胆汁成核效应蛋白的研究进展
项建斌 蔡端 张延龄
关键词：胆汁 成核效应蛋白 胆石 一、促成核蛋白体系的组成
1.非力豆球蛋白A(ConA)结合蛋白：这组蛋白质因无甘露糖基与ConA不能结合，且易受蛋白水解酶链霉蛋白酶(pronase)作用而致活性丧失。胆囊粘膜分泌的粘蛋白是文献最早报道的非ConA结合促成核蛋白〔1〕，模拟胆汁体系中结晶生长实验证实粘蛋白不仅具有促成核作用，而且能抑制胆固醇结晶的形成〔2〕。Groen等〔3〕在T管胆汁中发现另外一种分子量约为30000的非ConA结合蛋白，对热稳定，37℃孵育24 h促成核活性几乎不受影响。因与抑成核蛋白共存于非ConA结合部分，分离纯化较困难，其理化性质有待进一步研究。
2.ConA结合蛋白：(1)免疫球蛋白(Ig)：胆汁中ConA结合部分IgA，IgG及IgM的浓度分别为(171±85) μg/ml，(63±49) μg/ml及(53±38) μg/ml〔4〕。在模拟胆汁体系中Ig明显具促成核作用，其促成核活性强弱依次为IgM>IgA>IgG。但用相应的特异性抗体免疫吸附去除Ig，ConA结合蛋白总促成核活性丢失不到10%，推测ConA结合蛋白中尚有其他促成核因子，胆汁中绝大部分IgA和IgM是以非ConA结合形成存在的〔4，5〕。(2)α-酸性糖蛋白(AAG)：Abei等发现相对分子质量(Mr)42000糖蛋白不仅存在于胆石症病人，而且也存在于正常人群，氨基酸序列分析及特异性免疫结合反应表明胆汁中Mr 42000成核活性蛋白是α-酸性糖蛋白。ELISA法测定多发胆固醇结石病人胆汁中AAG绝对浓度为(59±61)μg/ml，比非胆石症组高出3～5倍，但在单发结石组未发现AAG明显升高〔6〕。理化性质研究示该蛋白质等电点呈酸性(pI<4.1)，可能与含有大量唾液酸有关，脱糖基后多肽骨架Mr为26000，氨基酸组成分析示大部分为Gln，Asp和Leu〔7〕。成核活性实验研究发现胆汁中AAG浓度与成核时间成负相关(P<0.05)，用鼠抗人AAG抗体免疫吸附ConA结合部分中AAG，总ConA蛋白促成核活性约减少1/3，表明AAG是ConA结合蛋白中强促成核活性因子〔5，8〕。(3)低密度颗粒(LDP)：将胆囊胆汁和T管胆汁经ConA-Sepharose柱过筛预处理后，洗脱液以KBr密度梯度超速离心，发现LDP位于离心条带的低密度区(1.08)。成分研究示主要由胆固醇、游离脂肪酸、磷脂及少量蛋白质组成。该蛋白质Mr约85000，SDS-PAGE电涤带弥散，提示其具很强的疏水性。由于N端封闭，未能进行氨基酸序列分析鉴定其性质和结构。负染和冰冻蚀刻电镜示LDP无双层或板层结构，表明LDP不是强促成核活性的胆汁泡。成核动力学实验提示LDP主要参与胆固醇成核过程，而对结晶生长阶段作用不大；脱去脂类后该颗粒活性丧失，但其成核活性不受链霉蛋白酶消化降解的影响〔9〕。(4)氨基肽N(APN)：Groen等〔10〕在胆固醇结石病人胆囊胆汁中分离出Mr 130000糖蛋白，具有明显促成核作用。80℃加热30 min促成核活性全部丧失，将糖苷酶与其混匀孵育水解糖基后促成核活性亦随之丢失，表明Mr 130000糖蛋白是热不稳定蛋白，其中糖基参与调节其促成核作用。随后Zijlstra等〔11〕和Offner等〔12〕证实了肝胆汁和胆囊胆汁中具促成核活性的Mr 130000糖蛋白是APN。尽管胆汁中血浆铜蓝蛋白Mr亦为130000，但该蛋白质无促成核活性，氨基酸序列分析基本上予以排除。进一步研究胆囊粘膜匀浆和白胆汁，两者均未发现APN，提示APN来源于肝脏分泌抑或胆管上皮。(5)α1-抗糜/胰蛋白酶(ACT/ATR)：两者均属急性期反应蛋白，Mr分别为60000和50000。存在于胆固醇结石病人T管胆汁中的ATR和ACT氨基酸组成结构与文献报道的血浆中成分不全一致，其N端已水解16个氨基酸。ACT与ATR的成核活性不受链霉蛋白酶影响，减法实验表明ACT是ConA结合蛋白重要的促成核部分，将ACT加入模拟胆汁体系亦能明显促进胆固醇结晶成核和生长作用；但ATR未见类似现象〔11〕。(6)泡蛋白：胆汁泡是肝脏分泌过饱和胆固醇的主要载体形式〔13〕，泡中含有胆固醇、磷脂及少量蛋白质，三者各占40%、58.7%和<1%。泡的聚集和融合是胆固醇成核的关键步骤，泡相蛋白是此过程的始动因素。Miquel等〔14〕利用垂直转头VTi-50超速离心技术结合ConA亲和层析分离出胆汁泡，SDS-PAGE电泳示泡相蛋白群为200×103、130×103、114×103、66×103、60×103及52×103糖蛋白。除52×103糖蛋白外，余均为疏水性蛋白质。理化性质鉴定130×103、114×103、86×103及(62～67)×103疏水性蛋白质分别为IgA，IgG，IgM和白蛋白〔15〕。1998年，国内马保金等〔16〕又在T管胆汁中分离纯化出Mr 33500泡蛋白，成核活性强达0.310，是迄今发现活性最强的成核效应蛋白。HRP-ConA染色借助扫描电镜证实泡蛋白参与泡的聚集和融合、增加泡相胆固醇饱和度，有利于胆固醇结晶的析出〔17〕。
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二、抑成核蛋白体系的组成
1.Mr 120000糖蛋白：Ohya等〔18〕利用凝胶过滤层析法在胆固醇结石胆囊胆汁中分离出Mr 120000糖蛋白，浓度约为0.47 μg/ml，仅占胆汁总蛋白的0.02%。尽管量微，却有很强的抑成核作用，成核活性(NTm/NTc)高达1.61。理化性质研究提示该蛋白质由等电点均为6.6的Mr 58000和Mr 63000两个亚基组成，一级结构分析其主要含亲水性的Gln，Gly，Ser及Asp等氨基酸。水解脱去与肽链相连的糖基后，Mr 120000糖蛋白抑成核活性随之丧失，提示糖基在成核效应过程中起重要作用。Mr 120000糖蛋白的来源及理化性质仍有待继续研究。
2.结晶结合蛋白：因同胆固醇结晶直接结合而得名，这组蛋白质共有4种成分，Mr分别为16000、28000、63000及74000。成核活性研究表明该组蛋白群抑制胆固醇结晶生长作用呈量效关系，即使低于生理浓度(1～100 μg/ml)，亦具强大抑成核作用。成核活性比较以Mr 63000最强，其次为Mr 16000、Mr 74000及Mr 28000。免疫吸附试验及N端氨基酸序列分析提示Mr 74000、Mr 63000和Mr 28000分别是分泌性IgA及其重链和轻链。分泌性IgA是结晶结合蛋白的重要组成部分，扫描电镜揭示该群抑成核蛋白通过疏水键与胆固醇结晶结合，从而有利于形态规则致密有序的微小胆固醇结晶核形成。这种形式的微结晶被认为是胆汁中胆固醇最有效的沉淀方式，在生理情况下最易通过胆囊收缩排出胆道，但当胆道运动失调时，这些微结晶便在胆汁中聚集形成结石〔19，20〕。
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3.Mr 15000蛋白质：Secknus等〔21〕将胆囊胆汁经抗载脂蛋白A-I免疫吸附柱提取脂蛋白，并经截留Mr 为30000的超滤柱分离纯化出Mr 15000成核效应蛋白。体外试验表明当其浓度为15 mg/ml时，试验组结晶数量仅为对照组75%(P<0.05)且结晶生长速度亦显著减慢。理化性质分析示该蛋白质不含糖基，等电点pI为6.1，在非还原状态下可自行聚集成Mr 为30000的二聚体及Mr 60000的四聚体。
三、成核效应作用机制的探讨
胆固醇成核是胆结石形成的关键，包括胆固醇从微胶粒相转至泡相，小泡逐渐增大形成大泡，伴随着泡相胆固醇饱和度的增高〔22〕，大泡进一步发生聚集和融合出现复合泡，最终直至胆固醇单水结晶析出，结晶继续生长形成结石等过程〔23〕。胆汁成核效应蛋白作用机制仍不甚清楚，目前已成共识的有以下几方面：(1)不同的成核效应蛋白作用环节不尽相同，诸如LDP和AAG等主要参与胆固醇结晶的成核过程〔5，9〕，ATR/ACT主要促进胆固醇结晶生长〔11〕，而IgM和IgG不仅可促进胆固醇结晶成核、生长，尚可移动胆固醇溶解平衡，有助于大量胆固醇结晶析出〔5〕。已知微胶粒相与泡相胆固醇的转移受胆汁中胆汁酸盐浓度及成分的影响，胆汁成核效应蛋白是否参与这一过程尚不明了，但有人在模拟体系中加入ConA结合蛋白能使泡相胆固醇比浊度逐渐增加，提示ConA结合蛋白可能具调节微胶粒相与泡相胆固醇转移的作用〔24〕。(2)糖链在调节成核效应蛋白活性中起重要作用：已发现的成核活性蛋白大多系糖蛋白，糖链以N-连接方式参与该蛋白质的空间结构，如AAG中糖链约占糖蛋白的33%，其中大部分(97%)由N-乙酰葡萄糖胺、唾液酸、甘露糖及半乳糖组成〔7〕。无论促/抑成核蛋白，诸如AAG，APN，Mr 120000糖蛋白等水解脱糖基后活性全部丧失〔7，10，18〕，推测糖链参与调节胆固醇成核过程。(3)多发胆固醇结石与单发胆固醇结石的成核机制不全相同。研究表明，成核效应蛋白AAG、粘蛋白〔6～8，25〕等在多发、单发结石组的含量是不同的，两者差异显著。尽管两组间胆固醇饱和指数、胆汁胆固醇浓度等条件相同，但多发结石组成核时间约(2.6±1.3) d，明显较单发结石组(8.5±3.0) d缩短(P<0.01)。
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四、基因研究的近况
由于胆汁成分复杂，胆汁中成核效应蛋白含量甚少，且目前尚缺乏简便有效的蛋白分离纯化方法，对成核效应蛋白的基因研究为数不多。1997年Keates〔26〕首先开创了胆汁粘蛋白的基因研究，发现呼吸道粘蛋白MUC5B是胆囊粘蛋白基因的主要表达产物。用抗脱糖基胆囊粘蛋白抗体筛选胆囊cDNA基因库，分离出的大多数基因均含有编码MUC5B的重复区域；此外，hGBM2-3基因尚含有编码389个富含半胱氨酸的开放阅读框，这种编码序列与MUC2，MUC5AC及人von Willebrand因子C端基因相同，提示胆囊粘蛋白与MUC2，MUC5B等具有同源性。Kano等〔27〕在多发胆固醇结石病人长期使用鹅脱氧胆酸(UDC)后发现胆汁中粘蛋白浓度明显降低，成核活性亦显著下降。基因研究表明胆囊粘膜中磷脂酶A2-ⅡA(PLA2-ⅡA)mRNA水平及PLA2-V mRNA水平明显降低，而低分子量分泌性PLA2则具有促进胆囊粘膜分泌诸如粘蛋白等促成核效应蛋白的作用。推测UDC的治疗作用也许与抑制炎症介质PLA2等表达分泌，从而减少促成核活性物质产生有关。
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五、小结与展望
胆固醇性结石成因众多复杂，其中胆汁中胆固醇过饱和是基础，胆道运动功能失调是条件，胆汁中促/抑成核因子失平衡是关键。寻找最强促成核活性蛋白，研究其理化性质并制成ELISA试剂盒，用于胆石症高危人群的早期普查、诊断，筛选有效溶石药物，判断和预测胆石复发趋势是今后研究胆石成因的最终目的。成核效应蛋白的基因研究为我们探讨胆石成因开辟了新的途径。
作者单位：项建斌(200040 上海医科大学附属华山医院普外科)
蔡端(200040 上海医科大学附属华山医院普外科)
张延龄(200040 上海医科大学附属华山医院普外科)
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关键词：胆汁 成核效应蛋白 胆石 一、促成核蛋白体系的组成
1.非力豆球蛋白A(ConA)结合蛋白：这组蛋白质因无甘露糖基与ConA不能结合，且易受蛋白水解酶链霉蛋白酶(pronase)作用而致活性丧失。胆囊粘膜分泌的粘蛋白是文献最早报道的非ConA结合促成核蛋白〔1〕，模拟胆汁体系中结晶生长实验证实粘蛋白不仅具有促成核作用，而且能抑制胆固醇结晶的形成〔2〕。Groen等〔3〕在T管胆汁中发现另外一种分子量约为30000的非ConA结合蛋白，对热稳定，37℃孵育24 h促成核活性几乎不受影响。因与抑成核蛋白共存于非ConA结合部分，分离纯化较困难，其理化性质有待进一步研究。
2.ConA结合蛋白：(1)免疫球蛋白(Ig)：胆汁中ConA结合部分IgA，IgG及IgM的浓度分别为(171±85) μg/ml，(63±49) μg/ml及(53±38) μg/ml〔4〕。在模拟胆汁体系中Ig明显具促成核作用，其促成核活性强弱依次为IgM>IgA>IgG。但用相应的特异性抗体免疫吸附去除Ig，ConA结合蛋白总促成核活性丢失不到10%，推测ConA结合蛋白中尚有其他促成核因子，胆汁中绝大部分IgA和IgM是以非ConA结合形成存在的〔4，5〕。(2)α-酸性糖蛋白(AAG)：Abei等发现相对分子质量(Mr)42000糖蛋白不仅存在于胆石症病人，而且也存在于正常人群，氨基酸序列分析及特异性免疫结合反应表明胆汁中Mr 42000成核活性蛋白是α-酸性糖蛋白。ELISA法测定多发胆固醇结石病人胆汁中AAG绝对浓度为(59±61)μg/ml，比非胆石症组高出3～5倍，但在单发结石组未发现AAG明显升高〔6〕。理化性质研究示该蛋白质等电点呈酸性(pI<4.1)，可能与含有大量唾液酸有关，脱糖基后多肽骨架Mr为26000，氨基酸组成分析示大部分为Gln，Asp和Leu〔7〕。成核活性实验研究发现胆汁中AAG浓度与成核时间成负相关(P<0.05)，用鼠抗人AAG抗体免疫吸附ConA结合部分中AAG，总ConA蛋白促成核活性约减少1/3，表明AAG是ConA结合蛋白中强促成核活性因子〔5，8〕。(3)低密度颗粒(LDP)：将胆囊胆汁和T管胆汁经ConA-Sepharose柱过筛预处理后，洗脱液以KBr密度梯度超速离心，发现LDP位于离心条带的低密度区(1.08)。成分研究示主要由胆固醇、游离脂肪酸、磷脂及少量蛋白质组成。该蛋白质Mr约85000，SDS-PAGE电涤带弥散，提示其具很强的疏水性。由于N端封闭，未能进行氨基酸序列分析鉴定其性质和结构。负染和冰冻蚀刻电镜示LDP无双层或板层结构，表明LDP不是强促成核活性的胆汁泡。成核动力学实验提示LDP主要参与胆固醇成核过程，而对结晶生长阶段作用不大；脱去脂类后该颗粒活性丧失，但其成核活性不受链霉蛋白酶消化降解的影响〔9〕。(4)氨基肽N(APN)：Groen等〔10〕在胆固醇结石病人胆囊胆汁中分离出Mr 130000糖蛋白，具有明显促成核作用。80℃加热30 min促成核活性全部丧失，将糖苷酶与其混匀孵育水解糖基后促成核活性亦随之丢失，表明Mr 130000糖蛋白是热不稳定蛋白，其中糖基参与调节其促成核作用。随后Zijlstra等〔11〕和Offner等〔12〕证实了肝胆汁和胆囊胆汁中具促成核活性的Mr 130000糖蛋白是APN。尽管胆汁中血浆铜蓝蛋白Mr亦为130000，但该蛋白质无促成核活性，氨基酸序列分析基本上予以排除。进一步研究胆囊粘膜匀浆和白胆汁，两者均未发现APN，提示APN来源于肝脏分泌抑或胆管上皮。(5)α1-抗糜/胰蛋白酶(ACT/ATR)：两者均属急性期反应蛋白，Mr分别为60000和50000。存在于胆固醇结石病人T管胆汁中的ATR和ACT氨基酸组成结构与文献报道的血浆中成分不全一致，其N端已水解16个氨基酸。ACT与ATR的成核活性不受链霉蛋白酶影响，减法实验表明ACT是ConA结合蛋白重要的促成核部分，将ACT加入模拟胆汁体系亦能明显促进胆固醇结晶成核和生长作用；但ATR未见类似现象〔11〕。(6)泡蛋白：胆汁泡是肝脏分泌过饱和胆固醇的主要载体形式〔13〕，泡中含有胆固醇、磷脂及少量蛋白质，三者各占40%、58.7%和<1%。泡的聚集和融合是胆固醇成核的关键步骤，泡相蛋白是此过程的始动因素。Miquel等〔14〕利用垂直转头VTi-50超速离心技术结合ConA亲和层析分离出胆汁泡，SDS-PAGE电泳示泡相蛋白群为200×103、130×103、114×103、66×103、60×103及52×103糖蛋白。除52×103糖蛋白外，余均为疏水性蛋白质。理化性质鉴定130×103、114×103、86×103及(62～67)×103疏水性蛋白质分别为IgA，IgG，IgM和白蛋白〔15〕。1998年，国内马保金等〔16〕又在T管胆汁中分离纯化出Mr 33500泡蛋白，成核活性强达0.310，是迄今发现活性最强的成核效应蛋白。HRP-ConA染色借助扫描电镜证实泡蛋白参与泡的聚集和融合、增加泡相胆固醇饱和度，有利于胆固醇结晶的析出〔17〕。
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二、抑成核蛋白体系的组成
1.Mr 120000糖蛋白：Ohya等〔18〕利用凝胶过滤层析法在胆固醇结石胆囊胆汁中分离出Mr 120000糖蛋白，浓度约为0.47 μg/ml，仅占胆汁总蛋白的0.02%。尽管量微，却有很强的抑成核作用，成核活性(NTm/NTc)高达1.61。理化性质研究提示该蛋白质由等电点均为6.6的Mr 58000和Mr 63000两个亚基组成，一级结构分析其主要含亲水性的Gln，Gly，Ser及Asp等氨基酸。水解脱去与肽链相连的糖基后，Mr 120000糖蛋白抑成核活性随之丧失，提示糖基在成核效应过程中起重要作用。Mr 120000糖蛋白的来源及理化性质仍有待继续研究。
2.结晶结合蛋白：因同胆固醇结晶直接结合而得名，这组蛋白质共有4种成分，Mr分别为16000、28000、63000及74000。成核活性研究表明该组蛋白群抑制胆固醇结晶生长作用呈量效关系，即使低于生理浓度(1～100 μg/ml)，亦具强大抑成核作用。成核活性比较以Mr 63000最强，其次为Mr 16000、Mr 74000及Mr 28000。免疫吸附试验及N端氨基酸序列分析提示Mr 74000、Mr 63000和Mr 28000分别是分泌性IgA及其重链和轻链。分泌性IgA是结晶结合蛋白的重要组成部分，扫描电镜揭示该群抑成核蛋白通过疏水键与胆固醇结晶结合，从而有利于形态规则致密有序的微小胆固醇结晶核形成。这种形式的微结晶被认为是胆汁中胆固醇最有效的沉淀方式，在生理情况下最易通过胆囊收缩排出胆道，但当胆道运动失调时，这些微结晶便在胆汁中聚集形成结石〔19，20〕。
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3.Mr 15000蛋白质：Secknus等〔21〕将胆囊胆汁经抗载脂蛋白A-I免疫吸附柱提取脂蛋白，并经截留Mr 为30000的超滤柱分离纯化出Mr 15000成核效应蛋白。体外试验表明当其浓度为15 mg/ml时，试验组结晶数量仅为对照组75%(P<0.05)且结晶生长速度亦显著减慢。理化性质分析示该蛋白质不含糖基，等电点pI为6.1，在非还原状态下可自行聚集成Mr 为30000的二聚体及Mr 60000的四聚体。
三、成核效应作用机制的探讨
胆固醇成核是胆结石形成的关键，包括胆固醇从微胶粒相转至泡相，小泡逐渐增大形成大泡，伴随着泡相胆固醇饱和度的增高〔22〕，大泡进一步发生聚集和融合出现复合泡，最终直至胆固醇单水结晶析出，结晶继续生长形成结石等过程〔23〕。胆汁成核效应蛋白作用机制仍不甚清楚，目前已成共识的有以下几方面：(1)不同的成核效应蛋白作用环节不尽相同，诸如LDP和AAG等主要参与胆固醇结晶的成核过程〔5，9〕，ATR/ACT主要促进胆固醇结晶生长〔11〕，而IgM和IgG不仅可促进胆固醇结晶成核、生长，尚可移动胆固醇溶解平衡，有助于大量胆固醇结晶析出〔5〕。已知微胶粒相与泡相胆固醇的转移受胆汁中胆汁酸盐浓度及成分的影响，胆汁成核效应蛋白是否参与这一过程尚不明了，但有人在模拟体系中加入ConA结合蛋白能使泡相胆固醇比浊度逐渐增加，提示ConA结合蛋白可能具调节微胶粒相与泡相胆固醇转移的作用〔24〕。(2)糖链在调节成核效应蛋白活性中起重要作用：已发现的成核活性蛋白大多系糖蛋白，糖链以N-连接方式参与该蛋白质的空间结构，如AAG中糖链约占糖蛋白的33%，其中大部分(97%)由N-乙酰葡萄糖胺、唾液酸、甘露糖及半乳糖组成〔7〕。无论促/抑成核蛋白，诸如AAG，APN，Mr 120000糖蛋白等水解脱糖基后活性全部丧失〔7，10，18〕，推测糖链参与调节胆固醇成核过程。(3)多发胆固醇结石与单发胆固醇结石的成核机制不全相同。研究表明，成核效应蛋白AAG、粘蛋白〔6～8，25〕等在多发、单发结石组的含量是不同的，两者差异显著。尽管两组间胆固醇饱和指数、胆汁胆固醇浓度等条件相同，但多发结石组成核时间约(2.6±1.3) d，明显较单发结石组(8.5±3.0) d缩短(P<0.01)。
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四、基因研究的近况
由于胆汁成分复杂，胆汁中成核效应蛋白含量甚少，且目前尚缺乏简便有效的蛋白分离纯化方法，对成核效应蛋白的基因研究为数不多。1997年Keates〔26〕首先开创了胆汁粘蛋白的基因研究，发现呼吸道粘蛋白MUC5B是胆囊粘蛋白基因的主要表达产物。用抗脱糖基胆囊粘蛋白抗体筛选胆囊cDNA基因库，分离出的大多数基因均含有编码MUC5B的重复区域；此外，hGBM2-3基因尚含有编码389个富含半胱氨酸的开放阅读框，这种编码序列与MUC2，MUC5AC及人von Willebrand因子C端基因相同，提示胆囊粘蛋白与MUC2，MUC5B等具有同源性。Kano等〔27〕在多发胆固醇结石病人长期使用鹅脱氧胆酸(UDC)后发现胆汁中粘蛋白浓度明显降低，成核活性亦显著下降。基因研究表明胆囊粘膜中磷脂酶A2-ⅡA(PLA2-ⅡA)mRNA水平及PLA2-V mRNA水平明显降低，而低分子量分泌性PLA2则具有促进胆囊粘膜分泌诸如粘蛋白等促成核效应蛋白的作用。推测UDC的治疗作用也许与抑制炎症介质PLA2等表达分泌，从而减少促成核活性物质产生有关。
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五、小结与展望
胆固醇性结石成因众多复杂，其中胆汁中胆固醇过饱和是基础，胆道运动功能失调是条件，胆汁中促/抑成核因子失平衡是关键。寻找最强促成核活性蛋白，研究其理化性质并制成ELISA试剂盒，用于胆石症高危人群的早期普查、诊断，筛选有效溶石药物，判断和预测胆石复发趋势是今后研究胆石成因的最终目的。成核效应蛋白的基因研究为我们探讨胆石成因开辟了新的途径。
作者单位：项建斌(200040 上海医科大学附属华山医院普外科)
蔡端(200040 上海医科大学附属华山医院普外科)
张延龄(200040 上海医科大学附属华山医院普外科)
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