p16基因对鼻咽癌细胞系CNE-2增殖凋亡的影响
p16基因对鼻咽癌细胞系CNE-2增殖凋亡的影响
罗京伟 梁克 徐国镇 赵清正 殷蔚伯 高黎
摘 要 目的 研究p16基因对人鼻咽癌细胞系CNE-2细胞增殖、凋亡的影响。方法 采用脂质体介导的基因转染方法，将野生型p16基因、空载体转入该基因突变的CNE-2细胞中，同时设置不加任何质粒的CNE-2细胞作为对照。结果 脂质体转染、G418筛选所获得的抗性克隆，经免疫组化检测证实转入p16基因的CNE-2细胞有p16蛋白表达，细胞生长速度明显减慢；FCM检测显示，细胞周期主要阻滞在G1期，S期细胞明显减少；荧光染色和TUNEL两种检测法均表明，导入p16基因的CNE-2细胞的凋亡明显增加；免疫组化检测证实，p16基因导入后出现p53蛋白表达与之相伴随。结论 外源性p16基因导入CNE-2细胞后可有效地表达并导致CNE-2细胞G1阻滞，诱导凋亡发生。其机理可能与野生性p53基因的功能上调等有关。
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主题词：鼻咽肿瘤；p16基因；基因转染；细胞凋亡
p16基因无论是在人体鼻咽原发肿瘤中，还是在体外培养的鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)细胞系中，均存在着高频率的缺失、突变与5’-CpG甲基化等，使无基因表达产物p16蛋白的产生或表达相应降低[1]。但有关p16基因对NPC的生物学行为的影响，尚未见文献报道。我们将外源性p16基因通过基因转染方法，导入该基因突变的人鼻咽癌细胞系CNE-2中，研究p16基因对CNE-2细胞增殖、凋亡的影响。
材料与方法
1.质粒：pcDNA3-p16是具有CMV启动子的人p16cDNA(0.5 kb)真核表达型质粒；pcDNA3是具有CMV启动子，但不含有p16cDNA的质粒，称之为空载体(vect)。均由赵清正教授惠赠。
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2.细胞系：CNE-2细胞为人鼻咽低分化鳞癌细胞系，其p16基因在内含子1和外显子2连接处，由于剪切突变而造成其表达产物的缺失。同时，该细胞系有p53基因第8外显子单一点突变，而另一染色体上p53基因又完全正常，因此CNE-2细胞同时存在野生和突变的p53基因[2]。由中国医学科学院肿瘤研究所放射生物室提供。
3.鉴定：利用免疫组织化学染色的方法检测CNE-2-p16细胞有无p16蛋白的产生，以鉴定转染是否成功。为明确p16基因与p53基因之间有无相关性，我们同时检测了p53蛋白的表达情况。p16多克隆抗体与p53单克隆抗体均为Santa cruz公司产品，工作浓度分别为1∶50和1∶100，采用ABC法进行染色。
4.流式细胞仪测定细胞周期各时相的变化：具体按照文献[3]的方法进行。
5.凋亡的测定：采用荧光染色(Hoechst 33342)和TUNEL(TDT-mediated dUTP nick end labelling)两种方法检测凋亡的发生情况，具体步骤按照宝灵曼公司生产的凋亡试剂盒说明书进行。
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结果
1.p16基因转染CNE-2细胞：通过脂质体介导，将pcDNA3-p16、pcDNA3两种质粒分别转染CNE-2细胞，经G418 400 μg/ml筛选2周，G418 100 μg/ml维持形成克隆。其中p16转染组(CNE-2-p16)形成克隆的时间长，2周后仅见小的克隆性细胞生长，其生长速度缓慢，5周时才形成较明显的克隆；而pcDNA3组(CNE-2-vect)2周时即可形成明显的克隆。p16转染组的生长受到明显抑制。
2.外源性p16基因在CNE-2细胞中的表达：用免疫组化方法对传代培养的p16阳性克隆细胞进行p16蛋白的检测，结果p16蛋白阳性，表明外源性p16基因已经整合入CNE-2细胞并表达。同时p53蛋白也为阳性，提示p16基因的导入可以上调CNE-2细胞野生性p53基因的功能，出现蛋白表达量增加。而CNE-2-vect组和对照组CNE-2的p16、p53蛋白的检测均阴性。
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3.外源性p16基因对CNE-2细胞增殖周期的影响：导入外源性p16基因可引起明显的G1捕获，同对照组细胞相比，前者G1期细胞明显增加，S期细胞明显减少。经t检验，差异有显著性(P<0.05，表1)。
4.外源性p16基因对CNE-2细胞凋亡发生的影响：Hoechst 33342和TUNEL两种方法检测的结果均表明，p16基因可明显增加CNE-2细胞凋亡的发生(表2)。
表1 CNE-2、CNE-2-vect、CNE-2-p16组细胞增殖
周期的分布(X±s,%)
组别
G1/G0
S
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G2M
CNE-2
34.63±1.47
37.2 ±0.61
28.17±2.08
CNE-2-vect
37.23±0.81
32.87±2.89
29.9 ±2.15
CNE-2-p16
54.57±3.31
, http://www.100md.com 21.8 ±1.48
23.67±2.46
表2 各组细胞的凋亡指数(%)
组别
Hoechst 33342
TUNEL法
均值
CNE-2
4.2
5.4
4.8
CNE-2-vect
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9
9.4
9.2
CNE-2-p16
19
22
20.5
讨论
目前对肿瘤的研究已深入到基因分子水平，而且已经明确肿瘤的发生、发展涉及到癌基因的激活与抑癌基因的失活等。NPC的发生、发展也不例外，如bcl-2、ras和c-myc等癌基因的过度表达。但目前发现的一些常见的抑癌基因在NPC中的改变则不明显，如Rb、p21等在NPC的表达完全正常。在抑癌基因家族中占举足轻重的p53基因，在原发性NPC中的突变率也甚低[4]。而NPC9p21-22的缺失又是肯定的事件，因此一定还有其他抑癌基因在NPC的发生、发展过程中起着重要的作用。p16基因定位于9p21，无论是在NPC细胞系，还是在人体肿瘤中均存在着高频率的突变，从而使其成为NPC的一个重要的候选抑癌基因[1]。
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p16基因主要是通过G1阻断而发挥其作用的[5]。本研究结果表明，导入外源性p16基因的CNE-2细胞同对照组相比，周期明显不同。前者的G1期细胞明显增加，S期细胞明显减少。导入外源性p16基因明显增加了凋亡的发生，无论是采用Hoeschst 33342，还是TUNEL方法，均得出了相同的结果。
CNE-2细胞同时存在野生和突变的p53基因，而没有野生性p53蛋白的表达。这可能是野生性p53蛋白量低、半衰期短，用一般的免疫组化法不能检出。本研究采用CNE-2单纯导入p16基因，不仅出现p16蛋白的免疫组化阳性，而且同时出现p53蛋白的免疫组化阳性，可能与p16基因通过上调CNE-2细胞中野生性p53基因的功能而出现p53蛋白量的增加、半衰期延长等有关。据此我们认为，p16、p53基因在NPC中的发生、发展过程中是相互影响和相互作用的。p16上调p53基因功能的作用是否与诱导凋亡有关，目前尚无明确的结论。Sandig等[6]的研究提示，p16基因通过降低Rb的表达，使肿瘤细胞增加了对凋亡的敏感性，如再行p53诱导肿瘤细胞可发生凋亡。程金科等[3]利用腺病毒介导的p16基因转染人黑色素瘤细胞系VVM-983A，证实了p16基因诱导了VVM-983细胞凋亡的发生，可惜未能进一步研究发生凋亡的可能机制，如是否有p53基因的参与等。Spruck等[7]研究证实，在13个不同的肿瘤细胞系中，有12个细胞系有p53基因或p16基因的突变，但只有1个细胞系同时存在着p53、p16基因的突变。也就是说，有11个细胞系或是p53突变、p16正常，或是p16突变、p53正常。我们推测，p16诱导肿瘤细胞凋亡的原因可能是p16基因通过调控细胞周期、协同其他凋亡因子共同作用的结果，即p16基因通过G1期阻滞后，通过p53基因而诱发凋亡的发生；或p16基因和p53基因共同导致G1期阻滞后，再在p53的协同作用下诱导凋亡。这种推测尚有待于以后进一步的研究来证实。
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综上所述，我们认为p16基因是一种抑癌基因，导入人鼻咽癌细胞系CNE-2后可引起明显的G1阻滞，抑制肿瘤细胞的增殖活性，而且p16基因可诱导凋亡发生，其中可能涉及p53基因的参与。本研究为进一步探讨p16基因的功能及实验性基因治疗的可行性提供了新的实验依据。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(3950043)
作者单位：罗京伟(100021 北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所肿瘤医院放射治疗科)
徐国镇(100021 北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所肿瘤医院放射治疗科)
殷蔚伯(100021 北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所肿瘤医院放射治疗科)
高黎(100021 北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所肿瘤医院放射治疗科)
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梁克(100021 北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所肿瘤医院放射生物室)
赵清正(100021 北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所肿瘤医院放射生物室)
参考文献
1.Gulley ML, Nicholls JM, Schneider BG, et al. Nasopharyngeal carcinomas frequently lack the p16/MTS1 tumor suppressor protein but consistently express the retinoblastoma gene product. AJP, 1998,152:865-869.
2.李满枝，陈军，江慧民. 鼻咽癌中p53基因突变的研究. 癌症, 1998,17:246-248.
, 百拇医药
3.程金科，林晨，邢嵘, 等. 腺病毒介导p16基因转移及诱导黑色素瘤细胞凋亡. 中华肿瘤杂志, 1999，21：89-92.
4.Spruck CH, Tsao YC, Huang DP, et al. Absence of p53 gene mutation in primary nasopharyngeal carcinomas. Cancer Res, 1992,52:4787-4790.
5.Marix J. New tumor suppressor may rival p53. Science, 1994,264:344-355.
6.Sandig V, Brand K, Herwig S， et al. Adenovirally transfered p16INK/CDK2 and p53 genes cooperate to induce apoptotic tumor cell death. Nature Med, 1997, 3:313-319.
7.Spruck CH, Gonzalez-Zulueta M, Shibata A, et al. p16 gene in uncultured tumors. Nature, 1994, 370:183-184., 百拇医药
罗京伟 梁克 徐国镇 赵清正 殷蔚伯 高黎
摘 要 目的 研究p16基因对人鼻咽癌细胞系CNE-2细胞增殖、凋亡的影响。方法 采用脂质体介导的基因转染方法，将野生型p16基因、空载体转入该基因突变的CNE-2细胞中，同时设置不加任何质粒的CNE-2细胞作为对照。结果 脂质体转染、G418筛选所获得的抗性克隆，经免疫组化检测证实转入p16基因的CNE-2细胞有p16蛋白表达，细胞生长速度明显减慢；FCM检测显示，细胞周期主要阻滞在G1期，S期细胞明显减少；荧光染色和TUNEL两种检测法均表明，导入p16基因的CNE-2细胞的凋亡明显增加；免疫组化检测证实，p16基因导入后出现p53蛋白表达与之相伴随。结论 外源性p16基因导入CNE-2细胞后可有效地表达并导致CNE-2细胞G1阻滞，诱导凋亡发生。其机理可能与野生性p53基因的功能上调等有关。
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主题词：鼻咽肿瘤；p16基因；基因转染；细胞凋亡
p16基因无论是在人体鼻咽原发肿瘤中，还是在体外培养的鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)细胞系中，均存在着高频率的缺失、突变与5’-CpG甲基化等，使无基因表达产物p16蛋白的产生或表达相应降低[1]。但有关p16基因对NPC的生物学行为的影响，尚未见文献报道。我们将外源性p16基因通过基因转染方法，导入该基因突变的人鼻咽癌细胞系CNE-2中，研究p16基因对CNE-2细胞增殖、凋亡的影响。
材料与方法
1.质粒：pcDNA3-p16是具有CMV启动子的人p16cDNA(0.5 kb)真核表达型质粒；pcDNA3是具有CMV启动子，但不含有p16cDNA的质粒，称之为空载体(vect)。均由赵清正教授惠赠。
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2.细胞系：CNE-2细胞为人鼻咽低分化鳞癌细胞系，其p16基因在内含子1和外显子2连接处，由于剪切突变而造成其表达产物的缺失。同时，该细胞系有p53基因第8外显子单一点突变，而另一染色体上p53基因又完全正常，因此CNE-2细胞同时存在野生和突变的p53基因[2]。由中国医学科学院肿瘤研究所放射生物室提供。
3.鉴定：利用免疫组织化学染色的方法检测CNE-2-p16细胞有无p16蛋白的产生，以鉴定转染是否成功。为明确p16基因与p53基因之间有无相关性，我们同时检测了p53蛋白的表达情况。p16多克隆抗体与p53单克隆抗体均为Santa cruz公司产品，工作浓度分别为1∶50和1∶100，采用ABC法进行染色。
4.流式细胞仪测定细胞周期各时相的变化：具体按照文献[3]的方法进行。
5.凋亡的测定：采用荧光染色(Hoechst 33342)和TUNEL(TDT-mediated dUTP nick end labelling)两种方法检测凋亡的发生情况，具体步骤按照宝灵曼公司生产的凋亡试剂盒说明书进行。
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结果
1.p16基因转染CNE-2细胞：通过脂质体介导，将pcDNA3-p16、pcDNA3两种质粒分别转染CNE-2细胞，经G418 400 μg/ml筛选2周，G418 100 μg/ml维持形成克隆。其中p16转染组(CNE-2-p16)形成克隆的时间长，2周后仅见小的克隆性细胞生长，其生长速度缓慢，5周时才形成较明显的克隆；而pcDNA3组(CNE-2-vect)2周时即可形成明显的克隆。p16转染组的生长受到明显抑制。
2.外源性p16基因在CNE-2细胞中的表达：用免疫组化方法对传代培养的p16阳性克隆细胞进行p16蛋白的检测，结果p16蛋白阳性，表明外源性p16基因已经整合入CNE-2细胞并表达。同时p53蛋白也为阳性，提示p16基因的导入可以上调CNE-2细胞野生性p53基因的功能，出现蛋白表达量增加。而CNE-2-vect组和对照组CNE-2的p16、p53蛋白的检测均阴性。
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3.外源性p16基因对CNE-2细胞增殖周期的影响：导入外源性p16基因可引起明显的G1捕获，同对照组细胞相比，前者G1期细胞明显增加，S期细胞明显减少。经t检验，差异有显著性(P<0.05，表1)。
4.外源性p16基因对CNE-2细胞凋亡发生的影响：Hoechst 33342和TUNEL两种方法检测的结果均表明，p16基因可明显增加CNE-2细胞凋亡的发生(表2)。
表1 CNE-2、CNE-2-vect、CNE-2-p16组细胞增殖
周期的分布(X±s,%)
组别
G1/G0
S
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G2M
CNE-2
34.63±1.47
37.2 ±0.61
28.17±2.08
CNE-2-vect
37.23±0.81
32.87±2.89
29.9 ±2.15
CNE-2-p16
54.57±3.31
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23.67±2.46
表2 各组细胞的凋亡指数(%)
组别
Hoechst 33342
TUNEL法
均值
CNE-2
4.2
5.4
4.8
CNE-2-vect
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9
9.4
9.2
CNE-2-p16
19
22
20.5
讨论
目前对肿瘤的研究已深入到基因分子水平，而且已经明确肿瘤的发生、发展涉及到癌基因的激活与抑癌基因的失活等。NPC的发生、发展也不例外，如bcl-2、ras和c-myc等癌基因的过度表达。但目前发现的一些常见的抑癌基因在NPC中的改变则不明显，如Rb、p21等在NPC的表达完全正常。在抑癌基因家族中占举足轻重的p53基因，在原发性NPC中的突变率也甚低[4]。而NPC9p21-22的缺失又是肯定的事件，因此一定还有其他抑癌基因在NPC的发生、发展过程中起着重要的作用。p16基因定位于9p21，无论是在NPC细胞系，还是在人体肿瘤中均存在着高频率的突变，从而使其成为NPC的一个重要的候选抑癌基因[1]。
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p16基因主要是通过G1阻断而发挥其作用的[5]。本研究结果表明，导入外源性p16基因的CNE-2细胞同对照组相比，周期明显不同。前者的G1期细胞明显增加，S期细胞明显减少。导入外源性p16基因明显增加了凋亡的发生，无论是采用Hoeschst 33342，还是TUNEL方法，均得出了相同的结果。
CNE-2细胞同时存在野生和突变的p53基因，而没有野生性p53蛋白的表达。这可能是野生性p53蛋白量低、半衰期短，用一般的免疫组化法不能检出。本研究采用CNE-2单纯导入p16基因，不仅出现p16蛋白的免疫组化阳性，而且同时出现p53蛋白的免疫组化阳性，可能与p16基因通过上调CNE-2细胞中野生性p53基因的功能而出现p53蛋白量的增加、半衰期延长等有关。据此我们认为，p16、p53基因在NPC中的发生、发展过程中是相互影响和相互作用的。p16上调p53基因功能的作用是否与诱导凋亡有关，目前尚无明确的结论。Sandig等[6]的研究提示，p16基因通过降低Rb的表达，使肿瘤细胞增加了对凋亡的敏感性，如再行p53诱导肿瘤细胞可发生凋亡。程金科等[3]利用腺病毒介导的p16基因转染人黑色素瘤细胞系VVM-983A，证实了p16基因诱导了VVM-983细胞凋亡的发生，可惜未能进一步研究发生凋亡的可能机制，如是否有p53基因的参与等。Spruck等[7]研究证实，在13个不同的肿瘤细胞系中，有12个细胞系有p53基因或p16基因的突变，但只有1个细胞系同时存在着p53、p16基因的突变。也就是说，有11个细胞系或是p53突变、p16正常，或是p16突变、p53正常。我们推测，p16诱导肿瘤细胞凋亡的原因可能是p16基因通过调控细胞周期、协同其他凋亡因子共同作用的结果，即p16基因通过G1期阻滞后，通过p53基因而诱发凋亡的发生；或p16基因和p53基因共同导致G1期阻滞后，再在p53的协同作用下诱导凋亡。这种推测尚有待于以后进一步的研究来证实。
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综上所述，我们认为p16基因是一种抑癌基因，导入人鼻咽癌细胞系CNE-2后可引起明显的G1阻滞，抑制肿瘤细胞的增殖活性，而且p16基因可诱导凋亡发生，其中可能涉及p53基因的参与。本研究为进一步探讨p16基因的功能及实验性基因治疗的可行性提供了新的实验依据。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(3950043)
作者单位：罗京伟(100021 北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所肿瘤医院放射治疗科)
徐国镇(100021 北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所肿瘤医院放射治疗科)
殷蔚伯(100021 北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所肿瘤医院放射治疗科)
高黎(100021 北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所肿瘤医院放射治疗科)
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梁克(100021 北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所肿瘤医院放射生物室)
赵清正(100021 北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所肿瘤医院放射生物室)
参考文献
1.Gulley ML, Nicholls JM, Schneider BG, et al. Nasopharyngeal carcinomas frequently lack the p16/MTS1 tumor suppressor protein but consistently express the retinoblastoma gene product. AJP, 1998,152:865-869.
2.李满枝，陈军，江慧民. 鼻咽癌中p53基因突变的研究. 癌症, 1998,17:246-248.
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3.程金科，林晨，邢嵘, 等. 腺病毒介导p16基因转移及诱导黑色素瘤细胞凋亡. 中华肿瘤杂志, 1999，21：89-92.
4.Spruck CH, Tsao YC, Huang DP, et al. Absence of p53 gene mutation in primary nasopharyngeal carcinomas. Cancer Res, 1992,52:4787-4790.
5.Marix J. New tumor suppressor may rival p53. Science, 1994,264:344-355.
6.Sandig V, Brand K, Herwig S， et al. Adenovirally transfered p16INK/CDK2 and p53 genes cooperate to induce apoptotic tumor cell death. Nature Med, 1997, 3:313-319.
7.Spruck CH, Gonzalez-Zulueta M, Shibata A, et al. p16 gene in uncultured tumors. Nature, 1994, 370:183-184., 百拇医药