维甲酸α受体介导全反式维甲酸抑制胃癌细胞生长的作用机理
维甲酸α受体介导全反式维甲酸抑制胃癌细胞生长的作用机理
吴乔 陈正明 刘苏 苏文金
摘 要 目的 探讨维甲酸α受体(RARα)介导全反式维甲酸(ATRA)抑制胃癌细胞生长的作用机理。方法 应用Northern blot分析维甲酸受体在胃癌细胞中的表达水平，通过脂质体转染方法将sense RARα和antisense RARα分别转染到细胞中，通过MTT方法和软琼脂集落形成实验分析ATRA对转染细胞生长和恶性程度的影响，瞬时转染和测定氯霉素乙酰转移酶(CAT)活性，分析维甲酸应答元件(RARE)的转录活性。结果 ATRA诱导BGC-823细胞RARα表达，但不能诱导MKN-45细胞RARα表达。在转染细胞中，ATRA可以抑制转sense RARα的MKN细胞生长，但不能抑制转antisense RARα的BGC细胞生长。与MKN-45细胞比较，ATRA诱导MKN/RARα细胞βRARE的转录活性较高，但与BGC-823细胞比较，ATRA诱导BGC/aRARα细胞βRARE的转录活性则较低。结论 足够量的RARα对于介导ATRA抑制胃癌细胞生长作用是必需的。
, 百拇医药
主题词：胃肿瘤；维甲酸；维甲酸α受体；基因转染
维甲酸(retinoic acid, RA) 的作用主要由其受体——维甲酸受体(retinoic acid receptor, RAR)和维甲类X受体(retinoid X receptor, RXR)介导，它们属于类固醇/甲状腺激素受体超家族成员，由3种不同基因α、β和γ编码，由此形成不同的受体亚类[1]。许多证据表明，RAR活性的改变与某些疾病相关。在急性早幼粒细胞白血病中，当染色体发生t(15；17)易位时，导致异常PML-RARα融合受体的产生，并引起非正常的RARα转录[2]。在肺癌中，靠近RARβ基因区的染色体3P短臂经常发生缺失[3]，人乳腺癌细胞由于不表达RARβ而对RA产生抗性[4]。因此，探讨RAR的功能作用对于阐明RA的抗癌机制具有重要意义。
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材料与方法
1.胃癌细胞株和药物处理：BGC-823和MKN-45细胞购于上海细胞所细胞库，RPMI-1640培养液培养。10-6 mol/L全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA; Sigma公司)处理细胞。
2.RNA提取和Northern blot：细胞经ATRA处理24 h后，硫氰酸胍提取和氯化铯超速离心制备总RNA，Northern blot按文献[5]方法。探针RARα、RARβ、RARγ和RXRα由美国加州Burnham研究所张晓坤博士惠赠。以28S和18S定量所用的RNA量。
3.基因转染和细胞形态观察：克隆有antisense RARα和sense RARα质粒的表达载体(张晓坤博士惠赠)通过脂质体(Gibco BRL)介导方法转染到细胞中，空白载体(pRC/CMV)作为对照，G418筛选细胞，Northern blot确定RARα表达，观察克隆细胞形态。
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4.细胞生长测定：以1 000细胞/孔接种量将细胞接种在96孔板，ATRA处理细胞9 d，MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-6-yl)-6,5-diphenyltetrazolium bromide]方法测定细胞生长率[6]。
5.软琼脂集落形成测定：0.5%琼脂作为底层，在0.3%琼脂中加入细胞，使细胞终浓度为1×105/ml(实验组则同时加入ATRA)，混匀后取1 ml铺展在底层琼脂上，凝固后置CO2培养箱中培养，3周后计数集落形成数(直径>80 μm集落为阳性)。
6.DNA瞬时转染和氯霉素乙酰转移酶(CAT)测定：脂质体介导方法将报告基因β RARE-tk-CAT(张晓坤博士惠赠)瞬时转染到细胞中，转染后，细胞经ATRA处理24 h，测定CAT活性[6]。
结果
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1.RARα、RARβ、RARγ和RXRα在胃癌细胞中的表达：Northern blot分析表明，RARα在BGC-823细胞中表达水平较高，在MKN-45细胞中表达水平很低。ATRA诱导后，BGC-823细胞RARα表达水平显著提高，而MKN-45细胞RARα表达水平不变。RARβ在BGC-823细胞表达，在MKN-45细胞不表达；RARγ在两株细胞中均不表达，RXRα在两株细胞中低水平表达。然而，ATRA都不能诱导两株细胞的RARβ、RARγ和RXRα表达(图1)。
2.转染基因在胃癌细胞中的表达：根据以上结果，将antisense RARα和sense RARα分别转染到BGC-823和MKN-45细胞。Northern blot显示，BGC/aRARα细胞的RARα表达受到抑制，表达水平比BGC-823细胞低，而且ATRA不能诱导其表达，但可以诱导转空白载体细胞BGC/vector的RARα表达(图2A)。相反，MKN/RARα细胞的RARα表达不仅比MKN-45细胞提高，而且ATRA能够诱导其表达，但不能诱导MKN/vector的RARα表达(图2B)。与MKN-45细胞多边形形态比较，MKN/RARα细胞变为细长形，突起消失，圆形细胞增多，而BGC/aRARα细胞形态则与BGC-823细胞类似。
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图1 ATRA对胃癌细胞中RARα、RARβ和RXRα转录水平的影响
A：BGC/aRARα细胞；B：MKN/RARα细胞
图2 RARα在转染细胞中的表达
3.ATRA对细胞生长的影响：ATRA可以有效抑制BGC-823细胞生长，但不能有效抑制BGC/aRARα细胞生长，抑制率从61.0%下降到18.4%。相反，ATRA不能抑制MKN-45细胞生长，但可以抑制MKN/RARα细胞生长，抑制率从3.9%上升到31.7%。
4.ATRA对细胞软琼脂集落形成能力的影响：ATRA可以抑制BGC-823和MKN-45细胞在软琼脂中形成集落的能力，但对BGC-823细胞的抑制率(35.7%)比对MKN-45细胞的抑制率(23.2%)高。相反，转染细胞中ATRA对MKN/RARα细胞形成集落的抑制率(96.1%)大于BGC/aRARα细胞(20.0%)。
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5.ATRA对维甲酸应答元件βRARE转录活性的调节：当报告基因βRARE-tk-CAT瞬时转染后，在BGC-823细胞中，ATRA可以诱导一个较强的CAT活性，诱导倍数(即ATRA诱导的CAT活性/对照组的CAT活性)为3.36，而对MKN-45细胞的诱导倍数为1.3。相反，转染细胞中ATRA不能显著诱导BGC/aRARα细胞的CAT活性,诱导倍数仅为1.8，但对MKN/RARα细胞的诱导倍数则上升为2.75。
讨论
RA的作用主要由其受体RARS和RXRS介导。Northern blot分析表明，ATRA可以诱导BGC-823细胞RARα表达，但不能诱导RARβ、RARγ和RXRα表达，提示RARα可能参与ATRA抑制胃癌细胞生长的过程。RA激活的RARα与RXR形成异源二聚体，可以结合到维甲酸应答元件(如βRARE)上，由此调控基因的转录和表达[4]。在急性早幼粒白血病细胞和RA抗性的成神经细胞瘤细胞中，RA可以诱导RARα表达，这种上调作用是由于RA诱导RARα基因启动子上的RARE基元序列(motif)[7]。本研究中，当报告基因βRARE-tk-CAT转染到BGC-823细胞时，ATRA可以显著诱导βRARE活性(即CAT活性)，表明BGC-823细胞的RARα具有功能性，在ATRA存在下激活βRARE而刺激细胞生长抑制信号，从而抑制BGC-823细胞生长。但是，当报告基因转染到MKN-45细胞时，ATRA诱导的βRARE活性很低，提示在MKN-45细胞中βRARE转录调节可能发生异常，或者RARα功能丧失，ATRA不能抑制MKN-45细胞生长。
, 百拇医药
在成神经细胞瘤中，低水平表达RARα与预后效果差密切相关[8]，这是由于RARα受体反映了肿瘤分化的特殊阶段。已知RARα在人组织分化过程中具有重要作用，在造血细胞中，RARα表达丰富，但当染色体发生t(15;17)和t(11;17)易位时，RARα受体发生变化，导致造血细胞分化受阻[9]。当将sense RARα基因转染到MKN-45细胞时，ATRA通过对RARα的诱导而抑制细胞生长和降低细胞形成集落的能力。相反，当antisense RARα转染到BGC-823细胞后，ATRA不能诱导RARα表达，细胞由对ATRA敏感转为抗性，形成集落的能力上升。由此证实，RARα在介导ATRA抗胃癌细胞生长和抑制细胞恶性化方面起着关键作用。RARα功能丧失可能导致细胞失去这种调节机制，从而表现出对ATRA抗性。
另外，当RARα基因转染到MKN-45细胞后，细胞形态由多边形变为细长形，圆形细胞数量增多，这种变化与ATRA存在与否无关，表明细胞形态的改变是由于基因转染引起的。至于圆形细胞的增多是否与细胞凋亡或其他因素有关，尚需进一步研究。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39880015)；国家杰出青年科学基金(B类)资助项目(39825502)
作者单位：吴乔(361005 厦门大学肿瘤细胞工程国家专业实验室)
陈正明(361005 厦门大学肿瘤细胞工程国家专业实验室)
刘苏(361005 厦门大学肿瘤细胞工程国家专业实验室)
苏文金(361005 厦门大学肿瘤细胞工程国家专业实验室)
参考文献
1.Zhang XK, Pfahl M. Regulation of retinoid and thyroid hormone action through homodimeric and heterodimeric receptors. Trends Endocrinol Metab, 1993, 4:156-162.
, 百拇医药
2.Grignaini F, Fagioli M, Alcalay M, et al. Acute promyelocytic leukemia from genetics to treatment. Blood, 1994, 83:10-17.
3.Gebert JF, Moghal N, Frangioni JV, et al. High frequence of retinoic acid receptor βabnormalities in human lung cancer. Oncogene, 1991，6:1856-1863.
4.Lui Y, Lee MO, Wang HG, et al. Retinoic acid receptor β mediates the growth-inhibitory effect of retinoic acid by promoting apoptosis in human breast cancer cells. Mol Cell Biol, 1996, 16:1138-1149.
, 百拇医药
5.Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993. 10-11.
6.吴乔，曾定，苏文金，等. 视黄酸受体转录水平的改变与乳腺癌细胞生长的关系. 厦门大学学报(自然科学版)，1997，36：787-794.
7.Smarda J, Sugarman J, Glass C, et al. Retinoic acid receptor alpha suppresses transformation by v-myb. Mol Cell Biol, 1995, 15:2474-2492.
8.Marshall GM, Cheung B, Stacey KP, et al. Regulation of retinoic acid receptor alpha expression in human neuroblastoma cell lines and tumor tissue. Anticancer Res, 1993, 13:437-449.
9.Grihnagni F, Ferruci PF, Testa U, et al. The acute promyelocytic leukemia-specific PML-RAR-alpha fusion protein inhibits differentiation and promotes survival of myeloid precursor cells. Cell, 1993, 74:423-448., 百拇医药
吴乔 陈正明 刘苏 苏文金
摘 要 目的 探讨维甲酸α受体(RARα)介导全反式维甲酸(ATRA)抑制胃癌细胞生长的作用机理。方法 应用Northern blot分析维甲酸受体在胃癌细胞中的表达水平，通过脂质体转染方法将sense RARα和antisense RARα分别转染到细胞中，通过MTT方法和软琼脂集落形成实验分析ATRA对转染细胞生长和恶性程度的影响，瞬时转染和测定氯霉素乙酰转移酶(CAT)活性，分析维甲酸应答元件(RARE)的转录活性。结果 ATRA诱导BGC-823细胞RARα表达，但不能诱导MKN-45细胞RARα表达。在转染细胞中，ATRA可以抑制转sense RARα的MKN细胞生长，但不能抑制转antisense RARα的BGC细胞生长。与MKN-45细胞比较，ATRA诱导MKN/RARα细胞βRARE的转录活性较高，但与BGC-823细胞比较，ATRA诱导BGC/aRARα细胞βRARE的转录活性则较低。结论 足够量的RARα对于介导ATRA抑制胃癌细胞生长作用是必需的。
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主题词：胃肿瘤；维甲酸；维甲酸α受体；基因转染
维甲酸(retinoic acid, RA) 的作用主要由其受体——维甲酸受体(retinoic acid receptor, RAR)和维甲类X受体(retinoid X receptor, RXR)介导，它们属于类固醇/甲状腺激素受体超家族成员，由3种不同基因α、β和γ编码，由此形成不同的受体亚类[1]。许多证据表明，RAR活性的改变与某些疾病相关。在急性早幼粒细胞白血病中，当染色体发生t(15；17)易位时，导致异常PML-RARα融合受体的产生，并引起非正常的RARα转录[2]。在肺癌中，靠近RARβ基因区的染色体3P短臂经常发生缺失[3]，人乳腺癌细胞由于不表达RARβ而对RA产生抗性[4]。因此，探讨RAR的功能作用对于阐明RA的抗癌机制具有重要意义。
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材料与方法
1.胃癌细胞株和药物处理：BGC-823和MKN-45细胞购于上海细胞所细胞库，RPMI-1640培养液培养。10-6 mol/L全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA; Sigma公司)处理细胞。
2.RNA提取和Northern blot：细胞经ATRA处理24 h后，硫氰酸胍提取和氯化铯超速离心制备总RNA，Northern blot按文献[5]方法。探针RARα、RARβ、RARγ和RXRα由美国加州Burnham研究所张晓坤博士惠赠。以28S和18S定量所用的RNA量。
3.基因转染和细胞形态观察：克隆有antisense RARα和sense RARα质粒的表达载体(张晓坤博士惠赠)通过脂质体(Gibco BRL)介导方法转染到细胞中，空白载体(pRC/CMV)作为对照，G418筛选细胞，Northern blot确定RARα表达，观察克隆细胞形态。
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4.细胞生长测定：以1 000细胞/孔接种量将细胞接种在96孔板，ATRA处理细胞9 d，MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-6-yl)-6,5-diphenyltetrazolium bromide]方法测定细胞生长率[6]。
5.软琼脂集落形成测定：0.5%琼脂作为底层，在0.3%琼脂中加入细胞，使细胞终浓度为1×105/ml(实验组则同时加入ATRA)，混匀后取1 ml铺展在底层琼脂上，凝固后置CO2培养箱中培养，3周后计数集落形成数(直径>80 μm集落为阳性)。
6.DNA瞬时转染和氯霉素乙酰转移酶(CAT)测定：脂质体介导方法将报告基因β RARE-tk-CAT(张晓坤博士惠赠)瞬时转染到细胞中，转染后，细胞经ATRA处理24 h，测定CAT活性[6]。
结果
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1.RARα、RARβ、RARγ和RXRα在胃癌细胞中的表达：Northern blot分析表明，RARα在BGC-823细胞中表达水平较高，在MKN-45细胞中表达水平很低。ATRA诱导后，BGC-823细胞RARα表达水平显著提高，而MKN-45细胞RARα表达水平不变。RARβ在BGC-823细胞表达，在MKN-45细胞不表达；RARγ在两株细胞中均不表达，RXRα在两株细胞中低水平表达。然而，ATRA都不能诱导两株细胞的RARβ、RARγ和RXRα表达(图1)。
2.转染基因在胃癌细胞中的表达：根据以上结果，将antisense RARα和sense RARα分别转染到BGC-823和MKN-45细胞。Northern blot显示，BGC/aRARα细胞的RARα表达受到抑制，表达水平比BGC-823细胞低，而且ATRA不能诱导其表达，但可以诱导转空白载体细胞BGC/vector的RARα表达(图2A)。相反，MKN/RARα细胞的RARα表达不仅比MKN-45细胞提高，而且ATRA能够诱导其表达，但不能诱导MKN/vector的RARα表达(图2B)。与MKN-45细胞多边形形态比较，MKN/RARα细胞变为细长形，突起消失，圆形细胞增多，而BGC/aRARα细胞形态则与BGC-823细胞类似。
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图1 ATRA对胃癌细胞中RARα、RARβ和RXRα转录水平的影响
A：BGC/aRARα细胞；B：MKN/RARα细胞
图2 RARα在转染细胞中的表达
3.ATRA对细胞生长的影响：ATRA可以有效抑制BGC-823细胞生长，但不能有效抑制BGC/aRARα细胞生长，抑制率从61.0%下降到18.4%。相反，ATRA不能抑制MKN-45细胞生长，但可以抑制MKN/RARα细胞生长，抑制率从3.9%上升到31.7%。
4.ATRA对细胞软琼脂集落形成能力的影响：ATRA可以抑制BGC-823和MKN-45细胞在软琼脂中形成集落的能力，但对BGC-823细胞的抑制率(35.7%)比对MKN-45细胞的抑制率(23.2%)高。相反，转染细胞中ATRA对MKN/RARα细胞形成集落的抑制率(96.1%)大于BGC/aRARα细胞(20.0%)。
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5.ATRA对维甲酸应答元件βRARE转录活性的调节：当报告基因βRARE-tk-CAT瞬时转染后，在BGC-823细胞中，ATRA可以诱导一个较强的CAT活性，诱导倍数(即ATRA诱导的CAT活性/对照组的CAT活性)为3.36，而对MKN-45细胞的诱导倍数为1.3。相反，转染细胞中ATRA不能显著诱导BGC/aRARα细胞的CAT活性,诱导倍数仅为1.8，但对MKN/RARα细胞的诱导倍数则上升为2.75。
讨论
RA的作用主要由其受体RARS和RXRS介导。Northern blot分析表明，ATRA可以诱导BGC-823细胞RARα表达，但不能诱导RARβ、RARγ和RXRα表达，提示RARα可能参与ATRA抑制胃癌细胞生长的过程。RA激活的RARα与RXR形成异源二聚体，可以结合到维甲酸应答元件(如βRARE)上，由此调控基因的转录和表达[4]。在急性早幼粒白血病细胞和RA抗性的成神经细胞瘤细胞中，RA可以诱导RARα表达，这种上调作用是由于RA诱导RARα基因启动子上的RARE基元序列(motif)[7]。本研究中，当报告基因βRARE-tk-CAT转染到BGC-823细胞时，ATRA可以显著诱导βRARE活性(即CAT活性)，表明BGC-823细胞的RARα具有功能性，在ATRA存在下激活βRARE而刺激细胞生长抑制信号，从而抑制BGC-823细胞生长。但是，当报告基因转染到MKN-45细胞时，ATRA诱导的βRARE活性很低，提示在MKN-45细胞中βRARE转录调节可能发生异常，或者RARα功能丧失，ATRA不能抑制MKN-45细胞生长。
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在成神经细胞瘤中，低水平表达RARα与预后效果差密切相关[8]，这是由于RARα受体反映了肿瘤分化的特殊阶段。已知RARα在人组织分化过程中具有重要作用，在造血细胞中，RARα表达丰富，但当染色体发生t(15;17)和t(11;17)易位时，RARα受体发生变化，导致造血细胞分化受阻[9]。当将sense RARα基因转染到MKN-45细胞时，ATRA通过对RARα的诱导而抑制细胞生长和降低细胞形成集落的能力。相反，当antisense RARα转染到BGC-823细胞后，ATRA不能诱导RARα表达，细胞由对ATRA敏感转为抗性，形成集落的能力上升。由此证实，RARα在介导ATRA抗胃癌细胞生长和抑制细胞恶性化方面起着关键作用。RARα功能丧失可能导致细胞失去这种调节机制，从而表现出对ATRA抗性。
另外，当RARα基因转染到MKN-45细胞后，细胞形态由多边形变为细长形，圆形细胞数量增多，这种变化与ATRA存在与否无关，表明细胞形态的改变是由于基因转染引起的。至于圆形细胞的增多是否与细胞凋亡或其他因素有关，尚需进一步研究。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39880015)；国家杰出青年科学基金(B类)资助项目(39825502)
作者单位：吴乔(361005 厦门大学肿瘤细胞工程国家专业实验室)
陈正明(361005 厦门大学肿瘤细胞工程国家专业实验室)
刘苏(361005 厦门大学肿瘤细胞工程国家专业实验室)
苏文金(361005 厦门大学肿瘤细胞工程国家专业实验室)
参考文献
1.Zhang XK, Pfahl M. Regulation of retinoid and thyroid hormone action through homodimeric and heterodimeric receptors. Trends Endocrinol Metab, 1993, 4:156-162.
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2.Grignaini F, Fagioli M, Alcalay M, et al. Acute promyelocytic leukemia from genetics to treatment. Blood, 1994, 83:10-17.
3.Gebert JF, Moghal N, Frangioni JV, et al. High frequence of retinoic acid receptor βabnormalities in human lung cancer. Oncogene, 1991，6:1856-1863.
4.Lui Y, Lee MO, Wang HG, et al. Retinoic acid receptor β mediates the growth-inhibitory effect of retinoic acid by promoting apoptosis in human breast cancer cells. Mol Cell Biol, 1996, 16:1138-1149.
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5.Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993. 10-11.
6.吴乔，曾定，苏文金，等. 视黄酸受体转录水平的改变与乳腺癌细胞生长的关系. 厦门大学学报(自然科学版)，1997，36：787-794.
7.Smarda J, Sugarman J, Glass C, et al. Retinoic acid receptor alpha suppresses transformation by v-myb. Mol Cell Biol, 1995, 15:2474-2492.
8.Marshall GM, Cheung B, Stacey KP, et al. Regulation of retinoic acid receptor alpha expression in human neuroblastoma cell lines and tumor tissue. Anticancer Res, 1993, 13:437-449.
9.Grihnagni F, Ferruci PF, Testa U, et al. The acute promyelocytic leukemia-specific PML-RAR-alpha fusion protein inhibits differentiation and promotes survival of myeloid precursor cells. Cell, 1993, 74:423-448., 百拇医药