维生素D3对人乳腺癌细胞株表皮生长因子受体mRNA表达的影响
维生素D3对人乳腺癌细胞株表皮生长因子受体mRNA表达的影响
张丽萍 翟晓波 何志明 陈洁晴 周健华
摘 要 目的 探讨维生素D3对人乳腺癌细胞株细胞增殖等生物学行为的影响。方法 选用两种人类乳腺癌细胞株MCF-7及ZR-75-1，应用细胞培养及核酸分子杂交方法，研究使用维生素D3以及并用三苯氧胺后，上述细胞株生长及表皮生长因子受体(EGFR) mRNA表达的改变。结果(10-10～10-7) mol/L维生素D3对 MCF-7及ZR-75-1细胞呈现明显的抑制生长作用，并能抑制(10-9～10-7) mol/L 三苯氧胺对MCF-7细胞的刺激生长作用。低浓度(10-10～10-9) mol/L 维生素D3 与半数抑制浓度三苯氧胺合并使用，可使抑制作用进一步加强，并使MCF-7及ZR-75-1两细胞株的EGFR mRNA降低至对照组以下。结论 维生素D 类化合物有可能成为乳腺癌药物治疗的发展方向。
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主题词：乳腺肿瘤；细胞株；受体，表皮生长因子；维生素D3
三苯氧胺能明显提高乳腺癌患者的生存率，但仅能使约 50% 的雌激素受体检测阳性的患者受益。维生素D3属类固醇类化合物，该药物对多种肿瘤细胞具有诱导分化作用。因此，我们研究了维生素D3 及合并使用三苯氧胺对人乳腺癌细胞株MCF-7及ZR-75-1生长及表皮生长因子受体(EGFR) mRNA 表达的影响。
材料与方法
1.细胞培养：人类乳腺癌细胞株MCF-7、ZR-75-1引自中国科学院上海药物研究所,培养于含2 nmol/L 谷氨酰氨、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素、24 nmol/L丙酮酸钠、10 μg/ml胰岛素以及10%小牛血清之RPMI 1640培养液中。ZR-75-1 细胞株在培养液中另外补充10-9 mol/L 17β-雌二醇。上述两株细胞每周传代1次，实验前倒置显微镜下观察，形态良好，无退化。将MCF-7 及ZR-75-1细胞分别以 1×103个/ml及2×103个/ml密度接种于96孔培养板中，以MTT法测定细胞的生长情况。
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2.药物处理：1，25-二羟基维生素D3(下称维生素D3,LEO Pharm 公司 )、三苯氧胺及17β-雌二醇(Sigma 公司)以100%乙醇配制成10-3 mol/L 浓 度，置-20℃ 冰箱储存备用。
3.细胞生长测定：实验组及对照组细胞药物作用6 d，终止培养前4 h向培养孔内加入MTT溶液(生理盐水配制，5 mg/ml)，每孔20 μl，显微镜下见细胞周围形成蓝紫色针状甲簪结晶；倾倒培养板内液体，加入二甲基亚砜(DMSO),每孔100 μl，以溶解MTT形成蓝紫色甲簪结晶，5 min内在570 nm 波长下用酶联检测仪测吸光度值(A，曾称光密度OD)，计算不同浓度药物对 MCF-7及ZR-75-1两细胞株的生长抑制率。抑制率=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100% 。以抑制率为纵坐标，药物对数浓度为横坐标，绘制两细胞株的剂量-效应曲线 ，并计算出维生素D3及三苯氧胺的半数抑制剂量(IC50)[1]。维生素 D3 浓度分别为(10-10～10-7) mol/L，三苯氧胺浓度分别为(10-9～10-6) mol/L，17β-雌二醇浓度为10-9 mol/L。以含乙醇浓度为0.02%的RPMI 1640培养液作为对照，每 16孔为一实验组。
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4.Northern 印迹杂交：实验组及对照组细胞药物作用6 d后，以异硫氰酸胍一步法提取组织总RNA。取15 μg总RNA，1%甲醛变性凝胶电泳后转膜，与α32 P-dCTP 标记EGFR探针(Oncogene Science Co, 片段长2.4 kb)及28S RNA探针(随机引物法标记，华美生物公司)杂交，X线胶片于 -70℃放射自显影7～10 d，经显影、定影后分析杂交信号。
5.统计学分析：本研究采用配对数据t 检验进行统计学分析，P<0.05为差异有显著性。
结果
(10-10～10-7) mol/L维生素D3 对MCF-7细胞株呈现明显的抑制生长作用,抑制率分别为15%、28%、40%和57%,更换新鲜培养液24 h后，细胞生长开始恢复。(10-9～10-7) mol/L三苯氧胺对该细胞具有弱的刺激生长作用，抑制率分别为-10%、-2%和-8%；10-6 mol/L 三苯氧胺则抑制细胞生长，抑制率为48% 。维生素D3的IC50为5×10-8 mol/L，三苯氧胺为1×10-6 mol/L，二者联合使用可阻滞该细胞生长，并且更换培养液后细胞生长不能恢复。低浓度的维生素D3(0.3×10-9mol/L)合并使用1×10-6 mol/L浓度的三苯氧胺，可使MCF-7 细胞生长抑制80%以上(P<0.05)。
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ZR-75-1细胞增殖依赖培养液内10-9 mol/L 17β-雌二醇补充。维生素D3对该细胞抑制生长作用较MCF-7细胞明显，(10-10～10-7) mol/L维生素D3 对该细胞株的生长抑制率分别为35%、50%、63%和95%。10-7 mol/L 维生素D3作用6 d后，细胞发生空泡变性，进而粘附性降低，直至脱落。(10-9～10-6) mol/L三苯氧胺对该细胞均呈现不同程度抑制生长作用，抑制率分别为16%、36%、69%和92%。维生素D3及三苯氧胺两种药物的IC50分别为1×10-9 mol/L和0.5×10-7 mol/L。极低浓度的维生素D3(1×10-10 mol/L)合并使用5×10-7 mol/L的三苯氧胺，可使ZR-75-1细胞生长抑制80%以上(P<0.05)。
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MCF-7及ZR-75-1细胞株经药物处理后，等量总RNA 甲醛变性凝胶电泳，转膜，分别与EGFR及28S RNA探针杂交。结果显示，10-9 mol/L 17β-雌二醇增强乳腺癌细胞株EGFR mRNA 表达，三苯氧胺可抑制雌激素所诱导的这种表达增强作用，合并使用(10-10～10-9) mol/L 浓度维生素D3 后，可进一步抑制 EGFR mRNA至对照组以下。
讨论
乳腺组织生长、发育，受到性激素-受体以及生长因子类相应受体的双重调节[2，3]。乳腺上皮发生癌变时，细胞分裂、增殖信号可来源于上述两种途径。体外研究显示，三苯氧胺能够抑制雌激素对乳腺癌细胞株MCF-7及ZR-75-1的刺激生长作用，但要求培养液中的药物浓度必须在10-7 mol/L以上，当浓度低于10-7 mol/L时，三苯氧胺对乳腺癌细胞株即由抑制生长作用转变为较弱的刺激生长作用[4]。应用乳腺癌细胞与成纤维细胞共培养方法还发现，三苯氧胺阻断了雌激素受体途径的信号传导后，肿瘤细胞仍可通过生长因子受体信号传导途径接受信息，继续分裂增殖[5]。截止目前，阻断生长因子受体信号传导途径尚无特效药物。
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维生素D3属类固醇类化合物，以往的观点认为，该物质主要在调节钙磷代谢等方面发挥作用。近十几年的研究发现，它具有诱导分化、抑制肿瘤细胞增殖的作用。80%～90%的乳腺癌细胞具有维生素D3受体[6]，而维生素D3 类化合物与相应受体结合后，对乳腺癌细胞所产生的作用以及发生作用的环节,目前还知之甚少。
我们选用了两株经典的人乳腺癌细胞株MCF-7(雌激素敏感)及ZR-75-1(雌激素依赖)，探讨维生素D3及合并使用三苯氧胺对两细胞株生长、EGFR mRNA表达的影响。研究结果显示，(10-9～10-7) mol/L的三苯氧胺对MCF-7细胞呈弱的刺激生长作用，但能够抑制17β-雌二醇补充后ZR-75-1细胞的生长；10-6 mol/L三苯氧胺对两细胞株均呈抑制生长作用；(10-10～10-7) mol/L的维生素D3能够明显抑制MCF-7及ZR-75-1细胞的生长；(10-10～10-9) mol/L的维生素D3合并使用三苯氧胺可使抑制作用得到加强，同时伴有EGFR mRNA水平的降低。本研究结果提示，合并使用低浓度的维生素D3，可明显提高三苯氧胺的疗效，并且由于维生素D3可通过作用于EGFR mRNA表达水平而达到抑制乳腺癌肿瘤细胞分裂增殖的目的，故能对雌激素受体阴性以及阳性的乳腺癌细胞均产生抑制作用。体外实验仅观察到药物对乳腺癌肿瘤细胞株的抑制作用，体内应用时尚须对药物的毒副作用进行综合评价。研究开发对机体钙磷代谢影响较小的维生素D类化合物，将有可能成为乳腺癌药物治疗的新的发展方向。
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作者单位：张丽萍(200233 上海市第六人民医院病理科)
陈洁晴(200233 上海市第六人民医院病理科)
周健华(200233 上海市第六人民医院病理科)
翟晓波(200233 上海市第六人民医院药剂科)
何志明(上海医科大学肿瘤医院临床药理室)
参考文献
1.Yamaue H，Tanimura K，Noguchi K， et al. Chemosensitivity testing of fresh human gastric cancer with highly purified tumour cells using the MTT assay. Br J Cancer, 1992 , 166: 794-799.
, 百拇医药
2.King RB,Dorsser LCJ. Receptor growth factors and steroid in sensitivity of tumor. J Endorinol, 1990, 124 :177-181.
3.Agthoven TV, Agthoven TLA, Portengen H, et al. Ectopic expression of epidermal growth factor receptor induces hormone independence in ZR-75-1 human breast cancer cell. Cancer Res, 1992, 52:5082-5088.
4.Saez S, Falette N, Guillet C, et al. 1,25(OH)2 vit D3 malulation of mammary tumor cell growth in vitro and in vivo. Breast Cancer Res Treat, 1993, 27:69- 81.
, 百拇医药
5.Nicholsonn S, Halerow P, Sainbury JRC, et al. Epidermal growth factor receptor (EGFR) status associated with failure of primary endocrine therapy in elder post-menopausal patients with breast cancer. Br J Cancer, 1988 , 58: 810-814.
6.Colston KW, Berger U, Coombes RC, et al. Possible role for vit D3 in controlling breast cancer cell proliferation. Lancet, 1989, 28: 188-191., 百拇医药(维生素D3对人乳腺癌细胞株表皮生长因子受体mRNA表达的影响)
张丽萍 翟晓波 何志明 陈洁晴 周健华
摘 要 目的 探讨维生素D3对人乳腺癌细胞株细胞增殖等生物学行为的影响。方法 选用两种人类乳腺癌细胞株MCF-7及ZR-75-1，应用细胞培养及核酸分子杂交方法，研究使用维生素D3以及并用三苯氧胺后，上述细胞株生长及表皮生长因子受体(EGFR) mRNA表达的改变。结果(10-10～10-7) mol/L维生素D3对 MCF-7及ZR-75-1细胞呈现明显的抑制生长作用，并能抑制(10-9～10-7) mol/L 三苯氧胺对MCF-7细胞的刺激生长作用。低浓度(10-10～10-9) mol/L 维生素D3 与半数抑制浓度三苯氧胺合并使用，可使抑制作用进一步加强，并使MCF-7及ZR-75-1两细胞株的EGFR mRNA降低至对照组以下。结论 维生素D 类化合物有可能成为乳腺癌药物治疗的发展方向。
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主题词：乳腺肿瘤；细胞株；受体，表皮生长因子；维生素D3
三苯氧胺能明显提高乳腺癌患者的生存率，但仅能使约 50% 的雌激素受体检测阳性的患者受益。维生素D3属类固醇类化合物，该药物对多种肿瘤细胞具有诱导分化作用。因此，我们研究了维生素D3 及合并使用三苯氧胺对人乳腺癌细胞株MCF-7及ZR-75-1生长及表皮生长因子受体(EGFR) mRNA 表达的影响。
材料与方法
1.细胞培养：人类乳腺癌细胞株MCF-7、ZR-75-1引自中国科学院上海药物研究所,培养于含2 nmol/L 谷氨酰氨、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素、24 nmol/L丙酮酸钠、10 μg/ml胰岛素以及10%小牛血清之RPMI 1640培养液中。ZR-75-1 细胞株在培养液中另外补充10-9 mol/L 17β-雌二醇。上述两株细胞每周传代1次，实验前倒置显微镜下观察，形态良好，无退化。将MCF-7 及ZR-75-1细胞分别以 1×103个/ml及2×103个/ml密度接种于96孔培养板中，以MTT法测定细胞的生长情况。
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2.药物处理：1，25-二羟基维生素D3(下称维生素D3,LEO Pharm 公司 )、三苯氧胺及17β-雌二醇(Sigma 公司)以100%乙醇配制成10-3 mol/L 浓 度，置-20℃ 冰箱储存备用。
3.细胞生长测定：实验组及对照组细胞药物作用6 d，终止培养前4 h向培养孔内加入MTT溶液(生理盐水配制，5 mg/ml)，每孔20 μl，显微镜下见细胞周围形成蓝紫色针状甲簪结晶；倾倒培养板内液体，加入二甲基亚砜(DMSO),每孔100 μl，以溶解MTT形成蓝紫色甲簪结晶，5 min内在570 nm 波长下用酶联检测仪测吸光度值(A，曾称光密度OD)，计算不同浓度药物对 MCF-7及ZR-75-1两细胞株的生长抑制率。抑制率=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100% 。以抑制率为纵坐标，药物对数浓度为横坐标，绘制两细胞株的剂量-效应曲线 ，并计算出维生素D3及三苯氧胺的半数抑制剂量(IC50)[1]。维生素 D3 浓度分别为(10-10～10-7) mol/L，三苯氧胺浓度分别为(10-9～10-6) mol/L，17β-雌二醇浓度为10-9 mol/L。以含乙醇浓度为0.02%的RPMI 1640培养液作为对照，每 16孔为一实验组。
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4.Northern 印迹杂交：实验组及对照组细胞药物作用6 d后，以异硫氰酸胍一步法提取组织总RNA。取15 μg总RNA，1%甲醛变性凝胶电泳后转膜，与α32 P-dCTP 标记EGFR探针(Oncogene Science Co, 片段长2.4 kb)及28S RNA探针(随机引物法标记，华美生物公司)杂交，X线胶片于 -70℃放射自显影7～10 d，经显影、定影后分析杂交信号。
5.统计学分析：本研究采用配对数据t 检验进行统计学分析，P<0.05为差异有显著性。
结果
(10-10～10-7) mol/L维生素D3 对MCF-7细胞株呈现明显的抑制生长作用,抑制率分别为15%、28%、40%和57%,更换新鲜培养液24 h后，细胞生长开始恢复。(10-9～10-7) mol/L三苯氧胺对该细胞具有弱的刺激生长作用，抑制率分别为-10%、-2%和-8%；10-6 mol/L 三苯氧胺则抑制细胞生长，抑制率为48% 。维生素D3的IC50为5×10-8 mol/L，三苯氧胺为1×10-6 mol/L，二者联合使用可阻滞该细胞生长，并且更换培养液后细胞生长不能恢复。低浓度的维生素D3(0.3×10-9mol/L)合并使用1×10-6 mol/L浓度的三苯氧胺，可使MCF-7 细胞生长抑制80%以上(P<0.05)。
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ZR-75-1细胞增殖依赖培养液内10-9 mol/L 17β-雌二醇补充。维生素D3对该细胞抑制生长作用较MCF-7细胞明显，(10-10～10-7) mol/L维生素D3 对该细胞株的生长抑制率分别为35%、50%、63%和95%。10-7 mol/L 维生素D3作用6 d后，细胞发生空泡变性，进而粘附性降低，直至脱落。(10-9～10-6) mol/L三苯氧胺对该细胞均呈现不同程度抑制生长作用，抑制率分别为16%、36%、69%和92%。维生素D3及三苯氧胺两种药物的IC50分别为1×10-9 mol/L和0.5×10-7 mol/L。极低浓度的维生素D3(1×10-10 mol/L)合并使用5×10-7 mol/L的三苯氧胺，可使ZR-75-1细胞生长抑制80%以上(P<0.05)。
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MCF-7及ZR-75-1细胞株经药物处理后，等量总RNA 甲醛变性凝胶电泳，转膜，分别与EGFR及28S RNA探针杂交。结果显示，10-9 mol/L 17β-雌二醇增强乳腺癌细胞株EGFR mRNA 表达，三苯氧胺可抑制雌激素所诱导的这种表达增强作用，合并使用(10-10～10-9) mol/L 浓度维生素D3 后，可进一步抑制 EGFR mRNA至对照组以下。
讨论
乳腺组织生长、发育，受到性激素-受体以及生长因子类相应受体的双重调节[2，3]。乳腺上皮发生癌变时，细胞分裂、增殖信号可来源于上述两种途径。体外研究显示，三苯氧胺能够抑制雌激素对乳腺癌细胞株MCF-7及ZR-75-1的刺激生长作用，但要求培养液中的药物浓度必须在10-7 mol/L以上，当浓度低于10-7 mol/L时，三苯氧胺对乳腺癌细胞株即由抑制生长作用转变为较弱的刺激生长作用[4]。应用乳腺癌细胞与成纤维细胞共培养方法还发现，三苯氧胺阻断了雌激素受体途径的信号传导后，肿瘤细胞仍可通过生长因子受体信号传导途径接受信息，继续分裂增殖[5]。截止目前，阻断生长因子受体信号传导途径尚无特效药物。
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维生素D3属类固醇类化合物，以往的观点认为，该物质主要在调节钙磷代谢等方面发挥作用。近十几年的研究发现，它具有诱导分化、抑制肿瘤细胞增殖的作用。80%～90%的乳腺癌细胞具有维生素D3受体[6]，而维生素D3 类化合物与相应受体结合后，对乳腺癌细胞所产生的作用以及发生作用的环节,目前还知之甚少。
我们选用了两株经典的人乳腺癌细胞株MCF-7(雌激素敏感)及ZR-75-1(雌激素依赖)，探讨维生素D3及合并使用三苯氧胺对两细胞株生长、EGFR mRNA表达的影响。研究结果显示，(10-9～10-7) mol/L的三苯氧胺对MCF-7细胞呈弱的刺激生长作用，但能够抑制17β-雌二醇补充后ZR-75-1细胞的生长；10-6 mol/L三苯氧胺对两细胞株均呈抑制生长作用；(10-10～10-7) mol/L的维生素D3能够明显抑制MCF-7及ZR-75-1细胞的生长；(10-10～10-9) mol/L的维生素D3合并使用三苯氧胺可使抑制作用得到加强，同时伴有EGFR mRNA水平的降低。本研究结果提示，合并使用低浓度的维生素D3，可明显提高三苯氧胺的疗效，并且由于维生素D3可通过作用于EGFR mRNA表达水平而达到抑制乳腺癌肿瘤细胞分裂增殖的目的，故能对雌激素受体阴性以及阳性的乳腺癌细胞均产生抑制作用。体外实验仅观察到药物对乳腺癌肿瘤细胞株的抑制作用，体内应用时尚须对药物的毒副作用进行综合评价。研究开发对机体钙磷代谢影响较小的维生素D类化合物，将有可能成为乳腺癌药物治疗的新的发展方向。
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作者单位：张丽萍(200233 上海市第六人民医院病理科)
陈洁晴(200233 上海市第六人民医院病理科)
周健华(200233 上海市第六人民医院病理科)
翟晓波(200233 上海市第六人民医院药剂科)
何志明(上海医科大学肿瘤医院临床药理室)
参考文献
1.Yamaue H，Tanimura K，Noguchi K， et al. Chemosensitivity testing of fresh human gastric cancer with highly purified tumour cells using the MTT assay. Br J Cancer, 1992 , 166: 794-799.
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2.King RB,Dorsser LCJ. Receptor growth factors and steroid in sensitivity of tumor. J Endorinol, 1990, 124 :177-181.
3.Agthoven TV, Agthoven TLA, Portengen H, et al. Ectopic expression of epidermal growth factor receptor induces hormone independence in ZR-75-1 human breast cancer cell. Cancer Res, 1992, 52:5082-5088.
4.Saez S, Falette N, Guillet C, et al. 1,25(OH)2 vit D3 malulation of mammary tumor cell growth in vitro and in vivo. Breast Cancer Res Treat, 1993, 27:69- 81.
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5.Nicholsonn S, Halerow P, Sainbury JRC, et al. Epidermal growth factor receptor (EGFR) status associated with failure of primary endocrine therapy in elder post-menopausal patients with breast cancer. Br J Cancer, 1988 , 58: 810-814.
6.Colston KW, Berger U, Coombes RC, et al. Possible role for vit D3 in controlling breast cancer cell proliferation. Lancet, 1989, 28: 188-191., 百拇医药(维生素D3对人乳腺癌细胞株表皮生长因子受体mRNA表达的影响)