肺泡灌洗液中淋巴细胞表型的测定及临床意义
肺泡灌洗液中淋巴细胞表型的测定及临床意义
崔巍 马文新 张峰
摘要 目的：建立以流式细胞仪(FCM)检测肺泡灌洗液(BALF)中淋巴细胞表型的方法并对其临床意义进行研究。方法：采用FITC-CD45/PE-CD14设门并结合PI染色排除非淋巴细胞、细胞碎片等对检测的干扰，以FCM分析43例肺部疾病患者BALF和对照组外周血中淋巴细胞上各抗原的表达，并与免疫组化检测方法进行方法学比较。结果：FCM法与免疫组化法相关良好(r≥0.806)，其精密度(CV≤1.0%)远优于免疫组化法(CV≥9.8%)。43例BALF中T细胞亚群较外周血有明显变化(P<0.01)，并且在某些肺部疾病中有独特的改变。结节病：细胞表面分化抗原(CD3)和CD4细胞明显增多，CD8细胞数目明显下降，CD4/CD8比值升高；特发性肺间质纤维化(IPF)：CD8细胞显著增多，CD4细胞显著降低，CD4/CD8比值明显降低；肺部肿瘤：CD3细胞数目无明显增多，但CD4/CD8比值下降；肺结核患者T细胞亚群在正常值范围之内，BALF和外周血之间差异无显著意义(P>0.05)。结论：FCM法准确快速、并可进行多参数分析，适合成分复杂、常混有痰液和杂质的BALF标本的检测；BALF中T细胞亚群的改变对肺部疾病的鉴别诊断有重要意义。
, 百拇医药
关键词:肺泡灌洗液；流式细胞术；淋巴细胞表型；T细胞亚群
支气管肺泡灌洗检查，可以直接获取下呼吸道及肺泡上皮表面衬液，对其所含的炎症细胞、免疫细胞进行细胞计数和淋巴细胞亚群测定，可为结节病、过敏性肺泡炎、特发性肺间质纤维化(IPF)、肺部恶性肿瘤等疾病的鉴别诊断和疗效观察提供帮助[1]。但是，由于检测方法的局限性，支气管肺泡灌洗液(BALF)淋巴细胞亚群的检测在国内尚未能普遍开展，只有少数实验室采用免疫组化法(PAP法)进行测定[1]。此法结果的可靠性受人为因素干扰大。随着流式细胞术(FCM)应用的发展，以免疫荧光标记的单克隆抗体(McAB)能够快速准确地测定细胞表面抗原的表达，克服了免疫组化法的缺陷[2]。
本实验室采用免疫荧光三色分析，建立了以流式细胞仪检测BALF中淋巴细胞表型的方法，并以T细胞亚群为例，对其在肺部疾病中的不同表达进行了研究。
, 百拇医药
图1 肺泡灌洗液中的白细胞在CD45/CD14荧光散点图中的分布，L：淋巴细胞，M：单核细胞/巨噬细胞，N：中性粒细胞
图2 图1中的淋巴细胞群在FSC/SSC散点图中的位置，即B门内细胞
图3 B门内淋巴细胞在PI/FSC散点图中的分布，C门内为碘化丙啶阴性的活细胞，D门内为碘化丙啶阳性的死细胞
材料和方法
一、材料
, http://www.100md.com
1.试剂：双标抗体FITC-CD3/PE-CD4、FITC-CD3/PE-CD8、FITC-CD45/PE-CD14和同型匹配的无关鼠IgG、溶血素购于美国Becton-Dickinson (BD)公司；荧光校准微球Flow Check购于美国Beckman Coulter Immunotech公司；碘化丙啶(PI)购于Sigma公司；免疫组化法检测T细胞亚群试剂盒购于元康生物技术公司。
2.仪器：Coulter EPICS ELITE ESP型流式细胞仪。
二、方法
1.实验对象：43例BALF标本均取自北京协和医院门诊或住院患者。男19例，女24例，其中结节病14例、IPF 16例、肺部肿瘤7例、肺结核6例。并取同一患者的外周血作为对照组。
2.BALF样品的制备：取新鲜BALF 10 ml，过滤去杂质和痰液，离心后去上清(300 g，5 min)，再用含有0.5%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，计细胞数，调整浓度为106个细胞/ml/管，加入20 μl荧光抗体，室温避光孵育20 min，加入PI染液(10 μg/ml)，室温避光孵育20 min，另取一管不加PI作为阴性对照。
, 百拇医药
3.外周血样品的制备：取新鲜抗凝外周血100 μl，加入20 μl荧光抗体，孵育20 min，加入溶血素2 ml，孵育10 min，洗2次，加入500 μl PBS待测。
4.流式细胞仪测定：以Flow Check校准仪器光路，使Half CV小于2%。调整荧光补偿，建立细胞表面分化抗原(CD)45/CD14的荧光散点图，根据不同细胞CD45和CD14表达的荧光强度不同，可将淋巴细胞(L)、单核/巨噬细胞(M)、中性粒细胞(N)清楚地区分开(图1)。圈定淋巴细胞群，以此确定淋巴细胞群在前向(FSC)/侧向(SSC)散点图中的位置，见图2中“B”门内细胞。建立FSC/PI对数散点图，区分活的淋巴细胞(细胞膜完整，PI染色阴性)和死的淋巴细胞(细胞膜受损，PI染色阳性)，见图3。建立FITC/PE荧光散点图，分析排除干扰后淋巴细胞表面CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+抗原的表达情况。
, 百拇医药
5.PAP法测定：将BALF中经过滤、离心后获得的细胞固定于载玻片上，按试剂盒说明进行染色，在显微镜下计数阳性细胞。
结果
1.FCM法和PAP法测定结果的比较：两种方法测得的43例BALF标本中CD3、CD4、CD8和CD4/CD8均有很好的相关性(r≥0.806)，但t检验结果差异有显著意义(P<0.05)，说明两种方法间有系统误差(表1)。
2.FCM法和PAP法精密度比较：选取10例T细胞百分数高、中、低不同的BALF标本，用两种方法分别重复测定10次，FCM法的精密度明显优于免疫组化法(表2)。
3.FCM法测定不同疾病BALF和外周血T细胞亚群结果：如表3所示，除肺结核外，其他3种肺部疾病患者BALF中 T细胞亚群的分布较之外周血的差异都有显著意义(P<0.01)。
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表1 两种方法测定的淋巴细胞亚群结果比较*(x±s，%)
项目
CD3
CD4
CD8
CD4/CD8
FCM法
84.9(7.6)
37.6(20.5)
46.1(25.3)
2.3(2.8)
PAP法
, http://www.100md.com
78.2(7.1)
35.1(25.7)
41.8(27.4)
2.1(3.5)
r
0.806
0.923
0.942
0.899
P
<0.01
<0.05
, http://www.100md.com <0.01
<0.01
*n=43；括号内为±2s数据表2 FCM法和免疫组化法精密度比较(CV，%)
方法
CD3
CD4
CD8
FCM法
0.6
1.0
0.3
PAP法
, http://www.100md.com
13.7
15.6
9.8
表3 BALF和外周血中T细胞亚群的比较(x±2s)
疾病类型
例数
BALF淋巴细胞亚群(%)
外周血淋巴细胞亚群(%)
CD3+
CD4+
CD8+
, 百拇医药
CD4/CD8
CD3+
CD4+
CD8+
CD4/CD8
结节病
14
91.8±5.62
70.6±11.2
14.5±8.40
6.9±3.12
72.3±3.98
, 百拇医药
45.6±8.93
25.1±6.21
1.4±0.65
IPF
16
94.5±3.91
14.7±3.12
78.4±7.92
0.2±0.04
71.8±2.55
31.4±3.18
48.7±5.24
, http://www.100md.com
0.6±0.21
肺结核
6
74.3±5.61
42.3±1.92
32.1±1.21
1.3±0.05
67.5±4.32
41.2±2.41
29.5±1.30
1.3±0.05
肺部肿瘤
, 百拇医药
7
67.5±10.4.
24.3±5.24
35.1±9.62
0.7±0.13
61.4±7.58
34.9±4.12
31.5±9.38
1.2±0.17
讨论
1.流式细胞术较免疫组化法测定结果更为准确：首先，人工镜检时通常只计数200个细胞，而FCM可在短时间内检测1万个以上细胞，大大降低了随机因素对结果的干扰；其次，FCM对荧光信号的分辨率是肉眼难于比拟的，当样品中淋巴细胞数目较少时(<5%)，荧光镜检无法准确分辨出微弱的阳性细胞，而FCM则可对仅有1%的淋巴细胞进行准确的表型分析[3]。最为重要的是，免疫镜检法只能对单一抗原进行分析，而FCM可同时对不同波长的多标抗体进行分析，大大提高了检测的准确性。例如，荧光镜下所见的CD8+细胞，既包括了CD3+CD8+细胞(T抑制/杀伤细胞)，又包括了CD3-CD8+细胞(非T抑制/杀伤细胞)。而FCM因其可同时分析不同荧光标记的CD3、CD8细胞，所以可准确测定出CD3+ CD8+细胞的百分数。
, 百拇医药
2.流式细胞术检测BALF淋巴细胞表型时方法学的改进：以CD45/CD14设门并结合PI染色，可准确分析淋巴细胞抗原表型，尤其适用于成分混杂、经常混有痰液和杂质的BALF标本。CD45是白细胞特异性抗体，但在不同白细胞上其表达的荧光强度不同。淋巴细胞表达最高，单核细胞次之，中性粒细胞最弱。CD14则在单核细胞、巨噬细胞表达强烈，在粒细胞表达微弱，T细胞、红细胞和血小板上无表达。因此采用CD45/CD14设门，可准确找到淋巴细胞群，排除其他成分的干扰(图1)。而采用DNA染料PI，可以鉴别细胞膜的完整性。在未固定的标本中，PI可穿透破损的细胞膜对DNA染色，而无法穿透完整细胞膜。因此，加入PI与单抗同时染色，可排除破损细胞(PI染色阳性)对淋巴细胞的干扰。
3.BALF中淋巴细胞亚群检测的临床意义：表3结果表明，多种肺部疾病表现出肺局部免疫功能的变化，如结节病是以CD4细胞占优势的淋巴细胞性肺泡炎；尽管Crystal提出IPF是中性粒细胞性肺泡炎的观点，但目前研究表明，中性粒细胞虽然重要，有可能不是唯一的致损伤细胞，淋巴细胞介导的细胞毒作用也确有可能起损伤细胞的作用[4]。本实验与许多学者的结果都表明，IPF患者BALF中的细胞毒性T细胞(CD3+CD8+细胞)明显增多，其变化与结节病表现绝然不同[1]。这不但反映了二者发病机制有所区别，更能以此作为二者的鉴别诊断指标；肺部肿瘤患者BALF中CD4/CD8比值下降较之外周血明显说明局部肺组织自身免疫功能下降，致使肿瘤细胞得以快速生长；尽管肺结核病是以局部细胞免疫功能改变为主，但这种改变可能与肺间质疾病不同，未能通过BALF和外周血淋巴细胞亚群的变化反应出来，其免疫系统的改变有待进一步的研究。
, http://www.100md.com
作者单位：崔巍(100730 北京，中国医学科学院中国协和医科大学 北京协和医院检验科)
马文新(100730 北京，中国医学科学院中国协和医科大学 北京协和医院检验科)
张峰(100730 北京，中国医学科学院中国协和医科大学 北京协和医院检验科)
参考文献
1，朱元珏, 赵文理, 姜秀芳, 等. T淋巴细胞亚群在四种肺部疾病中的表现. 中华结核和呼吸杂志, 1991, 14:13-16.
2，Claudio SP, Jurgen B, Anne-Marie A, et al. Immunophenotyping of lymphocyte subsets in bronchoalveolar lavage fluid. J Immunol Methods, 1992, 147: 27-32.
3，Brandt B, Thomas M, Eiff VM, et al. Immunophenotyping of lymphocytes obtained by bronchoalveolar lavage: description of an all-purpose tricolor flow cytometric application. J Immunol Methods, 1996, 174:95-102.
4，罗慰慈, 主编. 现代呼吸病学. 北京: 人民军医出版社, 1997. 721-724., 百拇医药
崔巍 马文新 张峰
摘要 目的：建立以流式细胞仪(FCM)检测肺泡灌洗液(BALF)中淋巴细胞表型的方法并对其临床意义进行研究。方法：采用FITC-CD45/PE-CD14设门并结合PI染色排除非淋巴细胞、细胞碎片等对检测的干扰，以FCM分析43例肺部疾病患者BALF和对照组外周血中淋巴细胞上各抗原的表达，并与免疫组化检测方法进行方法学比较。结果：FCM法与免疫组化法相关良好(r≥0.806)，其精密度(CV≤1.0%)远优于免疫组化法(CV≥9.8%)。43例BALF中T细胞亚群较外周血有明显变化(P<0.01)，并且在某些肺部疾病中有独特的改变。结节病：细胞表面分化抗原(CD3)和CD4细胞明显增多，CD8细胞数目明显下降，CD4/CD8比值升高；特发性肺间质纤维化(IPF)：CD8细胞显著增多，CD4细胞显著降低，CD4/CD8比值明显降低；肺部肿瘤：CD3细胞数目无明显增多，但CD4/CD8比值下降；肺结核患者T细胞亚群在正常值范围之内，BALF和外周血之间差异无显著意义(P>0.05)。结论：FCM法准确快速、并可进行多参数分析，适合成分复杂、常混有痰液和杂质的BALF标本的检测；BALF中T细胞亚群的改变对肺部疾病的鉴别诊断有重要意义。
, 百拇医药
关键词:肺泡灌洗液；流式细胞术；淋巴细胞表型；T细胞亚群
支气管肺泡灌洗检查，可以直接获取下呼吸道及肺泡上皮表面衬液，对其所含的炎症细胞、免疫细胞进行细胞计数和淋巴细胞亚群测定，可为结节病、过敏性肺泡炎、特发性肺间质纤维化(IPF)、肺部恶性肿瘤等疾病的鉴别诊断和疗效观察提供帮助[1]。但是，由于检测方法的局限性，支气管肺泡灌洗液(BALF)淋巴细胞亚群的检测在国内尚未能普遍开展，只有少数实验室采用免疫组化法(PAP法)进行测定[1]。此法结果的可靠性受人为因素干扰大。随着流式细胞术(FCM)应用的发展，以免疫荧光标记的单克隆抗体(McAB)能够快速准确地测定细胞表面抗原的表达，克服了免疫组化法的缺陷[2]。
本实验室采用免疫荧光三色分析，建立了以流式细胞仪检测BALF中淋巴细胞表型的方法，并以T细胞亚群为例，对其在肺部疾病中的不同表达进行了研究。
, 百拇医药
图1 肺泡灌洗液中的白细胞在CD45/CD14荧光散点图中的分布，L：淋巴细胞，M：单核细胞/巨噬细胞，N：中性粒细胞
图2 图1中的淋巴细胞群在FSC/SSC散点图中的位置，即B门内细胞
图3 B门内淋巴细胞在PI/FSC散点图中的分布，C门内为碘化丙啶阴性的活细胞，D门内为碘化丙啶阳性的死细胞
材料和方法
一、材料
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1.试剂：双标抗体FITC-CD3/PE-CD4、FITC-CD3/PE-CD8、FITC-CD45/PE-CD14和同型匹配的无关鼠IgG、溶血素购于美国Becton-Dickinson (BD)公司；荧光校准微球Flow Check购于美国Beckman Coulter Immunotech公司；碘化丙啶(PI)购于Sigma公司；免疫组化法检测T细胞亚群试剂盒购于元康生物技术公司。
2.仪器：Coulter EPICS ELITE ESP型流式细胞仪。
二、方法
1.实验对象：43例BALF标本均取自北京协和医院门诊或住院患者。男19例，女24例，其中结节病14例、IPF 16例、肺部肿瘤7例、肺结核6例。并取同一患者的外周血作为对照组。
2.BALF样品的制备：取新鲜BALF 10 ml，过滤去杂质和痰液，离心后去上清(300 g，5 min)，再用含有0.5%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，计细胞数，调整浓度为106个细胞/ml/管，加入20 μl荧光抗体，室温避光孵育20 min，加入PI染液(10 μg/ml)，室温避光孵育20 min，另取一管不加PI作为阴性对照。
, 百拇医药
3.外周血样品的制备：取新鲜抗凝外周血100 μl，加入20 μl荧光抗体，孵育20 min，加入溶血素2 ml，孵育10 min，洗2次，加入500 μl PBS待测。
4.流式细胞仪测定：以Flow Check校准仪器光路，使Half CV小于2%。调整荧光补偿，建立细胞表面分化抗原(CD)45/CD14的荧光散点图，根据不同细胞CD45和CD14表达的荧光强度不同，可将淋巴细胞(L)、单核/巨噬细胞(M)、中性粒细胞(N)清楚地区分开(图1)。圈定淋巴细胞群，以此确定淋巴细胞群在前向(FSC)/侧向(SSC)散点图中的位置，见图2中“B”门内细胞。建立FSC/PI对数散点图，区分活的淋巴细胞(细胞膜完整，PI染色阴性)和死的淋巴细胞(细胞膜受损，PI染色阳性)，见图3。建立FITC/PE荧光散点图，分析排除干扰后淋巴细胞表面CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+抗原的表达情况。
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5.PAP法测定：将BALF中经过滤、离心后获得的细胞固定于载玻片上，按试剂盒说明进行染色，在显微镜下计数阳性细胞。
结果
1.FCM法和PAP法测定结果的比较：两种方法测得的43例BALF标本中CD3、CD4、CD8和CD4/CD8均有很好的相关性(r≥0.806)，但t检验结果差异有显著意义(P<0.05)，说明两种方法间有系统误差(表1)。
2.FCM法和PAP法精密度比较：选取10例T细胞百分数高、中、低不同的BALF标本，用两种方法分别重复测定10次，FCM法的精密度明显优于免疫组化法(表2)。
3.FCM法测定不同疾病BALF和外周血T细胞亚群结果：如表3所示，除肺结核外，其他3种肺部疾病患者BALF中 T细胞亚群的分布较之外周血的差异都有显著意义(P<0.01)。
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表1 两种方法测定的淋巴细胞亚群结果比较*(x±s，%)
项目
CD3
CD4
CD8
CD4/CD8
FCM法
84.9(7.6)
37.6(20.5)
46.1(25.3)
2.3(2.8)
PAP法
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78.2(7.1)
35.1(25.7)
41.8(27.4)
2.1(3.5)
r
0.806
0.923
0.942
0.899
P
<0.01
<0.05
, http://www.100md.com <0.01
<0.01
*n=43；括号内为±2s数据表2 FCM法和免疫组化法精密度比较(CV，%)
方法
CD3
CD4
CD8
FCM法
0.6
1.0
0.3
PAP法
, http://www.100md.com
13.7
15.6
9.8
表3 BALF和外周血中T细胞亚群的比较(x±2s)
疾病类型
例数
BALF淋巴细胞亚群(%)
外周血淋巴细胞亚群(%)
CD3+
CD4+
CD8+
, 百拇医药
CD4/CD8
CD3+
CD4+
CD8+
CD4/CD8
结节病
14
91.8±5.62
70.6±11.2
14.5±8.40
6.9±3.12
72.3±3.98
, 百拇医药
45.6±8.93
25.1±6.21
1.4±0.65
IPF
16
94.5±3.91
14.7±3.12
78.4±7.92
0.2±0.04
71.8±2.55
31.4±3.18
48.7±5.24
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0.6±0.21
肺结核
6
74.3±5.61
42.3±1.92
32.1±1.21
1.3±0.05
67.5±4.32
41.2±2.41
29.5±1.30
1.3±0.05
肺部肿瘤
, 百拇医药
7
67.5±10.4.
24.3±5.24
35.1±9.62
0.7±0.13
61.4±7.58
34.9±4.12
31.5±9.38
1.2±0.17
讨论
1.流式细胞术较免疫组化法测定结果更为准确：首先，人工镜检时通常只计数200个细胞，而FCM可在短时间内检测1万个以上细胞，大大降低了随机因素对结果的干扰；其次，FCM对荧光信号的分辨率是肉眼难于比拟的，当样品中淋巴细胞数目较少时(<5%)，荧光镜检无法准确分辨出微弱的阳性细胞，而FCM则可对仅有1%的淋巴细胞进行准确的表型分析[3]。最为重要的是，免疫镜检法只能对单一抗原进行分析，而FCM可同时对不同波长的多标抗体进行分析，大大提高了检测的准确性。例如，荧光镜下所见的CD8+细胞，既包括了CD3+CD8+细胞(T抑制/杀伤细胞)，又包括了CD3-CD8+细胞(非T抑制/杀伤细胞)。而FCM因其可同时分析不同荧光标记的CD3、CD8细胞，所以可准确测定出CD3+ CD8+细胞的百分数。
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2.流式细胞术检测BALF淋巴细胞表型时方法学的改进：以CD45/CD14设门并结合PI染色，可准确分析淋巴细胞抗原表型，尤其适用于成分混杂、经常混有痰液和杂质的BALF标本。CD45是白细胞特异性抗体，但在不同白细胞上其表达的荧光强度不同。淋巴细胞表达最高，单核细胞次之，中性粒细胞最弱。CD14则在单核细胞、巨噬细胞表达强烈，在粒细胞表达微弱，T细胞、红细胞和血小板上无表达。因此采用CD45/CD14设门，可准确找到淋巴细胞群，排除其他成分的干扰(图1)。而采用DNA染料PI，可以鉴别细胞膜的完整性。在未固定的标本中，PI可穿透破损的细胞膜对DNA染色，而无法穿透完整细胞膜。因此，加入PI与单抗同时染色，可排除破损细胞(PI染色阳性)对淋巴细胞的干扰。
3.BALF中淋巴细胞亚群检测的临床意义：表3结果表明，多种肺部疾病表现出肺局部免疫功能的变化，如结节病是以CD4细胞占优势的淋巴细胞性肺泡炎；尽管Crystal提出IPF是中性粒细胞性肺泡炎的观点，但目前研究表明，中性粒细胞虽然重要，有可能不是唯一的致损伤细胞，淋巴细胞介导的细胞毒作用也确有可能起损伤细胞的作用[4]。本实验与许多学者的结果都表明，IPF患者BALF中的细胞毒性T细胞(CD3+CD8+细胞)明显增多，其变化与结节病表现绝然不同[1]。这不但反映了二者发病机制有所区别，更能以此作为二者的鉴别诊断指标；肺部肿瘤患者BALF中CD4/CD8比值下降较之外周血明显说明局部肺组织自身免疫功能下降，致使肿瘤细胞得以快速生长；尽管肺结核病是以局部细胞免疫功能改变为主，但这种改变可能与肺间质疾病不同，未能通过BALF和外周血淋巴细胞亚群的变化反应出来，其免疫系统的改变有待进一步的研究。
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作者单位：崔巍(100730 北京，中国医学科学院中国协和医科大学 北京协和医院检验科)
马文新(100730 北京，中国医学科学院中国协和医科大学 北京协和医院检验科)
张峰(100730 北京，中国医学科学院中国协和医科大学 北京协和医院检验科)
参考文献
1，朱元珏, 赵文理, 姜秀芳, 等. T淋巴细胞亚群在四种肺部疾病中的表现. 中华结核和呼吸杂志, 1991, 14:13-16.
2，Claudio SP, Jurgen B, Anne-Marie A, et al. Immunophenotyping of lymphocyte subsets in bronchoalveolar lavage fluid. J Immunol Methods, 1992, 147: 27-32.
3，Brandt B, Thomas M, Eiff VM, et al. Immunophenotyping of lymphocytes obtained by bronchoalveolar lavage: description of an all-purpose tricolor flow cytometric application. J Immunol Methods, 1996, 174:95-102.
4，罗慰慈, 主编. 现代呼吸病学. 北京: 人民军医出版社, 1997. 721-724., 百拇医药