产超广谱β内酰胺酶大肠杆菌的检测及其耐药表型和基因型
沈定霞 Jones RN 吴坚 徐雅萍
摘 要 目的 研究临床分离的产超广谱β内酰胺酶(extended spectrum β lactamases, ESBLs)大肠杆菌对常用抗生素的耐药性及其基因类型。 方法 应用双纸片扩散法及E test检测ESBLs；微量稀释法测定产ESBLs大肠杆菌对临床常用抗生素的耐药性；全自动核型分析和脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis, PFGE)研究产ESBLs大肠杆菌的基因型。 结果 23株产ESBLs大肠杆菌共有12种耐药表型，4种核型及9种脉冲场凝胶电泳分型。耐药表型中，以对庆大霉素、妥布霉素、环丙沙星、四环素及TMP/SMZ同时耐药组合最常见，占39.1%；基因分型中，核型/PFGE型：242-5/2 与242-5/4各4株分别分离自肝胆外科和血液科，3株880-1/1a分离自高级病房，其余基因型呈散在分布于多个病房。 结论 产ESBLs大肠杆菌对常用抗生素具有多种耐药表型；核型分析及脉冲场凝胶电泳是进行产ESBLs细菌引起医院感染流行病学研究的有效手段。
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关键词：大肠杆菌 耐药性 基因型
三代头孢类抗生素如头孢噻肟、头孢曲松和头孢他啶在临床上的广泛应用，导致对这类抗生素耐药的细菌不断增多，这种对三代头孢类抗生素耐药的主要原因是细菌产生了较广谱β内酰胺酶作用底物更广的超广谱β内酰胺酶(ESBLs)〔1〕。大肠杆菌和肺炎克雷伯菌是产生ESBLs最常见的医院感染病原菌。已有不少关于由产ESBLs细菌引起的医院感染暴发流行的报道〔2,3〕，且产ESBLs细菌可同时对多种抗生素产生耐药性，因此产ESBLs细菌感染已成为目前世界性关注的重要感染问题之一。
本研究对用双纸片协同试验和E test检测出的产ESBLs大肠杆菌进一步分析其耐药表型和基因型，从而了解产ESBLs大肠杆菌对常用抗生素的耐药情况及其在本院的流行情况。
材料与方法
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菌株：选择本院自1997年1月至1998年5月从临床分离的经Kirby Bauer纸片法(K-B法)测定对头孢噻肟和头孢曲松抑菌圈直径分别≤27mm和≤25mm的大肠杆菌27株，所有菌株应用ViteK GNI系统进行鉴定。
抗生素敏感试验：含多种不同稀释度抗生素的96孔板(由美国PML Microbiologicals公司提供)微量稀释法抗生素敏感试验的操作和结果解释按NCCLS(1997)标准〔4〕进行。抗生素包括阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、环丙沙星、四环素、TMP/SMZ、亚胺培南等。
ESBLs检测
1.双纸片协同试验初筛：将阿莫西林/棒酸纸片置培养皿中央，在其周围20mm处贴头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松和氨曲南纸片(抗生素纸片购自Oxoid公司)，35℃培养18?h，如在阿莫西林/棒酸纸片与其周围任何一种纸片间出现协同抑菌作用视为产超广谱β内酰胺酶初筛阳性。
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2.浓度梯度法确证：使用瑞士AB Biodisk公司提供的E test试条，按该公司推荐方法操作。E test试条包括含有及不含棒酸的头孢他啶、头孢噻肟和氨曲南，棒酸能使MIC值降低8倍以上者为ESBLs确认阳性。
核型检测：采用美国Qualicon公司的RiboPrinter Microbial Characterization System，此自动过程包括菌细胞溶解、限制性内切酶EcoRⅠ对细菌DNA的酶切、DNA片段的凝胶电泳分离、Southern膜转印及用已标记的来源于大肠杆菌rRNA操纵子的DNA探针与所分离的DNA片段进行杂交。根据DNA条带的位置和强度进行自动核型分析并与计算机保存的其它核型进行比较，若相似系数≥0.93则认为具有相同核型。
脉冲场凝胶电泳：参考Pfaller等人〔5〕方法，用限制性内切酶SpeⅠ消化细菌染色体DNA，用1%琼脂糖凝胶于Bio-Rad公司生产的CHEF-DRⅡ型脉冲场凝胶电泳仪上进行电泳。脉冲时间5～60?s，温度13℃，电压200V，电泳时间23?h。比较每个菌株的电泳条带，如3条以上电泳带不相同，视为不同分型，1～3条带不同视为不同亚型。
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细菌β内酰胺酶制备：将细菌接种于5ml胰大豆液，培养过夜，取0.5ml稀释于9.5ml新鲜胰大豆液中，37℃振荡培养5?h，离心收集细胞并悬浮于250μl 0.2mol/L醋酸钠(pH5.5)中，采用干冰和37℃水浴，反复冻融，然后置冰浴30?min，4℃离心，收集上清，即为β内酰胺酶粗提物，用500μg/ml nitrocefin 检测其活性，保存于-70℃，作为等电聚焦电泳样品。
等电聚焦电泳：在Pharmacia公司的Multiphor Electrophoresis UnitⅡ及含有两性电解质的聚丙烯酰胺凝胶上进行，两性电解质的pH范围为3.5～9.5，5.5～8.5及4.0～6.5，并用已知等电点值(pI)的β内酰胺酶TEM-1(pI：5.4)，TEM-4(pI：5.9)，SHV-1 (pI：7.6)，SHV-3 (pI：7.0 )，SHV-5(pI：8.2)作为等电点判断的标准。
结果
, 百拇医药
1.ESBLs检测
(1)双纸片协同试验初筛：从27株大肠杆菌中，初步检出23株ESBLs阳性菌，结果见表1。
表1 27株耐三代头孢的大肠杆菌双纸片协同试验初筛结果
Table 1. Double disk synergy test results of 27 E. coli strains resistant to the third generation cephalosporins
Ceftazidime
Ceftriaxone
Cefotaxime
Aztreonam
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Positive strains
18
18
17
23
Percentage
67%
67%
63%
85%
(2)E test确认：结果见表2。
(3)β内酰胺酶等电点：等电聚焦凝胶电泳结果显示每一产ESBLs大肠杆菌具有2～4种不同等电点的β内酰胺酶，20株菌具有TEM-1(pI：5.4)，15株菌等电点为8.4，其余β内酰胺酶的等电点分别为7.3、7.6和7.9。
, 百拇医药
2.抗生素耐药表型：23株产ESBLs大肠杆菌对环丙沙星、TMP/SMZ及四环素的耐药率分别为95.7%、82.6%及78.3%，根据它们对阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、环丙沙星、四环素及TMP/SMZ共同耐药组合的差异，可分为12种耐药表型，3株菌对以上6种抗生素均耐药，9株菌对除阿米卡星以外的其余5种抗生素同时耐药，2株菌对除阿米卡星和TMP/SMZ外的其余4种抗生素耐药，另有9株分别显示独特的共同耐药模式，如表2。尽管所有产ESBLs大肠杆菌对亚胺培南敏感，但仅1株对氨基糖甙类3种药物均敏感(No.108700)。
3.核型及脉冲场凝胶电泳分型：23株产ESBLs大肠杆菌可分为4种核型及9种脉冲场凝胶电泳型，其中核型242-5最多(11株，占47.8%)，脉冲场凝胶电泳1a及2、4型较多见，各占4株，如表3。核型/PFGE型：242-5/2、242-5/4和880-1/1a分别分离自我院肝胆外科、血液科和高级病房，其余基因型则散在分布于门诊和多个病房。 表2 23株产ESBLs大肠杆菌E test结果及其耐药表型
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Table 2. ESBLs test results and co-resistances to antibiotics of 23 E. coli strains
Isolates
E test results MIC (μg/ml)a
Co-resistancesb
CAZ
CAZ+CA
AZT
AZT+CA
CTA
, 百拇医药 CTA+CA
116878
>32
0.38
>256
0.38
48
0.5
To,F,Tc,S
116056
>32
0.38
>256
, 百拇医药
0.38
48
0.25
G,To,F,Tc
116090
>32
0.38
>256
0.38
64
0.38
To,F,Tc
106741
, 百拇医药
8
0.75
64
0.25
>256
0.75
A,G,To,F,Tc,S
116277
>32
0.38
>256
0.38
48
, 百拇医药
0.38
G,To,F,Tc
111716
32
0.75
128
0.25
>256
0.75
A,G,To,F,Tc,S
106084
32
0.75
, http://www.100md.com
128
0.38
>256
0.75
G,To,F,Tc,S
111533
0.5
0.25
4
0.19
128
0.25
G,To,F,Tc,S
, http://www.100md.com
120330
8
0.5
48
0.25
>256
0.5
G,To,F,Tc,S
109914
>32
0.75
>256
0.25
, http://www.100md.com
>256
0.5
To,F,S
109211
3
0.38
16
0.19
>256
0.25
G,To,F,Tc,S
980541
0.5
, 百拇医药
0.125
4
0.064
64
0.094
G,To,F,Tc,S
110882
0.5
0.125
2
0.047
32
0.094
, 百拇医药
G,To,F,Tc,S
981023
>32
0.75
32
0.25
>256
0.5
G,To,F,S
110271
0.5
0.125
8
, 百拇医药
0.032
>256
0.125
G,To,F,Tc,S
107081
12
0.38
>256
0.25
>256
0.1
G,To,F,Tc,S
109642
, http://www.100md.com
4
0.25
64
0.19
>256
0.38
G,F,Tc,S
115311
6
0.25
64
0.125
>256
, http://www.100md.com
0.5
G,F
115630
0.5
0.125
8
0.047
48
0.094
G,F,S
108700
0.75
0.19
, http://www.100md.com
4
0.064
64
0.125
F,Tc,S
104027
12
0.5
>256
0.25
>256
0.5
G,To,F,Tc,S
, 百拇医药
108578
3
0.19
32
0.064
>256
0.19
A,G,To,F,Tc,S
108062
0.5
0.125
3
0.064
, http://www.100md.com
96
0.125
G,To,S
a. CAZ=ceftazidime, AZT=aztreonam, CTA=ceftriaxone, CA=clavulanic acid (2μg/ml)
b. Co-resistance is defined as a MIC in the resistant range by NCCLS criteria: A=amikacin，G=gentamicin, To=tobramycin, F=ciprofloxacin, Tc=tetracycline, and S=trimethoprim/sulfamethoxazole表3 产ESBLs大肠杆菌的基因型及临床资料
Table 3. Genotypes and clinical data of ESBL-producing E. coli
, http://www.100md.com
Isolates
Genotypesa
Patient datab
Ribotype
PFGE
Specimen
Date
Ward
111716
242-5
4
Ts
, http://www.100md.com
8-11-97
Hematology
106084
242-5
4
Bl
3-6-97
Hematology
111533
242-5
4
Bl
8-6-97
, http://www.100md.com
Hematology
120330
242-5
4
Ur
4-19-98
Hematology
116878
242-5
2
Ts
12-19-97
Hepatic Surgery
, http://www.100md.com
116056
242-5
2
Dr
12-8-97
Hepatic Surgery
116090
242-5
2
Pf
12-8-97
Hepatic Surgery
, 百拇医药 116277
242-5
2
Pf
12-12-97
Hepatic Surgery
109914
242-5
3a
Bl
6-17-97
Hepatic Surgery
, 百拇医药 109211
242-5
3a
Pf
6-2-97
Hepatic Surgery
106741
242-5
3b
Bl
3-25-97
Cardiovascular
104027
, http://www.100md.com
241-4
6a
Bl
1-7-97
Cardiovascular
108578
241-4
6a
Ur
5-14-98
Outpatient
115311
241-4
, 百拇医药
6b
Sp
11-1-97
Ward for VIP
108700
241-4
8
Bl
5-15-97
Ward for VIP
115630
241-4
9
, 百拇医药
Ur
11-26-97
Ward for VIP
980541
880-1
1a
Sp
4-10-98
Ward for VIP
109642
880-1
1a
, http://www.100md.com Sp
6-13-97
Ward for VIP
981023
880-1
1a
Sp
5-14-98
Ward for VIP
110271
880-1
1a
Sp
, 百拇医药
6-27-97
Respiratory
107081
880-1
1b
Dr
4-3-97
Ward for VIP
110882
880-1
5
Pf
7-17-97
, 百拇医药
Respiratory
108062
243-2
7
Bi
4-28-97
General Surgery
a. Ribotype: Molecular typing by the RiboPrinter; PFGE: Pulsed field gel electrophoresis.
b. Specimen resources: Sp=sputum, Ur=urine, Bl=blood, Bi=bile, Pf=peritoneal fluid，Dr=drainage, Ts=tissue讨论
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Jarlier等〔6〕首先使用双纸片协同试验方法检测ESBLs，我们应用此法测定了27株大肠杆菌，初步测出23株菌ESBLs阳性，并经E test确认。另4株菌经反复调整纸片间的距离，也显示出不同程度的协同作用。4种纸片中氨曲南纸片对ESBLs检出率高(85%)，其余3种纸片检出率均在60%以上，但三者差异无显著性。双纸片协同试验简便易行，且成本低，适合临床常规实验室，采用包括氨曲南和至少2种三代头孢类抗生素纸片可提高检出率。但协同试验结果受纸片间距离的影响，有时需进行几次调整才可观察协同效应。为此，NCCLS最新提出以头孢泊肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟或氨曲南纸片作为临床实验室对ESBLs的初筛，同时使用加及不加棒酸的头孢他啶和头孢噻肟(抑菌环直径相差≥5mm)作为ESBLs表型确认的依据〔7〕。E test能提供精确的MIC值，酶抑制剂棒酸能显著降低(几十至几百倍)氨曲南和头孢噻肟对23株菌的MIC值，但不能明显改变头孢他啶对其中8株菌的MIC值，而这8株菌对头孢他啶表现敏感，因此为防止漏检，NCCLS提出了同时采用头孢他啶和头孢噻肟进行ESBLs检测的确认试验。
, 百拇医药
Bush等〔8〕将ESBLs归于β内酰胺酶分类的2be类，此类酶由TEM-1，TEM-2及SHV-1发生单点及多点突变而来，对抗生素作用的特点是能水解青霉素类、所有头孢菌素类及氨曲南，但对头霉素及碳青酶烯类敏感，能被棒酸抑制。23株ESBLs 阳性大肠杆菌属此类，且每一菌株具有多种不同等电点的β内酰胺酶，其为TEM或SHV类需进一步研究确定。
产ESBLs细菌不仅对三代头孢类抗生素均耐药(个别菌虽体外试验敏感，但体内疗效不好)，而且由于细菌携带ESBLs质粒上可同时带有对喹诺酮类、氨基糖甙类和磺胺类等多种抗生素的耐药基因，致使产ESBLs细菌具有多种不同的耐药表型。本试验中，产ESBLs大肠杆菌对环丙沙星、TMP/SMZ及四环素的耐药率分别为95.7%、82.6%和78.3%，以对庆大霉素、妥布霉素、环丙沙星、四环素和TMP/SMZ共同耐药表型最多见(占39.1%)。
核型分析为自动过程，方法简单，快速，但由于其只反映rRNA基因区域酶切位点的改变，分辨率低，故只能用作初步分型，对于核型不同者，可做流行病学不相关的结论，但对核型相同者应采用脉冲场凝胶电泳进一步分型，因PFGE能检测染色体上所有酶切位点的变化，分辨率高，可反映全部基因的相关性，提供可靠的基因分型依据。本研究在核型分析的基础上进一步用PFGE分型，结合两种基因型，发现多数基因型散在分布于不同病房，但242-5/2、242-5/4和880-1/1a主要来自我院肝胆外科、血液科和高级病房，且242-5/2分离时间集中于1997年12月，提示产ESBLs大肠杆菌在病房内的小流行。产ESBLs细菌由于其耐药性高，耐抗生素种类多，且容易在重症监护病房及免疫力低下人群中引起感染及暴发流行，因此，临床实验室应重视对产ESBLs细菌的检测与监测，防止并控制由其引起的医院感染流行。
, 百拇医药
作者单位：沈定霞(解放军总医院微生物科)
吴坚(解放军总医院微生物科)
徐雅萍(解放军总医院微生物科)
Jones RN(美国Iowa大学医学院病理系医学微生物室)
参考文献
1 Jacoby GA, Archer GL. New mechanisms of bacterial resistance to antimicrobial agents. N Engl J Med, 1991, 324:601-612.
2 Eisen D, Russell EG, Tymms N, et al. Random amplified polymorphic DNA and plasmid analyses used in investigation of an outbreak of multiresistant Klebsiella pneumoniae. J Clin Microbiol, 1995, 33:713-717.
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3 French GL, Shannon KP, Simmons N. Hospital outbreak of Klebsiella pneumoniae resistant to broad-spectrum cephalosporins and β-lactam-β-lactamase inhibitor combinations by hyperproduction of SHV-5β-lactamase. J Clin Microbiol, 1996, 34:358-363.
4 National Committee for Clinical Laboratory Standards. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved Standard M7-A4. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Wayne, PA. 1997.
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5 Pfaller MA, Wendt C, Hollis RJ, et al. Comparative evaluation of an automated ribotyping system versus pulsed-field gel electrophoresis for epidemiological typing of clinical isolates of Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa from patients with recurrent Gram-negative bacteremia. Diagn Microbiol Infect Dis, 1996, 25:1-8.
6 Jarlier V, Nicolas MH, Fournier G, et al. Extended broad-spectrum β-lactamases conferring transferable resistance to newer β-lactam agents in enterobacteriaceae: hospital prevalence and susceptibility patterns. Rev Infect Dis, 1988, 10:867-878.
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7 National Committee for Clinical Laboratory Standards. Screening and confirmatory tests for ESBLs in Klebsiella pneumoniae, K.oxytoca, and Escherichia coli. Approved Standard M2-A6. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Wayne, PA.1999.
8 Bush K, Jacoby GA, Medeiros AA. A functional classification scheme for β-lactamases and its correlation with molecular structure. Antimicrob Agents Chemother, 1995, 39:1211-1233., 百拇医药
摘 要 目的 研究临床分离的产超广谱β内酰胺酶(extended spectrum β lactamases, ESBLs)大肠杆菌对常用抗生素的耐药性及其基因类型。 方法 应用双纸片扩散法及E test检测ESBLs；微量稀释法测定产ESBLs大肠杆菌对临床常用抗生素的耐药性；全自动核型分析和脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis, PFGE)研究产ESBLs大肠杆菌的基因型。 结果 23株产ESBLs大肠杆菌共有12种耐药表型，4种核型及9种脉冲场凝胶电泳分型。耐药表型中，以对庆大霉素、妥布霉素、环丙沙星、四环素及TMP/SMZ同时耐药组合最常见，占39.1%；基因分型中，核型/PFGE型：242-5/2 与242-5/4各4株分别分离自肝胆外科和血液科，3株880-1/1a分离自高级病房，其余基因型呈散在分布于多个病房。 结论 产ESBLs大肠杆菌对常用抗生素具有多种耐药表型；核型分析及脉冲场凝胶电泳是进行产ESBLs细菌引起医院感染流行病学研究的有效手段。
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关键词：大肠杆菌 耐药性 基因型
三代头孢类抗生素如头孢噻肟、头孢曲松和头孢他啶在临床上的广泛应用，导致对这类抗生素耐药的细菌不断增多，这种对三代头孢类抗生素耐药的主要原因是细菌产生了较广谱β内酰胺酶作用底物更广的超广谱β内酰胺酶(ESBLs)〔1〕。大肠杆菌和肺炎克雷伯菌是产生ESBLs最常见的医院感染病原菌。已有不少关于由产ESBLs细菌引起的医院感染暴发流行的报道〔2,3〕，且产ESBLs细菌可同时对多种抗生素产生耐药性，因此产ESBLs细菌感染已成为目前世界性关注的重要感染问题之一。
本研究对用双纸片协同试验和E test检测出的产ESBLs大肠杆菌进一步分析其耐药表型和基因型，从而了解产ESBLs大肠杆菌对常用抗生素的耐药情况及其在本院的流行情况。
材料与方法
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菌株：选择本院自1997年1月至1998年5月从临床分离的经Kirby Bauer纸片法(K-B法)测定对头孢噻肟和头孢曲松抑菌圈直径分别≤27mm和≤25mm的大肠杆菌27株，所有菌株应用ViteK GNI系统进行鉴定。
抗生素敏感试验：含多种不同稀释度抗生素的96孔板(由美国PML Microbiologicals公司提供)微量稀释法抗生素敏感试验的操作和结果解释按NCCLS(1997)标准〔4〕进行。抗生素包括阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、环丙沙星、四环素、TMP/SMZ、亚胺培南等。
ESBLs检测
1.双纸片协同试验初筛：将阿莫西林/棒酸纸片置培养皿中央，在其周围20mm处贴头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松和氨曲南纸片(抗生素纸片购自Oxoid公司)，35℃培养18?h，如在阿莫西林/棒酸纸片与其周围任何一种纸片间出现协同抑菌作用视为产超广谱β内酰胺酶初筛阳性。
, http://www.100md.com
2.浓度梯度法确证：使用瑞士AB Biodisk公司提供的E test试条，按该公司推荐方法操作。E test试条包括含有及不含棒酸的头孢他啶、头孢噻肟和氨曲南，棒酸能使MIC值降低8倍以上者为ESBLs确认阳性。
核型检测：采用美国Qualicon公司的RiboPrinter Microbial Characterization System，此自动过程包括菌细胞溶解、限制性内切酶EcoRⅠ对细菌DNA的酶切、DNA片段的凝胶电泳分离、Southern膜转印及用已标记的来源于大肠杆菌rRNA操纵子的DNA探针与所分离的DNA片段进行杂交。根据DNA条带的位置和强度进行自动核型分析并与计算机保存的其它核型进行比较，若相似系数≥0.93则认为具有相同核型。
脉冲场凝胶电泳：参考Pfaller等人〔5〕方法，用限制性内切酶SpeⅠ消化细菌染色体DNA，用1%琼脂糖凝胶于Bio-Rad公司生产的CHEF-DRⅡ型脉冲场凝胶电泳仪上进行电泳。脉冲时间5～60?s，温度13℃，电压200V，电泳时间23?h。比较每个菌株的电泳条带，如3条以上电泳带不相同，视为不同分型，1～3条带不同视为不同亚型。
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细菌β内酰胺酶制备：将细菌接种于5ml胰大豆液，培养过夜，取0.5ml稀释于9.5ml新鲜胰大豆液中，37℃振荡培养5?h，离心收集细胞并悬浮于250μl 0.2mol/L醋酸钠(pH5.5)中，采用干冰和37℃水浴，反复冻融，然后置冰浴30?min，4℃离心，收集上清，即为β内酰胺酶粗提物，用500μg/ml nitrocefin 检测其活性，保存于-70℃，作为等电聚焦电泳样品。
等电聚焦电泳：在Pharmacia公司的Multiphor Electrophoresis UnitⅡ及含有两性电解质的聚丙烯酰胺凝胶上进行，两性电解质的pH范围为3.5～9.5，5.5～8.5及4.0～6.5，并用已知等电点值(pI)的β内酰胺酶TEM-1(pI：5.4)，TEM-4(pI：5.9)，SHV-1 (pI：7.6)，SHV-3 (pI：7.0 )，SHV-5(pI：8.2)作为等电点判断的标准。
结果
, 百拇医药
1.ESBLs检测
(1)双纸片协同试验初筛：从27株大肠杆菌中，初步检出23株ESBLs阳性菌，结果见表1。
表1 27株耐三代头孢的大肠杆菌双纸片协同试验初筛结果
Table 1. Double disk synergy test results of 27 E. coli strains resistant to the third generation cephalosporins
Ceftazidime
Ceftriaxone
Cefotaxime
Aztreonam
, http://www.100md.com
Positive strains
18
18
17
23
Percentage
67%
67%
63%
85%
(2)E test确认：结果见表2。
(3)β内酰胺酶等电点：等电聚焦凝胶电泳结果显示每一产ESBLs大肠杆菌具有2～4种不同等电点的β内酰胺酶，20株菌具有TEM-1(pI：5.4)，15株菌等电点为8.4，其余β内酰胺酶的等电点分别为7.3、7.6和7.9。
, 百拇医药
2.抗生素耐药表型：23株产ESBLs大肠杆菌对环丙沙星、TMP/SMZ及四环素的耐药率分别为95.7%、82.6%及78.3%，根据它们对阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、环丙沙星、四环素及TMP/SMZ共同耐药组合的差异，可分为12种耐药表型，3株菌对以上6种抗生素均耐药，9株菌对除阿米卡星以外的其余5种抗生素同时耐药，2株菌对除阿米卡星和TMP/SMZ外的其余4种抗生素耐药，另有9株分别显示独特的共同耐药模式，如表2。尽管所有产ESBLs大肠杆菌对亚胺培南敏感，但仅1株对氨基糖甙类3种药物均敏感(No.108700)。
3.核型及脉冲场凝胶电泳分型：23株产ESBLs大肠杆菌可分为4种核型及9种脉冲场凝胶电泳型，其中核型242-5最多(11株，占47.8%)，脉冲场凝胶电泳1a及2、4型较多见，各占4株，如表3。核型/PFGE型：242-5/2、242-5/4和880-1/1a分别分离自我院肝胆外科、血液科和高级病房，其余基因型则散在分布于门诊和多个病房。 表2 23株产ESBLs大肠杆菌E test结果及其耐药表型
, 百拇医药
Table 2. ESBLs test results and co-resistances to antibiotics of 23 E. coli strains
Isolates
E test results MIC (μg/ml)a
Co-resistancesb
CAZ
CAZ+CA
AZT
AZT+CA
CTA
, 百拇医药 CTA+CA
116878
>32
0.38
>256
0.38
48
0.5
To,F,Tc,S
116056
>32
0.38
>256
, 百拇医药
0.38
48
0.25
G,To,F,Tc
116090
>32
0.38
>256
0.38
64
0.38
To,F,Tc
106741
, 百拇医药
8
0.75
64
0.25
>256
0.75
A,G,To,F,Tc,S
116277
>32
0.38
>256
0.38
48
, 百拇医药
0.38
G,To,F,Tc
111716
32
0.75
128
0.25
>256
0.75
A,G,To,F,Tc,S
106084
32
0.75
, http://www.100md.com
128
0.38
>256
0.75
G,To,F,Tc,S
111533
0.5
0.25
4
0.19
128
0.25
G,To,F,Tc,S
, http://www.100md.com
120330
8
0.5
48
0.25
>256
0.5
G,To,F,Tc,S
109914
>32
0.75
>256
0.25
, http://www.100md.com
>256
0.5
To,F,S
109211
3
0.38
16
0.19
>256
0.25
G,To,F,Tc,S
980541
0.5
, 百拇医药
0.125
4
0.064
64
0.094
G,To,F,Tc,S
110882
0.5
0.125
2
0.047
32
0.094
, 百拇医药
G,To,F,Tc,S
981023
>32
0.75
32
0.25
>256
0.5
G,To,F,S
110271
0.5
0.125
8
, 百拇医药
0.032
>256
0.125
G,To,F,Tc,S
107081
12
0.38
>256
0.25
>256
0.1
G,To,F,Tc,S
109642
, http://www.100md.com
4
0.25
64
0.19
>256
0.38
G,F,Tc,S
115311
6
0.25
64
0.125
>256
, http://www.100md.com
0.5
G,F
115630
0.5
0.125
8
0.047
48
0.094
G,F,S
108700
0.75
0.19
, http://www.100md.com
4
0.064
64
0.125
F,Tc,S
104027
12
0.5
>256
0.25
>256
0.5
G,To,F,Tc,S
, 百拇医药
108578
3
0.19
32
0.064
>256
0.19
A,G,To,F,Tc,S
108062
0.5
0.125
3
0.064
, http://www.100md.com
96
0.125
G,To,S
a. CAZ=ceftazidime, AZT=aztreonam, CTA=ceftriaxone, CA=clavulanic acid (2μg/ml)
b. Co-resistance is defined as a MIC in the resistant range by NCCLS criteria: A=amikacin，G=gentamicin, To=tobramycin, F=ciprofloxacin, Tc=tetracycline, and S=trimethoprim/sulfamethoxazole表3 产ESBLs大肠杆菌的基因型及临床资料
Table 3. Genotypes and clinical data of ESBL-producing E. coli
, http://www.100md.com
Isolates
Genotypesa
Patient datab
Ribotype
PFGE
Specimen
Date
Ward
111716
242-5
4
Ts
, http://www.100md.com
8-11-97
Hematology
106084
242-5
4
Bl
3-6-97
Hematology
111533
242-5
4
Bl
8-6-97
, http://www.100md.com
Hematology
120330
242-5
4
Ur
4-19-98
Hematology
116878
242-5
2
Ts
12-19-97
Hepatic Surgery
, http://www.100md.com
116056
242-5
2
Dr
12-8-97
Hepatic Surgery
116090
242-5
2
Pf
12-8-97
Hepatic Surgery
, 百拇医药 116277
242-5
2
Pf
12-12-97
Hepatic Surgery
109914
242-5
3a
Bl
6-17-97
Hepatic Surgery
, 百拇医药 109211
242-5
3a
Pf
6-2-97
Hepatic Surgery
106741
242-5
3b
Bl
3-25-97
Cardiovascular
104027
, http://www.100md.com
241-4
6a
Bl
1-7-97
Cardiovascular
108578
241-4
6a
Ur
5-14-98
Outpatient
115311
241-4
, 百拇医药
6b
Sp
11-1-97
Ward for VIP
108700
241-4
8
Bl
5-15-97
Ward for VIP
115630
241-4
9
, 百拇医药
Ur
11-26-97
Ward for VIP
980541
880-1
1a
Sp
4-10-98
Ward for VIP
109642
880-1
1a
, http://www.100md.com Sp
6-13-97
Ward for VIP
981023
880-1
1a
Sp
5-14-98
Ward for VIP
110271
880-1
1a
Sp
, 百拇医药
6-27-97
Respiratory
107081
880-1
1b
Dr
4-3-97
Ward for VIP
110882
880-1
5
Pf
7-17-97
, 百拇医药
Respiratory
108062
243-2
7
Bi
4-28-97
General Surgery
a. Ribotype: Molecular typing by the RiboPrinter; PFGE: Pulsed field gel electrophoresis.
b. Specimen resources: Sp=sputum, Ur=urine, Bl=blood, Bi=bile, Pf=peritoneal fluid，Dr=drainage, Ts=tissue讨论
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Jarlier等〔6〕首先使用双纸片协同试验方法检测ESBLs，我们应用此法测定了27株大肠杆菌，初步测出23株菌ESBLs阳性，并经E test确认。另4株菌经反复调整纸片间的距离，也显示出不同程度的协同作用。4种纸片中氨曲南纸片对ESBLs检出率高(85%)，其余3种纸片检出率均在60%以上，但三者差异无显著性。双纸片协同试验简便易行，且成本低，适合临床常规实验室，采用包括氨曲南和至少2种三代头孢类抗生素纸片可提高检出率。但协同试验结果受纸片间距离的影响，有时需进行几次调整才可观察协同效应。为此，NCCLS最新提出以头孢泊肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟或氨曲南纸片作为临床实验室对ESBLs的初筛，同时使用加及不加棒酸的头孢他啶和头孢噻肟(抑菌环直径相差≥5mm)作为ESBLs表型确认的依据〔7〕。E test能提供精确的MIC值，酶抑制剂棒酸能显著降低(几十至几百倍)氨曲南和头孢噻肟对23株菌的MIC值，但不能明显改变头孢他啶对其中8株菌的MIC值，而这8株菌对头孢他啶表现敏感，因此为防止漏检，NCCLS提出了同时采用头孢他啶和头孢噻肟进行ESBLs检测的确认试验。
, 百拇医药
Bush等〔8〕将ESBLs归于β内酰胺酶分类的2be类，此类酶由TEM-1，TEM-2及SHV-1发生单点及多点突变而来，对抗生素作用的特点是能水解青霉素类、所有头孢菌素类及氨曲南，但对头霉素及碳青酶烯类敏感，能被棒酸抑制。23株ESBLs 阳性大肠杆菌属此类，且每一菌株具有多种不同等电点的β内酰胺酶，其为TEM或SHV类需进一步研究确定。
产ESBLs细菌不仅对三代头孢类抗生素均耐药(个别菌虽体外试验敏感，但体内疗效不好)，而且由于细菌携带ESBLs质粒上可同时带有对喹诺酮类、氨基糖甙类和磺胺类等多种抗生素的耐药基因，致使产ESBLs细菌具有多种不同的耐药表型。本试验中，产ESBLs大肠杆菌对环丙沙星、TMP/SMZ及四环素的耐药率分别为95.7%、82.6%和78.3%，以对庆大霉素、妥布霉素、环丙沙星、四环素和TMP/SMZ共同耐药表型最多见(占39.1%)。
核型分析为自动过程，方法简单，快速，但由于其只反映rRNA基因区域酶切位点的改变，分辨率低，故只能用作初步分型，对于核型不同者，可做流行病学不相关的结论，但对核型相同者应采用脉冲场凝胶电泳进一步分型，因PFGE能检测染色体上所有酶切位点的变化，分辨率高，可反映全部基因的相关性，提供可靠的基因分型依据。本研究在核型分析的基础上进一步用PFGE分型，结合两种基因型，发现多数基因型散在分布于不同病房，但242-5/2、242-5/4和880-1/1a主要来自我院肝胆外科、血液科和高级病房，且242-5/2分离时间集中于1997年12月，提示产ESBLs大肠杆菌在病房内的小流行。产ESBLs细菌由于其耐药性高，耐抗生素种类多，且容易在重症监护病房及免疫力低下人群中引起感染及暴发流行，因此，临床实验室应重视对产ESBLs细菌的检测与监测，防止并控制由其引起的医院感染流行。
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作者单位：沈定霞(解放军总医院微生物科)
吴坚(解放军总医院微生物科)
徐雅萍(解放军总医院微生物科)
Jones RN(美国Iowa大学医学院病理系医学微生物室)
参考文献
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5 Pfaller MA, Wendt C, Hollis RJ, et al. Comparative evaluation of an automated ribotyping system versus pulsed-field gel electrophoresis for epidemiological typing of clinical isolates of Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa from patients with recurrent Gram-negative bacteremia. Diagn Microbiol Infect Dis, 1996, 25:1-8.
6 Jarlier V, Nicolas MH, Fournier G, et al. Extended broad-spectrum β-lactamases conferring transferable resistance to newer β-lactam agents in enterobacteriaceae: hospital prevalence and susceptibility patterns. Rev Infect Dis, 1988, 10:867-878.
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8 Bush K, Jacoby GA, Medeiros AA. A functional classification scheme for β-lactamases and its correlation with molecular structure. Antimicrob Agents Chemother, 1995, 39:1211-1233., 百拇医药