IL6/IL6R系统介导重组IL6-PE40外毒素融合蛋白靶向杀伤白血病细胞的新策略
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中国病理生理杂志 2000年第10期第16卷 第七届肿瘤和第
作者：崔建舞 奚永志 郑黎燕 刘爽 刘楠 屠敏 郭斯启 陈兴国 金荔 孔繁华
单位：军事医学科学院附属医院免疫学研究室 国家生物医学分析中心免疫学研究室，北京 100039
关键词：
中国病理生理杂志0010202
目的：利用细胞因子-受体的特异性结合来靶向杀伤肿瘤是新一代导向杀伤策略。鉴于白血病细胞异常高地表达IL6/IL6R系统，而正常造血细胞几乎不表达抑或微量表达这一事实，我们率先在国际上开展了利用IL6/IL6R系统介导重组IL6-PE40外毒素融合蛋白特异性杀伤高表IL6R白血病新策略的科学性及可行性的探讨。方法：1. IL6-PE40的构建、表达及纯化：常规进行RNA提取、RT-PCR、质粒提取、酶切、回收、连接、转化、鉴定IL6、PE40及IL6-PE40融合基因的序列分析等。将所构建的含IL6-PE40重组质粒在大肠杆菌表达，用HPLC半制备分离其产物，SDS-PAGE及Western-blot鉴定。IL6-PE40的细胞毒活性采用[3H]-亮氨酸掺入U266骨髓瘤细胞检测。2. 应用核酸及蛋白质序列软件GOLDKEY系统计算机模拟分析IL6-Linker-PE40及IL6-PE40的柔性、抗原性、亲水性及表位等分子生物学特性。3.表达人IL6R的大鼠急性早幼粒白血病细胞模型建立：采用电转法将线形化的质粒IL6R cDNA导入BNML模型LI12细胞，用G418筛选NeoR克隆并扩增。4. 人IL6R基因在LT12表达的鉴定：FACS检测IL6R表达；[125I]-IL6受体结合实验测定IL12-IL6R+细胞的IL6R数和新合力；Northern-Blot鉴定人IL6R基因在LT12-IL6R+细胞上的整合与表达。5.人IL6R基因的整合对LT12-IL6R+细胞模型生物学特征的影响；6.IL6-PE40对白血病及正常造血细胞的体外作用：CFU-L、CFU-GM及[3H]-TdR掺入：检测不同浓度的IL6-PE40和rhIL6对LT12、LT12-IL6R+及正常骨髓细胞DNA合成的影响。7. IL6-PE40对表达人IL6R的白血病及正常大鼠的体内效应。结果：1. 利用SOE术将已克隆的IL6 cDNA与PE40 DNA片段融合构建成为IL6-PE40，并在两端引入酶切位点克隆至pBV220表达质粒后，筛选得到两种不同的重组表达质粒pIE01的和pIE02，双酶切及测序证实所预期约1500 bp DNA片段的存在，pIE01为在IL6和PE40间有一接头，而pIE02则是两基因的直接相连。2.将含重组质粒接种于LB中诱导表达，激光仪扫描测得pIE01表达水平为52.2%，pIE02的表达水平为39.0%，Western-blot证明表达产物与IL6及PEA抗体发生特异性反应，SDS-PAGE显示其分子量约60 kD的蛋白。经HPLC及凝胶层析获得>98%纯度的IL6-PE40，细胞毒活性鉴定证实IL6-PE40能高度特异地抑制U266细胞的蛋白质合成。3. IL6-Linker-PE40和IL6-PE40分别保留了IL6和PE40的表位特征；柔性接头对等电点没有任何影响，二者的等电点均为5.15；并且融合蛋白没有产生新的抗原表位，IL6-Linker-PE40柔性接头处的抗原性极低；Western-blot显示这两个融合蛋白分别能与IL6和PEA的单抗发生特异性结合，证明它们较好地保留了IL6和PE40的空间结构。4. 在含G418的液体培养基中，筛选出17个含有稳定整合该IL6R cDNA的集落，称之为LT12-IL6R+。将其在含G418的液体培养基中持续传代达6个月，并经尾静脉注入正常BN大鼠体内传代，FACS检测IL6R的表达显示，LT12-IL6R+与MT18单抗结合后呈明显的荧光信号。受体结合实验表明，LT12-IL6R+与[125I]-IL6具有很高的结合力，Scatchard作图Kd=4.7 nM，每个细胞IL6R数为4 000～5 000。Northone-blot显示，LT12-LT6R+的RNA与[32P]-IL6R cDNA探针呈显著的杂交信号。并且人IL6R cDNA在IL12中的稳定整合与表达并未改变IL12原有的生物学特征，尤其是白血病源性。5. IL6-PE40 1～1 000 ng/mL呈剂量依赖性抑制LI12-IL6+的CFU-L形成及DNA合成，相反，对IL12的CFU-L无明显抑制作用。而IL6对两种细胞的CFU-L形成及DNA合成均无任何影响。6. IL6-PE40在1～1 000 ng/mL对正常骨髓细胞的CFU-GM及DNA合成无明显抑制作用。而IL6则呈剂量依赖性刺激CFU-GM形成。7. 在接种LI12-IL6+的第3 d(早期)，采用皮下埋藏微量渗透泵连续7 d应用IL6-PE40 275 μg/kg.d-1可减少90%的白血病负荷，使白血病鼠的生存期明显延长达2 d，而在第10 d(发病晚期)后连续应用7 d IL6-PE40亦获相同疗效。相反，该剂量方案对正常BN大鼠的骨髓CFU-GM、CFU-S8、CFU-S12及具有骨髓重建能力的MRACFU-GM无抑制效应。结论：采用基因融合新策略构建成功了IL6-PE40并获高效表达。通过转基因术成功地建立了高表达人IL6R的BNML大鼠急性早幼粒白血病细胞的体内外模型LT12-IL6R+。应用该模型，证明IL6-PE40不但能特异性地杀伤体外高表达人IL6R的大鼠白血病细胞，而且还明显延长白血病大鼠的生长期。相反，IL6-PE40对体内外正常造血细胞无明显的毒副作用。这无论对于体内直接应用还是体外用于自体BMT前清除白血病细胞均极为有益。从而证实利用IL6/IL6R系统介导靶向杀伤白血病细胞这一新策略的科学性、特异性和可行性，为IL6-PE40应用于临床导向治疗白血病奠定了坚实的基础。
国家自然科学基金(No.39500062和No.39500098)；中荷科技交流基金资助项目, http://www.100md.com
单位：军事医学科学院附属医院免疫学研究室 国家生物医学分析中心免疫学研究室，北京 100039
关键词：
中国病理生理杂志0010202
目的：利用细胞因子-受体的特异性结合来靶向杀伤肿瘤是新一代导向杀伤策略。鉴于白血病细胞异常高地表达IL6/IL6R系统，而正常造血细胞几乎不表达抑或微量表达这一事实，我们率先在国际上开展了利用IL6/IL6R系统介导重组IL6-PE40外毒素融合蛋白特异性杀伤高表IL6R白血病新策略的科学性及可行性的探讨。方法：1. IL6-PE40的构建、表达及纯化：常规进行RNA提取、RT-PCR、质粒提取、酶切、回收、连接、转化、鉴定IL6、PE40及IL6-PE40融合基因的序列分析等。将所构建的含IL6-PE40重组质粒在大肠杆菌表达，用HPLC半制备分离其产物，SDS-PAGE及Western-blot鉴定。IL6-PE40的细胞毒活性采用[3H]-亮氨酸掺入U266骨髓瘤细胞检测。2. 应用核酸及蛋白质序列软件GOLDKEY系统计算机模拟分析IL6-Linker-PE40及IL6-PE40的柔性、抗原性、亲水性及表位等分子生物学特性。3.表达人IL6R的大鼠急性早幼粒白血病细胞模型建立：采用电转法将线形化的质粒IL6R cDNA导入BNML模型LI12细胞，用G418筛选NeoR克隆并扩增。4. 人IL6R基因在LT12表达的鉴定：FACS检测IL6R表达；[125I]-IL6受体结合实验测定IL12-IL6R+细胞的IL6R数和新合力；Northern-Blot鉴定人IL6R基因在LT12-IL6R+细胞上的整合与表达。5.人IL6R基因的整合对LT12-IL6R+细胞模型生物学特征的影响；6.IL6-PE40对白血病及正常造血细胞的体外作用：CFU-L、CFU-GM及[3H]-TdR掺入：检测不同浓度的IL6-PE40和rhIL6对LT12、LT12-IL6R+及正常骨髓细胞DNA合成的影响。7. IL6-PE40对表达人IL6R的白血病及正常大鼠的体内效应。结果：1. 利用SOE术将已克隆的IL6 cDNA与PE40 DNA片段融合构建成为IL6-PE40，并在两端引入酶切位点克隆至pBV220表达质粒后，筛选得到两种不同的重组表达质粒pIE01的和pIE02，双酶切及测序证实所预期约1500 bp DNA片段的存在，pIE01为在IL6和PE40间有一接头，而pIE02则是两基因的直接相连。2.将含重组质粒接种于LB中诱导表达，激光仪扫描测得pIE01表达水平为52.2%，pIE02的表达水平为39.0%，Western-blot证明表达产物与IL6及PEA抗体发生特异性反应，SDS-PAGE显示其分子量约60 kD的蛋白。经HPLC及凝胶层析获得>98%纯度的IL6-PE40，细胞毒活性鉴定证实IL6-PE40能高度特异地抑制U266细胞的蛋白质合成。3. IL6-Linker-PE40和IL6-PE40分别保留了IL6和PE40的表位特征；柔性接头对等电点没有任何影响，二者的等电点均为5.15；并且融合蛋白没有产生新的抗原表位，IL6-Linker-PE40柔性接头处的抗原性极低；Western-blot显示这两个融合蛋白分别能与IL6和PEA的单抗发生特异性结合，证明它们较好地保留了IL6和PE40的空间结构。4. 在含G418的液体培养基中，筛选出17个含有稳定整合该IL6R cDNA的集落，称之为LT12-IL6R+。将其在含G418的液体培养基中持续传代达6个月，并经尾静脉注入正常BN大鼠体内传代，FACS检测IL6R的表达显示，LT12-IL6R+与MT18单抗结合后呈明显的荧光信号。受体结合实验表明，LT12-IL6R+与[125I]-IL6具有很高的结合力，Scatchard作图Kd=4.7 nM，每个细胞IL6R数为4 000～5 000。Northone-blot显示，LT12-LT6R+的RNA与[32P]-IL6R cDNA探针呈显著的杂交信号。并且人IL6R cDNA在IL12中的稳定整合与表达并未改变IL12原有的生物学特征，尤其是白血病源性。5. IL6-PE40 1～1 000 ng/mL呈剂量依赖性抑制LI12-IL6+的CFU-L形成及DNA合成，相反，对IL12的CFU-L无明显抑制作用。而IL6对两种细胞的CFU-L形成及DNA合成均无任何影响。6. IL6-PE40在1～1 000 ng/mL对正常骨髓细胞的CFU-GM及DNA合成无明显抑制作用。而IL6则呈剂量依赖性刺激CFU-GM形成。7. 在接种LI12-IL6+的第3 d(早期)，采用皮下埋藏微量渗透泵连续7 d应用IL6-PE40 275 μg/kg.d-1可减少90%的白血病负荷，使白血病鼠的生存期明显延长达2 d，而在第10 d(发病晚期)后连续应用7 d IL6-PE40亦获相同疗效。相反，该剂量方案对正常BN大鼠的骨髓CFU-GM、CFU-S8、CFU-S12及具有骨髓重建能力的MRACFU-GM无抑制效应。结论：采用基因融合新策略构建成功了IL6-PE40并获高效表达。通过转基因术成功地建立了高表达人IL6R的BNML大鼠急性早幼粒白血病细胞的体内外模型LT12-IL6R+。应用该模型，证明IL6-PE40不但能特异性地杀伤体外高表达人IL6R的大鼠白血病细胞，而且还明显延长白血病大鼠的生长期。相反，IL6-PE40对体内外正常造血细胞无明显的毒副作用。这无论对于体内直接应用还是体外用于自体BMT前清除白血病细胞均极为有益。从而证实利用IL6/IL6R系统介导靶向杀伤白血病细胞这一新策略的科学性、特异性和可行性，为IL6-PE40应用于临床导向治疗白血病奠定了坚实的基础。
国家自然科学基金(No.39500062和No.39500098)；中荷科技交流基金资助项目, http://www.100md.com