表达，且在癌组织中的胞核阳性率明显高于癌旁组织中的核阳性率。目前逐渐有关于HCV C抗原核阳性表达的报道。Suzuki认为HCV核心抗原的核表达与HCV核心剪切蛋白的形成有关。他提出假说即表达全长cDNA的HCV核心蛋白(Mr22 000)定位于胞质，是由于在C末段功能域中存在锚着序列，它可使HCV核心蛋白锚着于内质网膜上，而当C末段功能域受到细胞或病毒蛋白酶的编辑处理后，核心蛋白会转位到核内，并且发现PRRGPR(38-43残基)的序列作为核定位信号起着重要的作用，这一序列在各种HCV株中都非常保守[5]。另有研究表明HCV核心蛋白可能是一种基因调节蛋白，HCV可能通过其表达的蛋白产物间接致癌[6]。因此，以HCV核心蛋白为研究的突破口，探索其在HCV致病和致癌机理中的确切作用，并进而为研究针对HCC的防治措施提供重要的理论和临床依据。
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甲醛固定，石蜡包埋的肝组织切片为我们提供了有价值的存档组织来源。早期的研究表明我们可以从这些组织中提取DNA或RNA，然后用PCR扩大。但是从存档蜡块中提取的核酸经PCR后的产量要比从新鲜冰冻组织中提取的低100至1000倍[7]。由于甲醛固定造成核蛋白与DNA或RNA交联，这种交联干扰了DNA聚合酶或逆转录酶催化的引物介导的沿着模板链的延伸，因此降低了DNA扩增的敏感性。适当蛋白酶K的预处理能够克服上述的不足，使得检测HCV RNA的敏感性提高，而未降低特异性。
许多学者用ISH检测HCV RNA，其结果不能完全令人满意。IS-RT-PCR是最近发展起来的一项新技术。我们知道在感染个体中HCV的水平很低，在宿主和培养细胞中这种低水平的病毒复制意味着RT-PCR是唯一有效的检测病毒RNA的方法。尽管IS-RT-PCR技术能够检测出大部分HCC组织中的HCV RNA，但有一定的漏检率。这与组织处理过程中RNA的降解以及IS-RT-PCR的操作有关，比如切片的厚度，蛋白酶K的处理，PCR的条件，逆转录酶以及Taq酶的浓度等[7]。虽然IS-RT-PCR是一项复杂和技巧性极高的检测技术，但是只要掌握主要环节，还是能够成功的运用它。IS-RT-PCR的重要性不仅在于诊断，而且在疾病发展的不同阶段通过活检组织研究靶基因的变化，从而指导治疗。微切组织的RT-PCR技术最早由Saito K报道，与直接从大块组织中抽提HCV RNA然后RT-PCR的方法相比，这种微切RT-PCR技术具有与众不同的优点。对于研究HCV在HCC恶性转化中的作用非常有价值，因为它能够分别从非瘤组织，癌前组织，或癌组织中抽提HCV RNA，扩增，克隆，测序并比较序列，确定HCV RNA在恶性转化中的作用[3]。本文研究表明39例HCC组织中，癌组织和癌旁组织中HCV RNA阳性结果一致，RT-PCR均出现400 bp左右的条带，阳性率为59.0%(23/39)。进一步研究将采用RT-PCR-SSCP或分别克隆和测序，以确定癌与癌旁肝组织中HCV RNA的差异，从而追溯病毒在病情演进过程中的变异情况及这种变异对病情发展的影响。目前这种方法也用于其他一些肿瘤诸如结肠癌，霍其金氏病及乳腺癌[8]。我们期待着这项技术为确定HCV在HCC发病机制中所起的确切作用而提供有力证据。
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作者单位：李江(710032 西安，第四军医大学病理学教研室)
王文亮(710032 西安，第四军医大学病理学教研室)
郑建勇(肝胆外科)
于欣欣(第一军医大学分子生物学研究室)
参考文献
1，Tang L,Tanaka Y,Enomoto N,et al.Detection of hepatitis C virus RNA in hepatocellular carcinoma by in situ hybridization.Cancer,1995,76:2211-2216.
2，Suzuki R,Matsura Y,Suzuki T,et al.Molecular basis of subcellular localization of HCV core protein.Liver,1996,16:221-224.
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3，Saito K,Sullivan D,Haruna Y,et al.Detection of hepatitis C virus RNA sequences in hepatocellular carcinoma and its precursors by microdissection polymerase chain reaction.Arch Pathol Lab Med,1997,121:400-403.
4，Lau GK,Fang JW, Wu PC,et al.Detection of hepatitis C virus genome in formalin-fixed paraffin-embedded liver tissue by in situ reverse transcription polymerase chain reaction.J Med Virol,1994,44:406-409.
5，Suzuki T,Matsura Y,Harada T,et al.Nuclear localization of the truncated hepatitis C virus core protein with its hydrophobic C-terminus deleted.J Gen Virol,1995,16:52-61.
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6，Ray RB,Lagging LM,Meyer K,et al.Hepatitis C virus core protein cooperates with ras and transforms primary rat embryo fibroblasts to tumorigenetic phenotype.J Virol,1996,70:4438-4443.
7，Lau GKK,Davis GL,Wu SPC, et al.Hepatic expression of hepatitis C virus RNA in chronic hepatitis C:a sutdy by in situ reverse-transcription polymerase chain reaction.Hepatology,1996,23:1318-1323.
8，Hummel M,Ziemann K,Lammert H,et al.Hodgkin's disease with monoclonal and polyclonal populations of Reed-Sternberg cells.N Engl J Med,1995,333:901-906., 百拇医药