结核分支杆菌药物敏感性不同检测方法结果的比较
丁北川 赵亭 盖亚茹 屠德华
摘 要 目的 比较不同标准和方法检测结核分支杆菌耐药性的结果。 方法 对158株临床分离的结核分支杆菌同时采用我国现行标准绝对浓度法、WHO/IUATLD推荐标准1%比例法和绝对浓度法检测药物敏感性。 结果 WHO/IUATLD规定的耐药性标准检测的耐药率为53.8%(85/158)，我国现行标准检测结果为50.0% (79/158)(P>0.05，差异无显著性)。WHO/IUATLD耐药性检测标准检测出耐INH、SM、EMB、RFP率分别为41.8%(66/158)、34.2%(54/158)、22.1%(35/158) 、27.8%(44/158) ，我国现行标准检测的结果分别为34.2%(54/158)、30.4%(48/158)、18.4%(29/158)、27.2%(43/158)；经统计学处理，两标准在检测耐药性时，除INH差异有显著性 (χ2＝18.4，P< 0.01)外，其余三种药物的检测结果差异无显著性。WHO/IUATLD耐药性检测标准应用1%比例法和绝对浓度法检测的结果一致。 结论 耐药性检测标准对药物敏感性检测结果有较大影响，但相应标准下采用不同的检测方法并不影响药物敏感性结果。
, http://www.100md.com
关键词：分支杆菌，结核 微生物敏感性试验
我国现行结核分支杆菌耐药性检测标准与世界卫生组织/国际防痨及肺部疾病联合会(WHO/IUATLD)推荐的耐药性检测标准存在一定差异[1,2]，造成两者检测结果的可比性较差。为了解不同标准和方法检测结核分支杆菌药物敏感性结果的差异，我们对158株临床分离的结核分支杆菌采用不同的方法检测药物敏感性，现将结果报告如下。
材料与方法
一、 材料
1. 标本来源：本所中心实验室保存的北京地区1995～1998年从临床复治患者分离的158株结核分支杆菌。
2. 参比菌株来源：H37Rv由中国药品生物制品检定所提供；每批实验将该菌株做为参比对照。
, 百拇医药
3. 检测药物：包括异烟肼(INH，批号：980903，含量：99.90%)、利福平(RFP，批号：980906，含量：99.78%)、链霉素(SM，批号：9806103，含量：76.92%)和乙胺丁醇(EMB，批号：980704，含量：99.67%)，由卫生部结核病控制中心国家参比实验室提供。
4. 培养基：对照(不含药)和含药培养基均使用L-J培养基，由本实验室按相应规程[1, 2]配制。
二、 方法
1. 待测菌株菌龄：L-J培养基传代，37℃孵育3周。
2. 绝对浓度法：药物检测浓度、方法和结果判定标准参照我国现行标准[1]。
3. WHO/IUATLD比例法：药物检测浓度参照WHO/IUATLD标准，使用L-J培养基，检测方法和结果判定采用1%比例法[2]。
, http://www.100md.com
4. WHO/IUATLD绝对浓度法：药物检测浓度参照WHO/IUATLD标准[2]，检测方法和结果判定标准采用绝对浓度法。简言之，待测菌株10-5 mg接种至对照(不含药)和含药的L-J培养基，37℃孵育4周观察结果。耐药结果判定标准参照我国现行标准[1]。
结果
一、WHO/IUATLD 1%比例法与绝对浓度法检测结果比较
待测菌株采用WHO/IUATLD耐药性检测标准，经绝对浓度法和1%比例法检测，两方法检测出的耐药率均为53.8%(85/185)，药敏试验结果一致。说明使用的测定方法对相应标准下的药敏检测结果无影响。
二、WHO/IUATLD 1%比例法与我国现行方法检测结果的比较
, 百拇医药
1. 药物敏感性结果的比较：158株试验菌株经不同检测标准和方法检测耐药性，结果见表1。
表1 WHO/IUATLD 1% 比例法与我国现行方法药敏试验结果比较(菌株数)
我国方法
WHO/IUATLD 1%比例法
合计
敏 感
耐 药
敏感
73
6
79
, 百拇医药
耐药
0
79
79
合计
73
85
158
由表1可见：WHO/IUATLD标准检测的耐药率为53.8%(85/158)，我国现行标准为50.0%(79/158)；经统计学处理，两标准检测结果差异无显著性 (χ2=0.46，P>0.05)。
2.各药物检测结果比较：见表2～5，可见WHO/IUATLD 1%比例法检测出耐INH、SM、EMB和RFP率分别为41.8%(66/158)、34.2%(54/15)、22.1%(35/158)和27.8%(44/158)；我国现行方法检测结果分别为34.2%(54/158)、30.4%(48/158)、18.4%(29/158)和27.2(43/158)。经统计学处理，两标准在检测INH时，耐药率差异具有显著性(χ2＝18.4，P<0.01)，其余三种药物两标准的检测结果差异无显著性(P>0.05)。
, http://www.100md.com
表2 WHO/IUATLD 1%比例法与我国现行方法检测INH药敏试验结果比较(菌株数)
我国方法
WHO/IUATLD 1%比例法
合计
敏感
耐药
敏感
91
13
104
耐药
1
, http://www.100md.com
53
54
合计
92
66
158
注：两种方法检测的耐药率比较χ2＝18.4，P< 0.01表3 WHO/IUATLD 1%比例法与我国现行方法检测SM药敏试验结果比较(菌株数)
我国方法
WHO/IUATLD 1%比例法
合计
敏感
, http://www.100md.com
耐药
敏感
104
6
110
耐药
0
48
48
合计
104
54
158
注：两种方法检测的耐药率比较χ2＝0.52，P> 0.05表4 WHO/IUATLD 1%比例法与我国现行方法检测EMB药敏试验结果比较(菌株数)
, http://www.100md.com
我国方法
WHO/IUATLD 1%比例法
合计
敏感
耐药
敏感
121
8
129
耐药
2
27
29
, http://www.100md.com
合计
123
35
158
注：两种方法检测的耐药率比较χ2＝0.71，P> 0.05表5 WHO/IUATLD 1%比例法与我国现行方法检测RFP药敏试验结果比较(菌株数)
我国方法
WHO/IUATLD 1%比例法
合计
敏感
耐药
敏感
, 百拇医药
113
2
115
耐药
1
42
43
合计
114
44
158
注：两种方法检测的耐药率比较χ2＝0.02，P> 0.05
讨论
, 百拇医药
近年来，结核病发病率上升以及结核分支杆菌对常用抗结核药物的耐药性特别是耐多药性(MDR)的增多，对国家结核病规划实施效果的影响正在日益增加[3-7]。基于目前状况，WHO/IUATLD建议，结核分支杆菌耐药性监测的结果应做为评价和改进国家结核病控制措施的重要参考因素之一[8]。为使国际上结核分支杆菌耐药性监测数据具有可比性，1997年WHO/IUATLD主持制定了标准化的结核分支杆菌药物敏感性监测指南[1]。该指南所规定的结核分支杆菌耐药性监测浓度标准有别于我国过去和当前规定的检测标准中采取的药物浓度。因此，需要评价耐药性检测时使用的药物浓度标准和检测方法对耐药性检测结果的影响，以便使我们检测的耐药性结果与国际上有可比性。
本实验结果表明：(1) 结核分支杆菌耐药性检测标准对所得结果具有一定影响。部分药物检测标准的浓度相差较大(如INH，我国现行检测标准与WHO/IUATLD规定的检测浓度相差达5倍)，不同检测标准的检测结果符合性较差。特别是对从复治患者分离的菌株，由于该部分菌株具有药物接触史，因此此类菌株经过药物筛选或可能因基因突变而导致待测菌株的最低抑菌浓度(MIC)发生变化。当采用浓度较低的WHO/IUATLD标准检测时，由于筛选出的耐药菌株增加，会直接影响耐药率的统计结果；对于原发耐药率的影响，尚需进一步试验予以证实。(2) 在相应检测标准下，使用的测定方法对检测结果不产生影响。尽管WHO/IUATLD推荐采用1%比例法进行药物敏感性的检测，但不排斥使用其它经质量控制证实结果可靠的方法进行耐药性的检测[1]，本实验的结果说明测定方法对相应标准下的检测结果不产生影响。但应注意的是我国目前规定的绝对浓度法，检测时的接种菌量较大(每支培养基接种10-3 mg菌)。有资料显示：较大的接种菌量可能造成耐药性检测结果出现伪耐药性，特别是检测的药物浓度较低时[9]。为此，Canetti等[10]曾建议：适宜的接种菌量应控制待测菌株在对照培养基上生长的菌落数为100～250个。这样，在测定耐药性时，每支培养基接种的活菌数量约相当于10-4～10-5 mg。
, http://www.100md.com
作者单位：丁北川(100035 北京结核病控制研究所)
赵亭(100035 北京结核病控制研究所)
盖亚茹(100035 北京结核病控制研究所)
屠德华 (100035 北京结核病控制研究所)
参考文献
1，中国防痨协会. 结核病诊断细菌学检验规程. 北京：中国防痨协会，1995.
2，WHO/IUATLD Global Working Group on Antituberculosis Drug Resistance Surveillance. Guideline for surveillance of drug resistance in tuberculosis. WHO/IUATLD，1997.
, 百拇医药
3，Cohn D, Bustreo F, Raviglion M. Drug resistance in tuberculosis: review of the world-wide situation and WHO/IUATLD global surveillance project. Clin Infect Dis, 1997, 24 Suppl 1：S121-S130.
4，Kochi A, Vareldzis B, Styblo K. Multi-drug resistant tuberculosis and its control. Res Microbiol, 1993,144：104-110.
5，Kim SJ, Hong YP. Drug resistance of Mycobacterium tuberculosis in Korea. Tuberc Lung Dis ,1992,73：219-224.
, 百拇医药
6，Frieden DR, Sterling T, Pablos-Mendez A, et al. The emergence of drug-resistant tuberculosis in New York City. N Engl J Med,1993,328：521-526.
7，Braun MM, Kiburn JO, Smithwick RW,et al. HIV infection and primary resistance to antituberculosis drugs in Abidjan, Cote d′Ivoire. AIDS,1992,6：1327-1330.
8，World Health Organization Global Tuberculosis Programme. Guidelines on the management of drug-resistant tuberculosis. Geneva: WHO,1996.
, 百拇医药
9，Chaulet P, Boulahbal F, Grosset J. Surveillance of drug resistance for tuberculosis controls: why and how? Tuberc Lung Dis ,1995,76：487-492.
10，Canetti G, Fox W, Khomenko A, et al. Advances in techniques of testing mycobacterial drug sensitivity, and the use of sensitivity tests in tuberculosis control programmes. Bull WHO，1996,41：21-43.
, 百拇医药
摘 要 目的 比较不同标准和方法检测结核分支杆菌耐药性的结果。 方法 对158株临床分离的结核分支杆菌同时采用我国现行标准绝对浓度法、WHO/IUATLD推荐标准1%比例法和绝对浓度法检测药物敏感性。 结果 WHO/IUATLD规定的耐药性标准检测的耐药率为53.8%(85/158)，我国现行标准检测结果为50.0% (79/158)(P>0.05，差异无显著性)。WHO/IUATLD耐药性检测标准检测出耐INH、SM、EMB、RFP率分别为41.8%(66/158)、34.2%(54/158)、22.1%(35/158) 、27.8%(44/158) ，我国现行标准检测的结果分别为34.2%(54/158)、30.4%(48/158)、18.4%(29/158)、27.2%(43/158)；经统计学处理，两标准在检测耐药性时，除INH差异有显著性 (χ2＝18.4，P< 0.01)外，其余三种药物的检测结果差异无显著性。WHO/IUATLD耐药性检测标准应用1%比例法和绝对浓度法检测的结果一致。 结论 耐药性检测标准对药物敏感性检测结果有较大影响，但相应标准下采用不同的检测方法并不影响药物敏感性结果。
, http://www.100md.com
关键词：分支杆菌，结核 微生物敏感性试验
我国现行结核分支杆菌耐药性检测标准与世界卫生组织/国际防痨及肺部疾病联合会(WHO/IUATLD)推荐的耐药性检测标准存在一定差异[1,2]，造成两者检测结果的可比性较差。为了解不同标准和方法检测结核分支杆菌药物敏感性结果的差异，我们对158株临床分离的结核分支杆菌采用不同的方法检测药物敏感性，现将结果报告如下。
材料与方法
一、 材料
1. 标本来源：本所中心实验室保存的北京地区1995～1998年从临床复治患者分离的158株结核分支杆菌。
2. 参比菌株来源：H37Rv由中国药品生物制品检定所提供；每批实验将该菌株做为参比对照。
, 百拇医药
3. 检测药物：包括异烟肼(INH，批号：980903，含量：99.90%)、利福平(RFP，批号：980906，含量：99.78%)、链霉素(SM，批号：9806103，含量：76.92%)和乙胺丁醇(EMB，批号：980704，含量：99.67%)，由卫生部结核病控制中心国家参比实验室提供。
4. 培养基：对照(不含药)和含药培养基均使用L-J培养基，由本实验室按相应规程[1, 2]配制。
二、 方法
1. 待测菌株菌龄：L-J培养基传代，37℃孵育3周。
2. 绝对浓度法：药物检测浓度、方法和结果判定标准参照我国现行标准[1]。
3. WHO/IUATLD比例法：药物检测浓度参照WHO/IUATLD标准，使用L-J培养基，检测方法和结果判定采用1%比例法[2]。
, http://www.100md.com
4. WHO/IUATLD绝对浓度法：药物检测浓度参照WHO/IUATLD标准[2]，检测方法和结果判定标准采用绝对浓度法。简言之，待测菌株10-5 mg接种至对照(不含药)和含药的L-J培养基，37℃孵育4周观察结果。耐药结果判定标准参照我国现行标准[1]。
结果
一、WHO/IUATLD 1%比例法与绝对浓度法检测结果比较
待测菌株采用WHO/IUATLD耐药性检测标准，经绝对浓度法和1%比例法检测，两方法检测出的耐药率均为53.8%(85/185)，药敏试验结果一致。说明使用的测定方法对相应标准下的药敏检测结果无影响。
二、WHO/IUATLD 1%比例法与我国现行方法检测结果的比较
, 百拇医药
1. 药物敏感性结果的比较：158株试验菌株经不同检测标准和方法检测耐药性，结果见表1。
表1 WHO/IUATLD 1% 比例法与我国现行方法药敏试验结果比较(菌株数)
我国方法
WHO/IUATLD 1%比例法
合计
敏 感
耐 药
敏感
73
6
79
, 百拇医药
耐药
0
79
79
合计
73
85
158
由表1可见：WHO/IUATLD标准检测的耐药率为53.8%(85/158)，我国现行标准为50.0%(79/158)；经统计学处理，两标准检测结果差异无显著性 (χ2=0.46，P>0.05)。
2.各药物检测结果比较：见表2～5，可见WHO/IUATLD 1%比例法检测出耐INH、SM、EMB和RFP率分别为41.8%(66/158)、34.2%(54/15)、22.1%(35/158)和27.8%(44/158)；我国现行方法检测结果分别为34.2%(54/158)、30.4%(48/158)、18.4%(29/158)和27.2(43/158)。经统计学处理，两标准在检测INH时，耐药率差异具有显著性(χ2＝18.4，P<0.01)，其余三种药物两标准的检测结果差异无显著性(P>0.05)。
, http://www.100md.com
表2 WHO/IUATLD 1%比例法与我国现行方法检测INH药敏试验结果比较(菌株数)
我国方法
WHO/IUATLD 1%比例法
合计
敏感
耐药
敏感
91
13
104
耐药
1
, http://www.100md.com
53
54
合计
92
66
158
注：两种方法检测的耐药率比较χ2＝18.4，P< 0.01表3 WHO/IUATLD 1%比例法与我国现行方法检测SM药敏试验结果比较(菌株数)
我国方法
WHO/IUATLD 1%比例法
合计
敏感
, http://www.100md.com
耐药
敏感
104
6
110
耐药
0
48
48
合计
104
54
158
注：两种方法检测的耐药率比较χ2＝0.52，P> 0.05表4 WHO/IUATLD 1%比例法与我国现行方法检测EMB药敏试验结果比较(菌株数)
, http://www.100md.com
我国方法
WHO/IUATLD 1%比例法
合计
敏感
耐药
敏感
121
8
129
耐药
2
27
29
, http://www.100md.com
合计
123
35
158
注：两种方法检测的耐药率比较χ2＝0.71，P> 0.05表5 WHO/IUATLD 1%比例法与我国现行方法检测RFP药敏试验结果比较(菌株数)
我国方法
WHO/IUATLD 1%比例法
合计
敏感
耐药
敏感
, 百拇医药
113
2
115
耐药
1
42
43
合计
114
44
158
注：两种方法检测的耐药率比较χ2＝0.02，P> 0.05
讨论
, 百拇医药
近年来，结核病发病率上升以及结核分支杆菌对常用抗结核药物的耐药性特别是耐多药性(MDR)的增多，对国家结核病规划实施效果的影响正在日益增加[3-7]。基于目前状况，WHO/IUATLD建议，结核分支杆菌耐药性监测的结果应做为评价和改进国家结核病控制措施的重要参考因素之一[8]。为使国际上结核分支杆菌耐药性监测数据具有可比性，1997年WHO/IUATLD主持制定了标准化的结核分支杆菌药物敏感性监测指南[1]。该指南所规定的结核分支杆菌耐药性监测浓度标准有别于我国过去和当前规定的检测标准中采取的药物浓度。因此，需要评价耐药性检测时使用的药物浓度标准和检测方法对耐药性检测结果的影响，以便使我们检测的耐药性结果与国际上有可比性。
本实验结果表明：(1) 结核分支杆菌耐药性检测标准对所得结果具有一定影响。部分药物检测标准的浓度相差较大(如INH，我国现行检测标准与WHO/IUATLD规定的检测浓度相差达5倍)，不同检测标准的检测结果符合性较差。特别是对从复治患者分离的菌株，由于该部分菌株具有药物接触史，因此此类菌株经过药物筛选或可能因基因突变而导致待测菌株的最低抑菌浓度(MIC)发生变化。当采用浓度较低的WHO/IUATLD标准检测时，由于筛选出的耐药菌株增加，会直接影响耐药率的统计结果；对于原发耐药率的影响，尚需进一步试验予以证实。(2) 在相应检测标准下，使用的测定方法对检测结果不产生影响。尽管WHO/IUATLD推荐采用1%比例法进行药物敏感性的检测，但不排斥使用其它经质量控制证实结果可靠的方法进行耐药性的检测[1]，本实验的结果说明测定方法对相应标准下的检测结果不产生影响。但应注意的是我国目前规定的绝对浓度法，检测时的接种菌量较大(每支培养基接种10-3 mg菌)。有资料显示：较大的接种菌量可能造成耐药性检测结果出现伪耐药性，特别是检测的药物浓度较低时[9]。为此，Canetti等[10]曾建议：适宜的接种菌量应控制待测菌株在对照培养基上生长的菌落数为100～250个。这样，在测定耐药性时，每支培养基接种的活菌数量约相当于10-4～10-5 mg。
, http://www.100md.com
作者单位：丁北川(100035 北京结核病控制研究所)
赵亭(100035 北京结核病控制研究所)
盖亚茹(100035 北京结核病控制研究所)
屠德华 (100035 北京结核病控制研究所)
参考文献
1，中国防痨协会. 结核病诊断细菌学检验规程. 北京：中国防痨协会，1995.
2，WHO/IUATLD Global Working Group on Antituberculosis Drug Resistance Surveillance. Guideline for surveillance of drug resistance in tuberculosis. WHO/IUATLD，1997.
, 百拇医药
3，Cohn D, Bustreo F, Raviglion M. Drug resistance in tuberculosis: review of the world-wide situation and WHO/IUATLD global surveillance project. Clin Infect Dis, 1997, 24 Suppl 1：S121-S130.
4，Kochi A, Vareldzis B, Styblo K. Multi-drug resistant tuberculosis and its control. Res Microbiol, 1993,144：104-110.
5，Kim SJ, Hong YP. Drug resistance of Mycobacterium tuberculosis in Korea. Tuberc Lung Dis ,1992,73：219-224.
, 百拇医药
6，Frieden DR, Sterling T, Pablos-Mendez A, et al. The emergence of drug-resistant tuberculosis in New York City. N Engl J Med,1993,328：521-526.
7，Braun MM, Kiburn JO, Smithwick RW,et al. HIV infection and primary resistance to antituberculosis drugs in Abidjan, Cote d′Ivoire. AIDS,1992,6：1327-1330.
8，World Health Organization Global Tuberculosis Programme. Guidelines on the management of drug-resistant tuberculosis. Geneva: WHO,1996.
, 百拇医药
9，Chaulet P, Boulahbal F, Grosset J. Surveillance of drug resistance for tuberculosis controls: why and how? Tuberc Lung Dis ,1995,76：487-492.
10，Canetti G, Fox W, Khomenko A, et al. Advances in techniques of testing mycobacterial drug sensitivity, and the use of sensitivity tests in tuberculosis control programmes. Bull WHO，1996,41：21-43.
, 百拇医药