异基因外周血干细胞移植供者CD34细胞及亚群的测定
异基因外周血干细胞移植供者CD34细胞及亚群的测定
许勇钢 王洪蓓 麻柔 江岷 阎安文 陈虎
摘要 目的：探讨流式细胞技术测定异基因外周血干细胞移植(allo-PBSCT)中供者细胞表面分化抗原34(CD34+)细胞及其亚群变化和意义。方法：应用流式细胞多色分析技术，测定151份allo-PBSCT供者，经细胞因子动员后外周血标本CD34+及其亚群变化及影响因素。结果：在检测的151份标本中，CD34+细胞占外周血单个核细胞的(0.954±0.466)%，含量为(3.55±2.41)×109/L；其中CD34+CD38-亚群含量为(0.253±0.240)×109/L，占CD34+细胞的6.78%；CD34+HLA-DR-亚群含量为(0.273±0.310)×109/L，占CD34+细胞的6.82%，两者差异无显著意义(P>0.05)；随着采集次数的增加，CD34+细胞及其亚群数量逐渐减少(P<0.05)；随着供者年龄增加，其外周血CD34+细胞数逐渐减少，≥40岁供者CD34+细胞百分比和含量比<20岁供者分别降低了47%和50%；动员后外周血CD34+细胞数存在性别差异，男性供者外周血CD34+细胞数较女性高23%。结论：应用流式细胞多色技术测定外周血造血干祖细胞，不仅能确定造血细胞数量，而且对造血干祖细胞的质量进行评价，为临床干细胞移植治疗提供重要数据。
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关键词：流式细胞仪；异基因外周血干细胞移植
细胞表面分化抗原34(CD34)抗原是一种分子量约11万的糖蛋白，选择性地表达于早期造血干/祖细胞、小血管内皮细胞和胚胎纤维母细胞表面。该抗原在原始造血细胞上表达最高，以后随细胞分化、成熟逐渐减少直至消失，因此一直作为造血干/祖细胞表面的一种特征性标志而广泛应用于造血干细胞基础研究和临床[1]。CD34+细胞是一群不均一的群体，依其是否表达CD38、HLA-DR、CD33、c-kit等分出的亚群表现出了不同的造血性能[2-4]。我们应用流式细胞多色荧光技术测定了71名异基因外周血干细胞移植(allo-PBSCT)供者动员后151份外周血中CD34+、CD34+CD38-、CD34+CD38+、CD34+HLA-DR-、CD34+HLA-DR+等指标，并进行相关研究分析。初步报告如下。
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材料和方法
一、标本来源
151份标本来自71名allo-PBSCT供者外周血，均为军事医学科学院造血干细胞移植中心标本。其中男性36人，女性35人；平均年龄31岁(12～55岁)，年龄分布在不同性别之间无明显差异，连续皮下注射细胞因子(G-CSF和/或GM-CSF)进行动员，第5 d开始用血细胞分离机(CS-3 000 plus型 美国 Baxter公司)采集外周血单个核细胞(MNC)标本，采用干细胞采集程序，每次循环血量为10 000 ml，每次采集MNC细胞为50 ml，每天采集一次，共采集2～3次/人。
二、试剂与仪器
1.试剂：三色荧光直标单克隆抗体CD34-PE/CD38-FITC/HLA-DR-Pc5， CD4-FITC/CD8-PE/CD3-Pc5，双色单抗CD3-FITC/CD19-PE、CD3-FITC/CD56-PE，阴性对照IgG-FITC/IgG-PE/IgG-Pc5，红细胞裂解液均购自法国Immunothch公司；标准荧光微球购自法国Immunothch公司和美国BD公司。
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2.仪器：EPICS Elite型流式细胞仪(美国Coulter公司)，CELL-DYN1500型自动血细胞分析仪(美国Abbott公司)。
三、方法
1.标本制备：应用自动血细胞分析仪记数有核细胞数，每支试管中细胞数2×106个，分别加入CD38-FITC/CD34-PE/HLA-DR-Pc5、CD4-FITC/CD8-PE/CD3-Pc5、CD3-FITC/CD19-PE、CD3FITC/CD56PE抗体；避光4℃孵育30 min，用PBS洗涤1次，加红细胞裂解液10 min。阴性对照管加入小鼠IgG-FITC/IgG-PE/IgG-Pc5，其他步骤同上(注：标本的淋巴细胞亚群、NK细胞数的临床意义另文发表)。
2.流式细胞仪测定：打开流式细胞仪及氩激光光源(488 nm)预热20 min，同时仪器自动初始化；应用标准荧光微球校准激光光路和荧光补偿，然后依次检测标本，在前向散射光(FS)和侧向散射光(SS)散点图中圈定细胞群，选择外周血单个核细胞(MNCs)为分析对象，去除细胞碎片；用阴性对照确定荧光阴性范围。每份标本测定20 000个以上细胞，用ELITE4.5软件进行多参数分析。
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3.统计学处理：采用EXCEL97进行F检验和t检验等。
结果
1.动员后正常供者外周血CD34+及其亚群的数量：MNC中，CD34+细胞占(0.954±0.466)%，含量为(3.55±2.41)×109/L，其中CD34+CD38-亚群含量为(0.253±0.24)×109/L，占CD34+细胞的6.78%；CD34+HLA-DR-亚群含量为(0.273±0.310)×109/L，占CD34+细胞的6.82%，两者差异无显著性意义(P>0.05)(表1)。
表1 动员后正常供者外周血CD34+及其亚群
, 百拇医药
的数量(x±s)
项目
占MNCs
百分比(%)
含量
(×109/L)
占CD34+
百分比(%)
MNC
365.30±1.12
-
CD34+
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0. 95±0.47
3.55±2.41
-
CD34+CD38-
0.07±0.05
0.25±0.24
6.78±2.47
CD34+CD38+
0.89±0.43
3.30±2.20
93.15±2.72
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CD34+HLA-DR-
0.07±0.07
0.27±0.31
6.83±3.15
CD34+HLA-DR+
0.89±0.43
3.29±2.20
93.18±3.37
表2 动员后正常供者外周血CD34+及其亚群与采集次数关系(x±s)
项目
, 百拇医药
MNC
绝对值
(×109/L)
CD34+
CD34+CD38-
CD34+CD38+
CD34+HLA-DR-
CD34+HLA-DR+
MNCs
, 百拇医药 (%)
绝对值
(×109/L)
MNCs
(%)
绝对值
(×109/L)
MNCs
(%)
绝对值
(×109/L)
MNCs
, 百拇医药
(%)
绝对值
(×109/L)
MNCs
(%)
绝对值
(×109/L)
第一次
374.8±
119.0
1.07±
0.47
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4.02±
2.53
0.075±
0.050
0.291±
0.270
0.99±
0.43
3.73±
2.30
0.073±
0.047
0.284±
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0.235
0.99±
0.43
3.74±
2.33
第二次
361.9±
100.2
0.90±
0.44*
3.37±
2.26*
, 百拇医药
0.062±
0.025
0.238±
0.210*
0.84±
0.41
3.13±
2.08*
0.065±
0.085
0.242±
2.31*
, 百拇医药
0.83±
0.40
3.12±
2.04*
2.动员后正常供者外周血CD34+及其亚群与采集次数关系：71名供者均采集2次以上，其中9名采集3次，观察71名供者不同采集次数中CD34+细胞及其亚群变化，结果90%供者(64/71)第2次采集CD34+细胞及其亚群数量较第1次有不同程度减少(表2)，从9名采集3次的供者分析，随着采集次数的增加，CD34+细胞及其亚群数量有逐渐下降趋势(图1)。
图1 采集3次的供者(9人)，不同采集次数与CD34+细胞及亚群数量比较
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表3 动员后正常供者外周血CD34+细胞数与供者
年龄的关系(x±s)
年龄分组
(岁)
标本
数
CD34+在MNCs中
百分比(%)
CD34+细胞
含量(×109/L)
<20
, 百拇医药
28
1.392±0.624
5.845±3.865
20～
41
1.095±0.589*
3.333±1.929*
30～
56
0.888±0.358*△
3.249±1.769*
, 百拇医药
≥40
26
0.739±0.233**△△
2.941±1.762**△△
与<20岁比较，*P<0.05，**P<0.01；与20～岁比较，△P<0.05，△△P<0.01 3.动员后正常供者外周血CD34+细胞数与供者年龄的关系：按照71名供者年龄大小, 分为4个年龄组，分析供者年龄与动员后采集外周血CD34+细胞数的关系，发现<20岁组其CD34+在MNC中百分比和CD34+细胞含量最高，随着年龄增加，CD34+细胞数逐渐降低，在≥40岁组供者CD34+细胞百分比和含量比<20岁组分别降低了47%和50%。
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4.动员后正常供者外周血CD34+细胞数与供者性别的关系：男性供者动员后外周血CD34+细胞百分数和含量均高于女性(P<0.05)(表4)。
表4 动员后正常供者外周血CD34+细胞数与供者性别的关系(x±s)
性别
年龄
标本数
MNCs(×109/L)
CD34+在MNCs中百分比(%)
CD34+细胞含量(×109/L)
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男性
31±11
79
375.9±106.4
1.055±0.432
3.997±2.119
女性
31± 8
72
351.8±112.3
0.883±0.472*
3.243±2.521*
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*与男性比 P<0.05讨论
自1989年Kessinger等报道了世界上首例allo-PBSCT获得成功以来，allo-PBSCT技术被越来越多的应用于临床治疗。而外周血干/祖细胞的质与量的准确测定是allo-PBSCT成功的关键之一[6]。CD34抗原主要表达早期干祖细胞上，占正常人骨髓MNC1.5%左右，外周血CD34+细胞约为骨髓的1/10[1]。应用流式细胞多色分析技术配合其他细胞标记(CD38、HLA-DR等)可将CD34+细胞进一步分成造血干细胞(CD34+CD38-、CD34+HLA-DR-)和造血祖细胞(CD34+CD38+、CD34+HLA-DR+)，前者富含长期培养启始细胞(LTC-IC)及早期造血细胞，扩增效率高，分化速度较慢，具有很强的自我更新能力和长期造血能力，后者形成造血细胞集落能力强，在扩增的同时出现明显分化现象，难于重建长期造血[3-7]。因此，测定CD34+细胞及其亚群就显得十分必要和重要。
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我们采用流式细胞多色分析技术分析，测定71名allo-PBSCT 供者共151份外周血CD34+细胞及其亚群。结果显示：CD34+细胞在动员后外周血MNC中占0.95%，CD34+CD38-细胞、CD34+HLA-DR细胞分别占CD34+细胞的6.78%和6.82%，与文献报道相似[5，6]。
以往研究证实：应用G-CSF动员造血干细胞，可使外周血中造血干细胞、祖细胞增加，并且自我复制能力增强，连续皮下注射5～6 d外周血中造血干细胞达到高峰，随后很快下降[5，8]，我们对71例供者不同采集次数(G-CSF连续皮下注射，第5 d进行第一次采集)CD34+细胞及其亚群变化进行了分析，结果90%供者(64/71)第2次采集CD34+细胞及其亚群数量较第1次有不同程度减少，从9例采集3次的供者分析，随着采集次数的增加，CD34+细胞及其亚群数量均有逐渐下降趋势。分析下降因素可能是(1)采集造血干祖细胞后，体内造血干祖细胞库短时间内未能恢复；(2)细胞因子动员造血干细胞峰值多出现在第5 d，其后造血干祖细胞数多开始下降。
, 百拇医药
对于健康人而言，不同年龄段外周血中造血干祖细胞的含量不同[9]。我们的研究结果显示：<20岁供者CD34+在MNC中百分比和CD34+细胞含量最高，随着年龄增加，CD34+细胞数逐渐降低，在≥40岁供者CD34+细胞百分比和含量比<20岁组分别降低了47%和50%，提示临床进行allo-PBSCT供者选择上，有条件者应尽量选择年轻者，这样更容易获得足够造血干祖细胞。
对于性别与外周血干祖细胞数量关系，我们研究结果显示健康男性动员后外周血CD34+细胞数高于女性，平均高出23%，其机理有待进一步研究。
应用流式细胞仪测定造血干细胞，具有快速、准确的特点，目前被广泛采用。应用中要特别重视质量控制[10]，要建立一套完整质控方法以确保检测的准确性。我们应用流式细胞多色技术测定外周血造血干祖细胞，不仅能确定造血细胞数量，而且就其亚群分析能对造血干祖细胞的质量进行评价，为临床干细胞移植治疗提供重要数据。
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作者单位：许勇钢(100091 北京， 中国中医研究院西苑医院血液科)
王洪蓓(100091 北京， 中国中医研究院西苑医院血液科)
麻柔(100091 北京， 中国中医研究院西苑医院血液科)
江岷(军事医学科学院造血干细胞移植中心)
阎安文(军事医学科学院造血干细胞移植中心)
陈虎(军事医学科学院造血干细胞移植中心)
参考文献
1，李强，张之南，潘华珍.CD34抗原的结构、功能和临床应用. 中华血液学杂志, 1997，18：278-281.
, 百拇医药
2，Pei XT, Wu CT, Coutinho LH, et al. Human primitive hematopoietic progenitor cells are more enriched in CD34+CD38- population than in CD34+CD38+ population. J Exp Hematol, 1995, 3:152-155.
3，Huang S, Terstappen LW. Lymphoid and myeloid differentiation of single human CD34+, HLA-DR+, CD38- hematopoietic stme cells. Blood, 1994,83:1515-1526.
4，Andrews RG, Singer JW, Bernstein ID. Precursors of colony-forming cell by expression of the CD33 and CD34 angigens and light scattering properties. J Exp Med, 1989,169:1331-1335.
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5，唐纬,沈志祥.造血干细胞移植的临床应用.见: 沈志祥，欧阳仁荣,主编. 血液肿瘤学.北京:人民卫生出版社,1999.130-138.
6，蕺田精昭，木村贵文.末梢血细胞量的质的评价法.医学のあゆみ，1996,176:561-565.
7，裴雪涛.新一代细胞疗法：造血祖细胞体外扩增与定向诱导分化. 中国实验血液学杂志，1998；6：1-4.
8，原田实根.同种末梢血细胞移植の可能性と问题点.医学のあゆみ， 1996,176:624-628.
9，于汀, 沈志祥.外周血干细胞移植. 见: 沈志祥，欧阳仁荣,主编. 血液肿瘤学. 北京:人民卫生出版社,1999.173-179.
10，Chin-Yee I, Anderson L, Keeney M, et al .Quality assurance of stem cell enumeration by flow cytomeyry. Cytometry, 1997,30:296-303., http://www.100md.com
许勇钢 王洪蓓 麻柔 江岷 阎安文 陈虎
摘要 目的：探讨流式细胞技术测定异基因外周血干细胞移植(allo-PBSCT)中供者细胞表面分化抗原34(CD34+)细胞及其亚群变化和意义。方法：应用流式细胞多色分析技术，测定151份allo-PBSCT供者，经细胞因子动员后外周血标本CD34+及其亚群变化及影响因素。结果：在检测的151份标本中，CD34+细胞占外周血单个核细胞的(0.954±0.466)%，含量为(3.55±2.41)×109/L；其中CD34+CD38-亚群含量为(0.253±0.240)×109/L，占CD34+细胞的6.78%；CD34+HLA-DR-亚群含量为(0.273±0.310)×109/L，占CD34+细胞的6.82%，两者差异无显著意义(P>0.05)；随着采集次数的增加，CD34+细胞及其亚群数量逐渐减少(P<0.05)；随着供者年龄增加，其外周血CD34+细胞数逐渐减少，≥40岁供者CD34+细胞百分比和含量比<20岁供者分别降低了47%和50%；动员后外周血CD34+细胞数存在性别差异，男性供者外周血CD34+细胞数较女性高23%。结论：应用流式细胞多色技术测定外周血造血干祖细胞，不仅能确定造血细胞数量，而且对造血干祖细胞的质量进行评价，为临床干细胞移植治疗提供重要数据。
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关键词：流式细胞仪；异基因外周血干细胞移植
细胞表面分化抗原34(CD34)抗原是一种分子量约11万的糖蛋白，选择性地表达于早期造血干/祖细胞、小血管内皮细胞和胚胎纤维母细胞表面。该抗原在原始造血细胞上表达最高，以后随细胞分化、成熟逐渐减少直至消失，因此一直作为造血干/祖细胞表面的一种特征性标志而广泛应用于造血干细胞基础研究和临床[1]。CD34+细胞是一群不均一的群体，依其是否表达CD38、HLA-DR、CD33、c-kit等分出的亚群表现出了不同的造血性能[2-4]。我们应用流式细胞多色荧光技术测定了71名异基因外周血干细胞移植(allo-PBSCT)供者动员后151份外周血中CD34+、CD34+CD38-、CD34+CD38+、CD34+HLA-DR-、CD34+HLA-DR+等指标，并进行相关研究分析。初步报告如下。
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材料和方法
一、标本来源
151份标本来自71名allo-PBSCT供者外周血，均为军事医学科学院造血干细胞移植中心标本。其中男性36人，女性35人；平均年龄31岁(12～55岁)，年龄分布在不同性别之间无明显差异，连续皮下注射细胞因子(G-CSF和/或GM-CSF)进行动员，第5 d开始用血细胞分离机(CS-3 000 plus型 美国 Baxter公司)采集外周血单个核细胞(MNC)标本，采用干细胞采集程序，每次循环血量为10 000 ml，每次采集MNC细胞为50 ml，每天采集一次，共采集2～3次/人。
二、试剂与仪器
1.试剂：三色荧光直标单克隆抗体CD34-PE/CD38-FITC/HLA-DR-Pc5， CD4-FITC/CD8-PE/CD3-Pc5，双色单抗CD3-FITC/CD19-PE、CD3-FITC/CD56-PE，阴性对照IgG-FITC/IgG-PE/IgG-Pc5，红细胞裂解液均购自法国Immunothch公司；标准荧光微球购自法国Immunothch公司和美国BD公司。
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2.仪器：EPICS Elite型流式细胞仪(美国Coulter公司)，CELL-DYN1500型自动血细胞分析仪(美国Abbott公司)。
三、方法
1.标本制备：应用自动血细胞分析仪记数有核细胞数，每支试管中细胞数2×106个，分别加入CD38-FITC/CD34-PE/HLA-DR-Pc5、CD4-FITC/CD8-PE/CD3-Pc5、CD3-FITC/CD19-PE、CD3FITC/CD56PE抗体；避光4℃孵育30 min，用PBS洗涤1次，加红细胞裂解液10 min。阴性对照管加入小鼠IgG-FITC/IgG-PE/IgG-Pc5，其他步骤同上(注：标本的淋巴细胞亚群、NK细胞数的临床意义另文发表)。
2.流式细胞仪测定：打开流式细胞仪及氩激光光源(488 nm)预热20 min，同时仪器自动初始化；应用标准荧光微球校准激光光路和荧光补偿，然后依次检测标本，在前向散射光(FS)和侧向散射光(SS)散点图中圈定细胞群，选择外周血单个核细胞(MNCs)为分析对象，去除细胞碎片；用阴性对照确定荧光阴性范围。每份标本测定20 000个以上细胞，用ELITE4.5软件进行多参数分析。
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3.统计学处理：采用EXCEL97进行F检验和t检验等。
结果
1.动员后正常供者外周血CD34+及其亚群的数量：MNC中，CD34+细胞占(0.954±0.466)%，含量为(3.55±2.41)×109/L，其中CD34+CD38-亚群含量为(0.253±0.24)×109/L，占CD34+细胞的6.78%；CD34+HLA-DR-亚群含量为(0.273±0.310)×109/L，占CD34+细胞的6.82%，两者差异无显著性意义(P>0.05)(表1)。
表1 动员后正常供者外周血CD34+及其亚群
, 百拇医药
的数量(x±s)
项目
占MNCs
百分比(%)
含量
(×109/L)
占CD34+
百分比(%)
MNC
365.30±1.12
-
CD34+
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0. 95±0.47
3.55±2.41
-
CD34+CD38-
0.07±0.05
0.25±0.24
6.78±2.47
CD34+CD38+
0.89±0.43
3.30±2.20
93.15±2.72
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CD34+HLA-DR-
0.07±0.07
0.27±0.31
6.83±3.15
CD34+HLA-DR+
0.89±0.43
3.29±2.20
93.18±3.37
表2 动员后正常供者外周血CD34+及其亚群与采集次数关系(x±s)
项目
, 百拇医药
MNC
绝对值
(×109/L)
CD34+
CD34+CD38-
CD34+CD38+
CD34+HLA-DR-
CD34+HLA-DR+
MNCs
, 百拇医药 (%)
绝对值
(×109/L)
MNCs
(%)
绝对值
(×109/L)
MNCs
(%)
绝对值
(×109/L)
MNCs
, 百拇医药
(%)
绝对值
(×109/L)
MNCs
(%)
绝对值
(×109/L)
第一次
374.8±
119.0
1.07±
0.47
, http://www.100md.com
4.02±
2.53
0.075±
0.050
0.291±
0.270
0.99±
0.43
3.73±
2.30
0.073±
0.047
0.284±
, http://www.100md.com
0.235
0.99±
0.43
3.74±
2.33
第二次
361.9±
100.2
0.90±
0.44*
3.37±
2.26*
, 百拇医药
0.062±
0.025
0.238±
0.210*
0.84±
0.41
3.13±
2.08*
0.065±
0.085
0.242±
2.31*
, 百拇医药
0.83±
0.40
3.12±
2.04*
2.动员后正常供者外周血CD34+及其亚群与采集次数关系：71名供者均采集2次以上，其中9名采集3次，观察71名供者不同采集次数中CD34+细胞及其亚群变化，结果90%供者(64/71)第2次采集CD34+细胞及其亚群数量较第1次有不同程度减少(表2)，从9名采集3次的供者分析，随着采集次数的增加，CD34+细胞及其亚群数量有逐渐下降趋势(图1)。
图1 采集3次的供者(9人)，不同采集次数与CD34+细胞及亚群数量比较
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表3 动员后正常供者外周血CD34+细胞数与供者
年龄的关系(x±s)
年龄分组
(岁)
标本
数
CD34+在MNCs中
百分比(%)
CD34+细胞
含量(×109/L)
<20
, 百拇医药
28
1.392±0.624
5.845±3.865
20～
41
1.095±0.589*
3.333±1.929*
30～
56
0.888±0.358*△
3.249±1.769*
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≥40
26
0.739±0.233**△△
2.941±1.762**△△
与<20岁比较，*P<0.05，**P<0.01；与20～岁比较，△P<0.05，△△P<0.01 3.动员后正常供者外周血CD34+细胞数与供者年龄的关系：按照71名供者年龄大小, 分为4个年龄组，分析供者年龄与动员后采集外周血CD34+细胞数的关系，发现<20岁组其CD34+在MNC中百分比和CD34+细胞含量最高，随着年龄增加，CD34+细胞数逐渐降低，在≥40岁组供者CD34+细胞百分比和含量比<20岁组分别降低了47%和50%。
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4.动员后正常供者外周血CD34+细胞数与供者性别的关系：男性供者动员后外周血CD34+细胞百分数和含量均高于女性(P<0.05)(表4)。
表4 动员后正常供者外周血CD34+细胞数与供者性别的关系(x±s)
性别
年龄
标本数
MNCs(×109/L)
CD34+在MNCs中百分比(%)
CD34+细胞含量(×109/L)
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男性
31±11
79
375.9±106.4
1.055±0.432
3.997±2.119
女性
31± 8
72
351.8±112.3
0.883±0.472*
3.243±2.521*
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*与男性比 P<0.05讨论
自1989年Kessinger等报道了世界上首例allo-PBSCT获得成功以来，allo-PBSCT技术被越来越多的应用于临床治疗。而外周血干/祖细胞的质与量的准确测定是allo-PBSCT成功的关键之一[6]。CD34抗原主要表达早期干祖细胞上，占正常人骨髓MNC1.5%左右，外周血CD34+细胞约为骨髓的1/10[1]。应用流式细胞多色分析技术配合其他细胞标记(CD38、HLA-DR等)可将CD34+细胞进一步分成造血干细胞(CD34+CD38-、CD34+HLA-DR-)和造血祖细胞(CD34+CD38+、CD34+HLA-DR+)，前者富含长期培养启始细胞(LTC-IC)及早期造血细胞，扩增效率高，分化速度较慢，具有很强的自我更新能力和长期造血能力，后者形成造血细胞集落能力强，在扩增的同时出现明显分化现象，难于重建长期造血[3-7]。因此，测定CD34+细胞及其亚群就显得十分必要和重要。
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我们采用流式细胞多色分析技术分析，测定71名allo-PBSCT 供者共151份外周血CD34+细胞及其亚群。结果显示：CD34+细胞在动员后外周血MNC中占0.95%，CD34+CD38-细胞、CD34+HLA-DR细胞分别占CD34+细胞的6.78%和6.82%，与文献报道相似[5，6]。
以往研究证实：应用G-CSF动员造血干细胞，可使外周血中造血干细胞、祖细胞增加，并且自我复制能力增强，连续皮下注射5～6 d外周血中造血干细胞达到高峰，随后很快下降[5，8]，我们对71例供者不同采集次数(G-CSF连续皮下注射，第5 d进行第一次采集)CD34+细胞及其亚群变化进行了分析，结果90%供者(64/71)第2次采集CD34+细胞及其亚群数量较第1次有不同程度减少，从9例采集3次的供者分析，随着采集次数的增加，CD34+细胞及其亚群数量均有逐渐下降趋势。分析下降因素可能是(1)采集造血干祖细胞后，体内造血干祖细胞库短时间内未能恢复；(2)细胞因子动员造血干细胞峰值多出现在第5 d，其后造血干祖细胞数多开始下降。
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对于健康人而言，不同年龄段外周血中造血干祖细胞的含量不同[9]。我们的研究结果显示：<20岁供者CD34+在MNC中百分比和CD34+细胞含量最高，随着年龄增加，CD34+细胞数逐渐降低，在≥40岁供者CD34+细胞百分比和含量比<20岁组分别降低了47%和50%，提示临床进行allo-PBSCT供者选择上，有条件者应尽量选择年轻者，这样更容易获得足够造血干祖细胞。
对于性别与外周血干祖细胞数量关系，我们研究结果显示健康男性动员后外周血CD34+细胞数高于女性，平均高出23%，其机理有待进一步研究。
应用流式细胞仪测定造血干细胞，具有快速、准确的特点，目前被广泛采用。应用中要特别重视质量控制[10]，要建立一套完整质控方法以确保检测的准确性。我们应用流式细胞多色技术测定外周血造血干祖细胞，不仅能确定造血细胞数量，而且就其亚群分析能对造血干祖细胞的质量进行评价，为临床干细胞移植治疗提供重要数据。
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作者单位：许勇钢(100091 北京， 中国中医研究院西苑医院血液科)
王洪蓓(100091 北京， 中国中医研究院西苑医院血液科)
麻柔(100091 北京， 中国中医研究院西苑医院血液科)
江岷(军事医学科学院造血干细胞移植中心)
阎安文(军事医学科学院造血干细胞移植中心)
陈虎(军事医学科学院造血干细胞移植中心)
参考文献
1，李强，张之南，潘华珍.CD34抗原的结构、功能和临床应用. 中华血液学杂志, 1997，18：278-281.
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2，Pei XT, Wu CT, Coutinho LH, et al. Human primitive hematopoietic progenitor cells are more enriched in CD34+CD38- population than in CD34+CD38+ population. J Exp Hematol, 1995, 3:152-155.
3，Huang S, Terstappen LW. Lymphoid and myeloid differentiation of single human CD34+, HLA-DR+, CD38- hematopoietic stme cells. Blood, 1994,83:1515-1526.
4，Andrews RG, Singer JW, Bernstein ID. Precursors of colony-forming cell by expression of the CD33 and CD34 angigens and light scattering properties. J Exp Med, 1989,169:1331-1335.
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5，唐纬,沈志祥.造血干细胞移植的临床应用.见: 沈志祥，欧阳仁荣,主编. 血液肿瘤学.北京:人民卫生出版社,1999.130-138.
6，蕺田精昭，木村贵文.末梢血细胞量的质的评价法.医学のあゆみ，1996,176:561-565.
7，裴雪涛.新一代细胞疗法：造血祖细胞体外扩增与定向诱导分化. 中国实验血液学杂志，1998；6：1-4.
8，原田实根.同种末梢血细胞移植の可能性と问题点.医学のあゆみ， 1996,176:624-628.
9，于汀, 沈志祥.外周血干细胞移植. 见: 沈志祥，欧阳仁荣,主编. 血液肿瘤学. 北京:人民卫生出版社,1999.173-179.
10，Chin-Yee I, Anderson L, Keeney M, et al .Quality assurance of stem cell enumeration by flow cytomeyry. Cytometry, 1997,30:296-303., http://www.100md.com