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编号:10501388
柯萨奇B3病毒引起心肌细胞凋亡的初步探索
http://www.100md.com 《中华微生物学和免疫学杂志》 2000年第3期
     朱理安 关瑞锦 胡锡衷

    摘 要 目的 以病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)细胞感染模型为基础,研究柯萨奇B3病毒(Coxsackie B3 virus, CVB3)感染与心肌细胞凋亡的关系。 方法 在嗜鼠心肌柯萨奇B3病毒(CVB3m)感染心肌细胞后24h电镜观察细胞超微结构的改变,同时取细胞悬液以流式细胞仪检测“凋亡峰”,了解细胞凋亡率,并采用酶联免疫分析法(ELISA)定量测定CVB3m病毒感染后1、2、4、7、24h心肌细胞胞浆内组蛋白伴随DNA片段(单核小体和寡核小体)的多少,进一步了解凋亡程度。 结果 电镜观察CVB3m感染的心肌细胞的超微结构符合凋亡改变,流式细胞仪DNA倍体分析检出凋亡峰,ELISA法检测提示病毒感染后出现心肌细胞凋亡,且在一定时段内凋亡程度随时间延长而增高。 结论 CVB3m病毒感染可诱发心肌细胞凋亡,且随时间延长,凋亡量增多,凋亡程度加重,凋亡可能参与VMC的病理过程。
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    关键词:柯萨奇B3病毒 心肌细胞 细胞凋亡

    凋亡是指单个细胞受其内在基因的编程调控,通过主动的生化过程而“自杀”死亡的现象,是与病理性坏死不同的另一种细胞死亡方式。近年来研究发现:细胞凋亡失常(不足或过度)参与多种疾病的发生与发展〔1〕。病毒感染是调节凋亡的重要因素,病毒感染细胞后通过其自身基因的表达或激活宿主细胞凋亡相关基因启动或抑制细胞凋亡〔2〕。已证实能够引发细胞凋亡的病毒有流感病毒、巨细胞病毒、EB病毒、腺病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)等。CVB3病毒感染心肌细胞诱发病毒性心肌炎(VMC),是由于病毒在心肌内增殖,引起炎症细胞浸润,可能还有自身免疫反应,导致多发性坏死,继以纤维化病灶〔3〕。然而一些实验中观察到VMC患者的心肌损伤并不都与炎症反应成正比,故有人提出,细胞凋亡可能通过产生非炎症性心肌损害参与VMC的发生与发展。在VMC的研究中引入凋亡概念,有助于从一个全新的角度探讨VMC的发病机制,本研究对CVB3病毒感染后心肌细胞的凋亡进行检测,旨在探讨细胞凋亡与VMC的关系。
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    材料与方法

    原代乳鼠心肌细胞培养方法:参照Rui T的胰蛋白酶消化法〔4〕,实验用Sprague Dawlay乳鼠由福建闽兴实验动物中心提供。

    CVB3病毒感染心肌细胞模型的建立:嗜鼠心肌柯萨奇B3病毒(CVB3m),由美国ATCC引入,采用微量滴定法测其TCID50为4.5,以100TCID50/ml的CVB3m感染培养第3天的,接种于24孔板中,密度为2.0×105/ml的心肌细胞,作用1h后弃去病毒液,继续以MEM培养液培养。

    相关检查

    1.倒置显微镜检查:观察病毒感染后24h的心肌细胞。

    2.电子显微镜检查:CVB3m病毒感染后24h的心肌细胞,用2.5%戊二醛固定,常规脱水,环氧树脂包埋,染色,切片,电镜观察。
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    3.流式细胞仪检测细胞“凋亡峰”:取培养于24孔板中的CVB3m病毒感染后24h的心肌细胞,0.15%胰蛋白酶分散,制成细胞悬液(细胞密度为104),低渗PI染液作用30min,流式细胞仪检测,Multiple Option cell cycle fitting (Autofit Version 2.53)软件分析,观察是否在G1峰前出现凋亡特有的AP峰(apoptotic peak),计算峰细胞数占总细胞数的百分比,取同时间培养的未感染心肌细胞作对照。

    4.ELISA法检测凋亡细胞:培养于96孔板上生长良好的心肌细胞(5×104/ml)中加入100TCID50的CVB3m病毒液(100μl/孔),37℃ CO2培养箱中孵育1h后弃去上清,加入200μl/孔的培养液继续培养。分别取培养后1、2、4、7、24h的培养上清液、细胞溶解液进行分析。采用未加CVB3m病毒液的正常培养心肌细胞作为阴性对照。具体步骤按细胞凋亡检测试剂盒(BM公司)说明进行。阳性对照由试剂盒提供,并设立空白对照(底物浓液),背景对照(孵育缓冲液),最后在酶标仪上405nm/490nm波长下测定吸光值,分别计算培养上清液及细胞溶解液中单、寡核小体的相对量,以富集因素(enrichment factor,EF)表示。计算公式为:
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    EF=(cell with treatment(mu))/(cell without treatment(mu))

    结果

    1.CVB3m病毒感染心肌细胞模型的建立:本研究在建立CVB3m病毒感染心肌细胞模型时按感染阳性百分率计算出病毒TCID50为4.5,选用病毒的攻击毒力为100TCID50。病毒在敏感细胞中繁殖,常可引起细胞代谢等方面的改变,并出现细胞病变(CPE),可以此来判定病毒感染的存在。本实验在CVB3m病毒感染心肌细胞后,细胞出现圆缩、坏死等形态学改变,随感染时间延长,病变范围扩大,细胞病变达+++~++++,电镜下观察感染细胞中可见病毒颗粒及包涵体,且检测培养液中AST、LDH、CK、CKMB的值明显高于正常对照组,心肌酶的升高与心肌损伤程度大致平行,这些均提示病毒感染导致了心肌细胞的损伤,胞膜通透性增高,细胞变性坏死,说明该模型的建立是成功的。
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    2.倒置显微镜下观察结果:可见病毒感染后细胞出现团缩、变圆、成堆、胞质灰暗。

    3.电镜下观察结果:可见CVB3m感染心肌细胞有两种不同形态改变,一种是以细胞质改变为主(图1A),表现为线粒体肿胀,嵴变短、断裂,甚至成空泡样,肌浆网扩张,肌丝紊乱;另一种是以细胞核改变为主(图1B),表现为细胞膜内陷核染色质浓缩、集边,凝集成团块状,还可见核碎裂,细胞器变化不明显。t21101.gif (28752 bytes)

    图1 CVB3病毒感染后24h心肌细胞的形态分析

    Fig 1. Morphological appearance of cardiac myocytes infected by CVB3 for 24 h
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    A. CVB3m infected cardiac myocytes, which obviously revealed cytoplasmic pathogenesis(×10000)

    B. CVB3m infected cardiac myocytes, which obviously revealed nucleolus pathogenesis(×7200)

    4.流式细胞术鉴别细胞凋亡:流式细胞分析中可见CVB3m感染细胞出现凋亡特有的AP峰(图2A),而未感染心肌细胞则无凋亡峰出现(图2B)。

    5.ELISA法检测核小体(组蛋白伴随DNA片段):结果显示正常细胞上清液、病毒感染细胞上清液的吸光值均在各自一定的范围内波动,不随时间的延长而改变。病毒感染细胞溶解液测得的吸光值有随时间的延长而增高的趋势(表1),由1h的0.39l mu升至24h的2.427 mu,阳性对照的吸光值为t21201.gif (3043 bytes)
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    图2 CVB3m感染后24h的流式细胞分析

    Fig 2. Cytometric analysis of CVB3m infected cardiac myocytes

    A. Apoptotic peak was found before G0/G1 peak (infected cells).

    Cell cycle data A

    Mean G1=88.9; mean G2=121; CV G1=6.5; CV G2=6.6;

    %G1=44.6; %G2=7.1; G2/G1=1.361; %S=4.1; %AP=14.3
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    B. No apoptotic peak was found before G0/G1 peak (uninfected cells).

    Cell cycle data B

    Mean G1=143.2; mean G2=286.0; CV G1=4.1; CV G2=2.8;%G1=74.9; %G2=6.9; G2/G1=1.997; %S=18.3

    表1 CVB3m病毒感染前后不同时间细胞溶解液及培养上清液吸光值(mu)变化

    Table 1. The absorbance variation of cell lysate and supernatant at different times after CVB3m infection
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    Time

    Normal cell (cell

    without treatment)

    Virus infected cell(cell

    with treatment)

    Lysate

    (mu)

    Supernatant

    (mu)

    Lysate

    (mu)
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    Supernatant

    (mu)

    1h

    0.252

    0.197

    0.391

    0.205

    2h

    0.247

    0.199

    0.515

    0.210

    4h
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    0.268

    0.189

    1.377

    0.207

    7h

    0.254

    0.192

    2.143

    0.216

    24h

    0.261

    0.198

    2.427
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    0.208

    The positive control value was 1.37l mu; the blank control value was 0.013 mu; the background control value was 0.023 mu

    1.37l mu,在此范围内。从CVB3m病毒诱导心肌细胞的凋亡时间效应曲线来看(图3),在1h时,细胞凋亡水平与背景水平差别不大,但随着感染时间延长有明显增加。t21202.gif (2712 bytes)

    图3 不同时间细胞浆内单、寡核小体测定

    Fig 3. Detection of nucleosomes in cytoplasmic fractions at different times (substrate reaction time: 5min)
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    □ Enrichment factor of the lysate, ■ Enrichment factor of the supernatant, △ Lysate without CVB3m, ▲ Lysate with CVB3m, ○ Supernatant with CVB3m, ● Supernatant without CVB3m00.gif (1004 bytes)

    讨论

    凋亡(apoptosis)是多细胞有机体为调控机体发育,维护内环境稳定,由基因控制的细胞主动性死亡过程。正常状态下,心肌细胞作为已近分化末端的细胞,不发生细胞凋亡〔5〕。心肌细胞出现凋亡,即说明发生了病理变化过程。1994年Kawano等人〔6〕报告在3例慢性VMC患者心肌活检组织中发现1例有多处灶性心肌细胞凋亡,认为细胞凋亡可能参与VMC的发生与发展,其可能机制为病毒感染时,一方面机体运用细胞凋亡的手段,通过牺牲个别细胞来清除外物,起宿主防御作用;另一方面,病毒为维持自身的存活与繁殖,调控宿主细胞凋亡,引起宿主细胞产生病理损伤〔7,8〕
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    随着对细胞凋亡研究的深入,建立了许多检测方法,形态学的观察仍然是最基本的检测手段〔9〕。本研究在CVB3m感染后倒置显微镜下观察见心肌细胞出现细胞病变(CPE),进一步以电镜观察超微结构,发现部分出现CPE的细胞具有细胞皱缩,核染色质浓缩集边等凋亡特有的形态学改变,不同于一般的坏死改变。电镜下获得凋亡细胞特征性的形态学改变是判断细胞凋亡的可靠证据,故推测出现CPE的细胞中有一部分为凋亡细胞。该结果提示,CVB3m病毒感染除了可引起心肌细胞变性坏死(necrosis)外,还可诱导心肌细胞发生凋亡。

    凋亡的生化基础是核酸内切酶(internucleosomal)被激活,引起DNA断裂,形成180~200bp为最小单位的单体或寡聚体片段。本实验通过流式细胞仪检测〔10〕细胞核内DNA含量以及酶联免疫分析法(ELISA)检测细胞浆内组蛋白伴随DNA片段(单核小体和寡核小体)的多少,证实了电镜所观察到的细胞凋亡现象,并进一步了解CVB3m诱发乳鼠心肌细胞凋亡的程度。上述二种方法都可用于细胞凋亡定量分析。过去研究表明,出现细胞凋亡需要一段时间过程,但凋亡一旦启动,通常很快发生。我们的研究也表明,CVB3m病毒诱导心肌细胞凋亡在感染病毒后4h增加明显,且随时间延长,凋亡程度加重。考虑如下两个原因:其一是针对单个细胞而言,已凋亡的心肌细胞内的核小体释出增多;其二是针对整体细胞而言,可能由于不同心肌细胞对病毒感染的反应程度存在差异,故病毒诱导细胞产生凋亡的时间先后不一,随时间延长,新一批凋亡细胞出现,使得总的核小体量增多。由于我们观察病毒感染后心肌细胞凋亡的时间较短,因此,宜进一步观察病毒感染后更长的时间内是否有细胞凋亡,这有助于探明VMC中感染心肌细胞的最终结局是什么,以及细胞凋亡是否参与VMC向扩张型心肌病(DCM)的转化过程。
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    对一般器官来说,少数细胞凋亡可能不影响组织器官的生理功能,但对心肌细胞这样一种高度分化,接近分化末端,通常认为不具备再生能力的组织细胞,凋亡无论是宿主防御的结果,还是病毒诱导所致,都将引起心肌组织的病理损伤,心肌细胞的丢失和减少。过度的凋亡将直接影响心脏功能,故CVB3病毒与心肌细胞凋亡的关系值得进一步探讨。

    基金项目:福建省卫生厅青年基金资助项目(96013)

    作者单位:朱理安(福建省立医院福建省心血管病研究所)

    关瑞锦(福建省立医院福建省心血管病研究所)

    胡锡衷(福建省立医院福建省心血管病研究所)

    参考文献

    1 Carson DA, Ribeiro JM. Apoptosis and disease. Lancet, 1993, 341:1251-1254.
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    2 赵贵军, 徐旭士. 病毒感染引发细胞凋亡. 生命科学, 1997, 9(2):68-71.

    3 Lodge PA, Herzum M, Olszewski J, et al. Coxsackievirus B-3 myocarditis acute and chronic forms of the disease caused by different immunopathogenic mechanisms. Am J Pathol, 1987, 128:455-463.

    4 Rui T, Yang YZ. Effect of Astragalus membranceus on electrophy siolmgical activities of acute experimental coxsackie B-3 viral myocarditis in mice. Chin Med Sci J, 1993, 8:203-206.
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    5 James TN. Normal and abnormal consequences of apoptosis in the human heart. Circulation, 1994, 90:556-573.

    6 Kawano H, Okada R, Kawano Y, et al. Apoptosis in acute and chronic myocarditis. Jpn Heart J, 1994, 35(6):745-750.

    7 Steller H. Mechanisms and genes of celluarsuicide. Science, 1995, 267:1445-1449.

    8 王新生. 肝细胞凋亡研究进展.国外医学流行病学传染病学分册,1997,24(1):28-32.

    9 Hockenbery D. Defining apoptosis. Am J Pathol, 1995, 146(1):16-19.

    10 郑泽铣, 李宁丽, 沈佰华, 等. 流式细胞术定量检测细胞凋亡. 上海免疫学杂志, 1995, 15(5):273-277., 百拇医药