人源汉坦病毒疫苗候选株的分离鉴定及其某些特性研究

http://www.100md.com 《中华实验和临床病毒学杂志》 2000年第1期

     人源汉坦病毒疫苗候选株的分离鉴定及其某些特性研究

    解燕乡 杭长寿 王华 朱公文

    摘 要 目的 对人源汉坦病毒疫苗候选株作分离鉴定及特性的研究。方法 用Vero细胞分离病毒，用免疫荧光法作病毒效价测定。用RT-PCR及部分核苷酸序列分析等检定。结果 用Vero细胞从安徽省凤台县肾综合征出血热病人血清中分离一株汉坦病毒(HV)，其抗原特性及PCR分型结果证明为汉滩病毒(Ⅰ型病毒)；其免疫血清对来源于不同地区的HV均有中和活性。M片段部分序列分析结果表明，该毒株与76-118等毒株核苷酸序列有较大差异，但氨基酸序列同源性甚高。病毒株对Vero细胞敏感，繁殖高峰一般在9天以后，可多次收获病毒。结论 上述特性表明，分离病毒株适合用作研制灭活疫苗后备株。

    关键词：出血热，病毒性 汉坦病毒 序列分析，DNA Vero细胞

    肾综合征出血热(HFRS)是我国重点防治的急性传染病。安徽省是我国HFRS的老疫区和重疫区。因此，对流行于该地区的汉坦病毒(HV)进行分离和系统的鉴定，能为HFRS的防治提供科学依据。特别是流行株的血清型和基因型的确定，是选择使用疫苗的型别和确定防治重点及对策的前提，也为研究我国汉坦病毒的遗传性及进化提供一定的依据。同时，对毒株的免疫原性、抗原性及其在Vero细胞中增殖特性进行研究，为传代细胞疫苗候选株的选择提供基础材料。

    1 材料和方法

    1.1 标本来源 1994年11月30日安徽省凤台县人民医院临床急性期病人姬××血清。

    1.2 细胞及传代方法 Vero细胞来源于ATCC，其131代由中国药品生物制品检定所提供。实验时用含10%小牛灭活血清的MEM培养基传代培养，使用代数在138～146代之间。

    1.3 病毒分离 参照文献[1]。

    1.4 病毒株及免疫血清 所用Ⅰ型毒株为76-118，H5，C4，84FLi,A9,Chen,LuYao,LuXu；Ⅱ型毒株为UR，R22，L99。病毒感染细胞后7～10d收获，上清冻存作为毒种，并供中和试验(PRNT)用。细胞冻化后经超声波处理，彻底破碎后补1 ml PBS，离心取上清作为ELISA抗原。上述毒株免疫家兔制备兔抗HV免疫血清。Ⅰ～Ⅲ型呼肠孤病毒免疫血清为本室保存。

    1.5 病毒株鉴定

    1.5.1 间接免疫荧光法(IFA) 参照文献[2]。采自安徽省凤台县的急性期病人血清荧光效价为40～80；恢复期血清效价>640。HV单克隆抗体(McAbs)分别由本所陈伯权、梁米芳、马章亮等研制，部分从日本及美国引进。抗糖蛋白单抗有：LV28B，LV48C，LV48A，3 G1，8 G2，8 G3，16 D2，3 D5，8 B6，16 F7；抗核蛋白单抗有：LV13F3，C1223，L133，A5，A19，C321，C1242，LV37，LV1A。

    1.5.2 ELISA法 参照文献[3]。检测抗原用双抗体夹心法，检测血清抗体用阻断法。

    1.5.3 空斑试验及空斑减少中和实验 参照文献[4]。微量细胞病变中和试验(MCPENT)参照文献[4，5]。

    1.5.4 病毒RNA提取方法 病毒总RNA的提取使用Trizol试剂盒。步骤如下：将病毒接种于大方瓶内新长成单层Vero细胞。7 d后弃尽培养上清。用PBS冲洗细胞单层，弃尽PBS。然后加入1 ml裂解液覆盖细胞单层，吹下细胞后，将裂解液转移到1.5 ml的塑料离心管中，室温放置5 min。加入200 μl氯仿，充分混匀后室温放置3 min。4℃，15 000 r/min离心15 min。取水相加等量异丙醇沉淀10 min。离心后沉淀用80%乙醇洗涤。然后于室温下干燥沉淀。最后加入50 μl DEPC处理的去离子水，溶解所提取的RNA。

    1.5.5 逆转录-PCR(RT-PCR)及PCR片段回收方法 逆转录及PCR上游引物序列为HTV-MFO：AAAAGTAGGTGITAYATCYTIACAATG TGG(位置：1910～1939)；PCR下游引物序列为HTV～MRO：GTACAICCTGTRCC IACCCC(位置2373～2354)。Taq酶为PERKIN ELMER公司的Ampli Taq Gold^TM Taq酶。逆转录酶为GibcoBRL公司的Super Script^TM Ⅱ逆转录酶。PCR片段回收使用Promega公司的Wizard^R PCR Preps DNA Purification System。

    1.5.6 核苷酸序列的测定及分析方法 使用ABI 373 DNA序列自动测序仪进行序列测定。测序试剂盒为PERKIN ELMER公司的ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit with Ampli Taq DNA Polymerase,测序引物为：HFMGAATCCATACTGTGGGCTG CAAGTGC(位置1958～1984)。本研究所用引物位置均是对应于76～118株M片段而言。

    1.6 病毒繁殖动态 取长成单层的大方瓶Vero细胞，以10^-2接种病毒后，每天收获1瓶，刮取细胞作荧光检查；上清冻存检测病毒滴度；细胞冻化后检测ELISA抗原滴度。

    1.7 实验动物 购自中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所。

    2 结果

    2.1 毒株的免疫荧光检测

    2.1.1 分离过程中的IFA检测 29份病人血清分别接种Vero细胞，23 d后检测，结果为25份阴性，4株可疑。二次传代后20 d，其中之一达到+；再传时达到+ + +～+ + + +。暂命名为FT14(凤台14)，冻存作原始毒种。

    2.1.2 HFRS病人双份血清的IFA检测 用3例来自于凤台人民医院的HFRS病人双份血清同时检测FT14，结果见表1。3例病人恢复期血清抗体水平均有4倍以上增高，并且与HV76-118株及84 FLi株对照检查的结果相似。该毒株与呼肠孤病毒免疫血清无任何反应。

    表1 FT14抗原检测HFRS病人双份血清结果

    Tab.1 Reactivity of FT14 with paired sera from HFRS patients

    血清号

    Serum No.

    发病后天数

    Days post onset

    of the disease

    IFA抗体滴度^***

    IFA(Antibody titer)^***

    FT14

    76-118

    84 FLi

    1

    A^*

    3

    40

    80

    40

    C^**

    19

    1 280

    1 280

    640

    2

    A

    4

    80

    80

    40

    C

    20

    1 280

    1 280

    1 280

    3

    A

    3

    40

    40

    40

    C

    18

    640

    1 280

    640

    *A：急性期(Acute phase) **C：恢复期(Convalescent phase) ***以血清稀释度的倒数表示(Reversion of the serum dilution titer)

    2.1.3 FT14毒株对McAbs的IFA反应 取第4代毒株感染Vero细胞，7 d后制备细胞抗原片，与HV McAbs做免疫荧光反应。FT14对10个抗糖蛋白单抗中7个组特异性和亚组特异性单抗以及Ⅰ型抗核蛋白单抗全部为阳性反应；对Ⅱ型抗核蛋白单抗全为阴性反应。此结果与用于对照的9株HVⅠ型病毒株反应结果相同，而与4株Ⅱ型毒株的抗原性存在很大的差异。

    2.2 用ELISA法比较FT14与各毒株之间的抗原关系 FT14与Ⅰ型毒株的抗体反应滴度(1∶320)及FT14免疫血清与Ⅰ型病毒株反应的抗体滴度(1∶640)都明显高于与Ⅱ型病毒株或抗体反应的滴度。

    2.3 交叉中和实验 用FT14抗原及其免疫血清与其他毒株的免疫血清及抗原进行固定病毒稀释血清的交叉中和实验，结果见表2。由表2可见，MCPENT法在Vero细胞上的效价与PRNT法测出的结果相近。FT14株病毒对Ⅰ型HV的血清效价比对Ⅱ型HV高4倍以上，提示FT14为Ⅰ型病毒。

    表2 FT14抗原及其免疫血清与其他毒株交叉中和试验

    Tab.2 Cross plaque-reduction neutralization test between FT14 and other virus strains

    病毒株

    Strain

    免疫血清中和滴度

    PRNT titers of immune sera

    微量细胞病变中和试验

    MCPENT

    L99

    R22

    Chen

    76-118

    FT14

    FT14

    C4

    10

    10

    160

    160

    160

    160

    Chen

    20

    10

    320

    320

    320

    320

    84 FLi

    10

    10

    160

    320

    320

    320

    FT14

    20

    10

    160

    160

    640

    320

    H5

    20

    10

    160

    160

    160

    160

    H3

    20

    10

    160

    160

    160

    160

    76-118

    20

    10

    160

    640

    320

    320

    A9

    40

    20

    80

    80

    80

    80

    L99

    320

    80

    20

    20

    20

    40

    R22

    160

    160

    10

    10

    10

    20

    2.4 病毒传代，增殖动态及生长曲线

    2.4.1 传代情况(FT14早代) 见表3。

    表3 FT14在Vero细胞中的传代情况

    Tab.3 Passages of FT14 on Vero cells

    传代

    Passage

    感染后天数

    Days post

    infection

    抗原检测

    Detection of antigen

    IFA

    ELISA

    PFU/ml

    1

    23

    ±

    ND

    2

    20

    +

    1∶1

    5×10²

    3

    7

    + + + +

    1∶64

    5×10⁵

    4

    7

    + + + +

    1∶128

    6×10⁵

    5

    7

    + + + +

    1∶256

    5×10⁶

    2.4.2 FT14病毒株第五代增殖动态及繁殖曲线 FT14感染Vero细胞后，3 d可查到抗原，9 d后达到高峰，持续24 d无下降趋势(见表4，图1)。表4 FT14在Vero细胞上的增殖动态

    Tab.4 The multiplication of FT14 on Vero cells

    感染后天数

    Days post

    infection

    抗原检测

    Detection of antigen

    IFA

    ELISA

    PFU/ml

    3

    ±

    ND

    2×10⁰

    6

    + + +

    1∶32

    5×10⁵

    9

    + + + +

    1∶128

    6×10⁶

    12

    + + + +

    1∶256

    7×10⁶

    15

    + + + +

    >1∶256

    6×10⁶

    18

    + + + +

    >1∶256

    7×10⁶

    21

    + + + +

    >1∶256

    1×10⁷

    24

    + + + +

    >1∶256

    1×10⁷

    图1 FT14在Vero细胞上的繁殖曲线

    Fig.1 Growth curve of virus FT14 on Vero cells

    2.5 RT-PCR对FT14扩增及鉴定

    用Ⅰ型引物从29份病人血清中扩增出阳性带8份，其中包括分离出FT14毒株的血清。29份病人血清与Ⅱ型引物均不反应。

    2.6 FT14部分M片段核酸序列测定 测得了对应于M基因组片段2 003～2 302位的300碱基对的核苷酸序列(见图2)，并就核苷酸序列及推导的氨基酸序列与一些已知序列进行了比较(见表5)，结果FT14与HTN型病毒株核苷酸序列的同源性为81.0%～82.3%；推导的氨基酸序列同源性为96%。

    图2 FT14病毒M片段部分核苷酸序列

    Fig.2 Partial nucleotide sequence of M segment of FT14 virus

    表5 FT14M片段部分核苷酸序列及推导的氨基酸序列与已知病毒相应片段序列的同源性(%)

    Tab.5 Comparison of partial nucleotide and amino-acid sequences of M segment among FT14 and other known viruses

    FT14

    76-118

    Chen

    R22

    FT14

    82.3

    81.0

    69.0

    76-118

    96.0

    86.7

    70.0

    Chen

    96.0

    97.0

    68.7

    R22

    76.8

    79.8

    78.8

    注：空白对角线上为核苷酸序列，下为氨基酸序列

    Note:The upper part of diagonal represents nucleotide sequence, the lower part the amino acid sequence

    3 讨论

    用Vero细胞作为疫苗生长的基质，是当前HFRS疫苗发展的方向^[6]。我国以Vero细胞为基质的HFRS疫苗尚处于实验室开发阶段，迫切需要在Vero细胞上繁殖力高的适应病毒株。FT14因其用Vero细胞分离、适应性好、滴度高而具备上述条件。和鼠源病毒株相比，尽管核苷酸序列有较大差异，但氨基酸序列差别不大，这表明了在HV进化过程中其结构蛋白氨基酸序列保持相对稳定的特点，也决定了FT14具有相对稳定的抗原性。而且其来源及传代历史清楚，有可能适合作为Vero传代细胞Ⅰ型疫苗候选株。

    作者单位：解燕乡(100052 北京，中国预防医学科学院病毒学研究所出血热与虫媒病毒室)

    杭长寿(100052 北京，中国预防医学科学院病毒学研究所出血热与虫媒病毒室)

    王华(100052 北京，中国预防医学科学院病毒学研究所出血热与虫媒病毒室)

    朱公文(安徽省凤台县人民医院)

    参考文献

    1，杭长寿.流行性出血热病毒的分离和检定.流行性出血热的检测技术学习班资料汇编，1984：1-10.

    2，Lee HW, Lee PW, Johnson KM. Isolation of the etiologic agent of Korean hemorrhagic fever. J Infect Dis,1978,137:298-308.

    3，杭长寿.实验诊断.流行性出血热防治手册.第2版.北京：人民卫生出版社，1998，171-175.

    4，Schmaljohn C, Arikawa J, Hasty S, et al. Conservation of antigenic properties and sequences encoding the envelope prototype hantaan virus and two virus isolates from Korean haemorrhagic fever patients. J Gen Virol, 1988,69:1949-1955.

    5，聂子林，俞永新，刘文雪，等.EHFV微量细胞病变中和实验法的建立及其在中和抗体检测中的应用.中华微生物学和免疫学杂志，1991，11：236-239.

    6，俞永新.肾综合症出血热疫苗国内外研究进展.中国媒介生物学及控制杂志，1997，8(专刊)：9-14.

    百拇医药网 http://www.100md.com/html/Dir/2000/10/01/50/22/20.htm