腺病毒介导的p53对胆管癌细胞生长的抑制作用
腺病毒介导的p53对胆管癌细胞生长的抑制作用
鲁建国 林晨 黄志强 吴金生 付明 张雪艳 梁萧 要秀 吴日/文
摘 要：目的 研究p53基因对胆管癌细胞的作用. 方法 将重组体腺病毒p53转移到人胆管癌细胞QBC939, 用RT-PCR、克隆形成实验、流式细胞仪、DNA片段化分析等方法对p53基因的表达、细胞的生长抑制及机制进行分析. 结果 用Ad-LacZ进行重组体腺病毒转导效率的检测，发现当MOI为100以上时，重组体腺病毒可使90%以上的培养的人胆管癌QBC939细胞被转导. 用RT-PCR方法检测，在胆管癌QBC939细胞系中p53无表达. 重组体腺病毒能介导外源基因p53在胆管癌QBC939细胞系中高效表达. 重组体腺病毒介导的p53在QBC939细胞中表达，能抑制QBC939细胞的生长和集落形成. 流式细胞计数和细胞DNA Ladder， 证实p53能诱导QBC939细胞发生凋亡并导致其发生G1期阻滞. 结论 p53基因可能通过诱导肿瘤细胞凋亡及G1期阻滞在肿瘤的基因治疗方面发挥作用.
, 百拇医药
关键词:胆管癌；p53基因；腺病毒；基因治疗；凋亡
0 引言
胆管癌由于早期缺乏典型的症状及体征，早期诊断困难，待明确诊断时，多已属中晚期，且手术危险性较大，死亡率高，术后复发率很高，预后较差. 近年来，随着分子生物学理论和DNA重组技术的飞速发展，肿瘤的基因治疗为肿瘤的治疗带来了新的契机. 本研究将重组体腺病毒p53转移到人胆管癌细胞QBC939中，观察p53基因可否抑制细胞的生长及诱导该细胞凋亡.
1 材料和方法
1.1 材料 重组腺病毒： Ad-p53及Ad-LacZ由中国医学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室构建. 人胆管癌细胞系QBC939细胞由第三军医大学西南医院肝胆外科王曙光教授惠赠. 培养条件为 RPMI 1640培养基，含100 mL.L-1胎牛血清，37℃，50 mL.L-1. PCR引物: 由上海Sangon公司合成p53 (扩增产物620 bp):上游1: 5′-TACTCCCCTGCCCTCAACAAGA-3′下游2: 5′-CTTAGCAC
, http://www.100md.com
CTGAAGGGTGAAATATTC-3′; tubulin: ( 扩增
产物410 bp)： 上游: 5′-CTCATCACAGGCAAGG
AAGAT-3′, 下游: 5′- TTAAGGTAAGTGTAGG
TTGGG-3′.
1.2 方法 重组体腺病毒的繁殖、纯化、滴度测定， 病毒感染， 重组腺病毒的转导效率测定， 细胞存活率测定，克隆形成实验，流式细胞仪对细胞周期、RT-PCR分析及凋亡的分析参照有关文献[1]. 扩增 p53反应条件： 95℃ 5 min， 94℃ 30 s， 65℃ 1 min， 72℃ 1 min， 72℃ 1 min， 26个循环. 统计分析采用SAS统计软件包.
2 结果
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2.1 重组体腺病毒滴度的测定 重组腺病毒纯化后的滴度分别为Ad-p53： 2.0 ×1010 pfu.mL-1，Ad-LacZ：1.0×1010 pfu.mL-1.
2.2 重组体腺病毒的转导效率 在MOI(Multiplicity of Infection)大于100的感染强度时，重组体腺病毒即可达到90.0%以上的转导效率[1].
2.3 腺病毒介导外源性p53的表达 Ad-p53使QBC939细胞中p53 mRNA的水平明显升高， 感染前QBC939细胞中无p53 mRNA (Fig 1).
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图 1 RT-PCR 分析Ad-p53 感染前后QBC939细胞的表达
Fig 1 RT-PCR analysis of p53 expression mediated by adenovirus in QBC939
M: marker，d4: 4 day after infection, C:control.
2.4 腺病毒介导野生型p53基因对QBC939细胞生长的影响 Ad-p53(100 MOI)对QBC939生长抑制率可达到和24.4%(8 day),与对照组及Ad-LacZ组(1.4%)比较，有显著差异(P<0.01). 抑瘤效应有显著的剂量与时间依赖性.
2.5 腺病毒介导野生型p53基因对QBC939细胞克隆形成能力的影响 QBC939细胞感染Ad-p53(MOI为100) 后，克隆形成数减少，抑制率为41.8，与对照组及Ad-LacZ组比较，有显著差异(P<0.01)，大大降低了QBC939细胞的克隆形成能力.
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2.6 腺病毒介导野生型p53基因感染后QBC939细胞的形态学变化 感染Ad-p53的QBC939细胞，在2 d左右便见细胞开始变圆、肿胀、胞质中出现空泡、随后细胞发生脱落，悬浮于培养基中(Fig 2). 变化的程度与剂量和时间有关. 剂量越大，时间越长，变化越严重. 一般当MOI达到100以上，经过5～6 d时间，所有的细胞均出现典型病变.
图 2 Ad-p53(B，3 d,100 MOI)感染QBC939细胞后形态变化(A,感染前)
Fig 2 Phase-contrast photomicrographs of Ad-LacZ-transfected (A) and Ad-p53-transfected (B) QBC939 cells at MOI of 100, 3 days after infection
, 百拇医药
表 1 流式细胞仪分析Ad-p53对QBC939细胞周期的作用
Tab 1 Effects of Ad-p53 on cell cycle of QBC939 mediated by FCM analysis(%,X±s)
Groups
% of cells in different phases
G1
S
G2/M
Control(4 d)
22.6±3.6
43.8±1.9
, 百拇医药
33.6±2.6
Ad-LacZ(100MOI, 4 d)
35.5±2.7
36.3±3.8
28.5±4.7
Ad-p53(100MOI, 4 d)
46.4±4.5a
22.0±6.3a
31.6±5.4
aP<0.05 vs control, Ad-LacZ. 2.7 腺病毒介导p53基因对细胞周期和诱导QBC939细胞凋亡的作用 以Ad-LacZ(MOI为 100)为对照，对Ad-p53(MOI为 100)感染4 d的QBC939细胞进行流式细胞计数分析(FCM)， 结果见Teb 1. Ad-p53能引起QBC939细胞的G1期阻滞和剂量依赖性的细胞凋亡. 提取感染细胞的DNA进行电泳分析的结果，Ad-p53引起QBC939细胞典型的DNA梯形裂缝现象(Fig 3).
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图 3 QBC939 细胞转染重组腺病毒Ad-p53后体外DNA片段化分析
Fig 3 DNA fragmentation QBC939 cells infected with recombinant adenoviruses
C:Control, 2，4，6 d: Ad-p53 infection for 2 or 4 or 6 days, M:Marker.
3 讨论
恶性肿瘤的基因治疗仍处于探索阶段，其突破仍需要新的概念和手段. 目前基因治疗的基本策略主要是细胞因子的基因转染和肿瘤疫苗[2-5]. 第一个被转导到不同肿瘤组织的抑癌基因是p53基因，它在调节细胞的增殖和凋亡方面起着很重要的作用，且它的正常功能在部分肿瘤中是丧失的[6-8]. 人们寄希望于将野生型p53基因转导到该基因缺失的肿瘤和使其高表达以达到抑制肿瘤生长的目的.
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p53基因产物为p53蛋白，由393个氨基酸组成能与特异的DNA序列结合并且激活转录. Hanas等[9]研究发现野生型p53可诱导p21/WAF1基因产生p21蛋白，此蛋白能与多种Cyclin/CDK复合物结合，抑制CDK的活性，导致Rb蛋白去磷酸化，从而阻滞细胞从G1期进入S期. p21还能与增殖细胞核抗原(PCNA)结合，抑制细胞DNA复制. 另外，p53诱导产生的一种GADD45蛋白也能与PCNA结合，抑制DNA合成. 野生型p53诱导有DNA损伤的细胞进入G1期，抑制细胞增殖，直到损伤的DNA修复. 一旦DNA不能被修复，野生型p53就活化那些诱导细胞凋亡的基因转录，使细胞凋亡. p21/WAF1本身并不能引起肿瘤细胞的凋亡[9-11] . 研究表明，p53只能使Rb阴性的肿瘤细胞发生凋亡. p53的高表达可以促使p16阳性细胞明显凋亡，其原因是p16阻断了Rb径路的结果[10，12]. 凋亡的发生需要两个条件，一是G1期的阻滞，二是一个低的pRb/p53的比例，两者缺一不可.
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Ad-p53对胆管癌QBC939细胞生长体外的生长抑制率为24.4%(8 d) (100 MOI)，且能显著地抑制肿瘤细胞的克隆形成能力. 通过对转导了p53基因的肿瘤细胞进行流式细胞计数和细胞DNA片段化，显示p53可能通过导致QBC939发生明显的细胞G1期阻滞和诱导其发生明显的凋亡. 到目前为止，p53基因对一些肿瘤具有一定的生长抑制作用，但其结果仍不令人满意. 寻找及开发新的基因治疗策略以使基因治疗达到更理想的效果已是人们追求的目标. 我们通过p53和p16及与顺铂联合应用明显提高对QBC939细胞的抑制作用(另文报道).
肿瘤的基因治疗仍处于不断发展阶段，需要对细胞周期的调节及凋亡的理论进行进一步的研究和探讨. 随着这两个理论的不断发展，将有助于基因治疗的生物学原则的不断完善. 结合传统的肿瘤治疗方法，如手术、化疗及放疗等，最终有效的控制肿瘤，直至根除肿瘤.
基金项目:863高科学技术发展资助项目(Z20-01-02)
, 百拇医药
作者简介:鲁建国(1963-), 男(汉族), 湖北省武昌人. 博士(导师黄志强院士)，主治医师. Tel.(029)3577732 Email.ligui@fmmu.edu.cn
鲁建国(第四军医大学唐都医院普外科, 陕西,西安 710038)
林晨(中国医学科学院,中国协和医科大学肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室,北京100021)
黄志强(解放军总医院普外研究所,北京100853)
吴金生(第四军医大学唐都医院普外科, 陕西,西安 710038)
付明(中国医学科学院,中国协和医科大学肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室,北京100021)
张雪艳(中国医学科学院,中国协和医科大学肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室,北京100021)
, 百拇医药
梁萧(中国医学科学院,中国协和医科大学肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室,北京100021)
要秀(第四军医大学唐都医院普外科, 陕西,西安 710038)
吴日文(解放军总医院普外研究所,北京100853)
参考文献：
[1] 鲁建国，林晨，吴金生et al. 腺病毒介导的p16对胆管癌细胞的生长抑制作用[J]. 第四军医大学学报，2000；21(4):464-468.
[2] Anderson WF. Gene therapy for cancer[J]. Hum Gene Ther, 1994; 5(1):1-2.
[3] Culver KW, Lisa A, David E et al. In vivo gene transfer with retroviral vector producer cells for treatment of experimentalbrain tumors[J]. Science,1992; 256(5063):1150-1152.
, 百拇医药
[4] Zhang Y. Retroviral vector-mediated transduction of K-ras antisense RNA into human cancer cells inhibits expression of the malignant phenotypy[J]. Hum Gene Ther,1993; 4(4): 451-460.
[5] Friedmann T. Gene therapy of cancer through restoration of tumor-suppressor function[J]? Cancer, 1992;70(6 Suppl):1810-1817.
[6] Ohashi M, Kanai F, Ueno H et al. Adenovirus mediated p53 tumor suppressor gene therapy for human gastric cancer cells in vitro and in vivo[J]. Gut, 1999; 44(3): 366-371.
, 百拇医药
[7] Merkle C, Fritsche M, Mundt M et al. Transcriptional regulation and induction of apoptosis: Implications for the use of monomeric p53 variants in gene therapy[J]. Gene Ther, 1998; 5(12):1631-1641.
[8] Wiman KG. New p53-based anti-cancer therapeutic strategies[J]. Med Oncol, 1998;15(4): 222-228.
[9] Hanas JS, Lerner MR, Lightfoot SA et al. Expression of the cyclin-dependent kinase inhibitor p21(WAF1/CIP1) and p53 tumor suppressor in dysplastic progression and adenocarcinoma in barrett esophagus[J]. Cancer, 1999;86(5):756-763.
, http://www.100md.com
[10] Merkle C, Fritsche M, Mundt M et al. Transcriptional regulation and induction of apoptosis:Implications for the use of monomeric p53 variants in gene therapy[J]. Gene Ther, 1998; 5 (12):1631-1641.
[11] Steele RJ, Thompson AM, Hall PA et al. The p53 tumour suppressor gene[J]. Br J Surg, 1998; 85(11):1460-1467.
[12] Weinberg RA. The retinoblastoma protein and cycle control[J]. Cell, 1995; 81(3):323-330., http://www.100md.com
鲁建国 林晨 黄志强 吴金生 付明 张雪艳 梁萧 要秀 吴日/文
摘 要：目的 研究p53基因对胆管癌细胞的作用. 方法 将重组体腺病毒p53转移到人胆管癌细胞QBC939, 用RT-PCR、克隆形成实验、流式细胞仪、DNA片段化分析等方法对p53基因的表达、细胞的生长抑制及机制进行分析. 结果 用Ad-LacZ进行重组体腺病毒转导效率的检测，发现当MOI为100以上时，重组体腺病毒可使90%以上的培养的人胆管癌QBC939细胞被转导. 用RT-PCR方法检测，在胆管癌QBC939细胞系中p53无表达. 重组体腺病毒能介导外源基因p53在胆管癌QBC939细胞系中高效表达. 重组体腺病毒介导的p53在QBC939细胞中表达，能抑制QBC939细胞的生长和集落形成. 流式细胞计数和细胞DNA Ladder， 证实p53能诱导QBC939细胞发生凋亡并导致其发生G1期阻滞. 结论 p53基因可能通过诱导肿瘤细胞凋亡及G1期阻滞在肿瘤的基因治疗方面发挥作用.
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关键词:胆管癌；p53基因；腺病毒；基因治疗；凋亡
0 引言
胆管癌由于早期缺乏典型的症状及体征，早期诊断困难，待明确诊断时，多已属中晚期，且手术危险性较大，死亡率高，术后复发率很高，预后较差. 近年来，随着分子生物学理论和DNA重组技术的飞速发展，肿瘤的基因治疗为肿瘤的治疗带来了新的契机. 本研究将重组体腺病毒p53转移到人胆管癌细胞QBC939中，观察p53基因可否抑制细胞的生长及诱导该细胞凋亡.
1 材料和方法
1.1 材料 重组腺病毒： Ad-p53及Ad-LacZ由中国医学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室构建. 人胆管癌细胞系QBC939细胞由第三军医大学西南医院肝胆外科王曙光教授惠赠. 培养条件为 RPMI 1640培养基，含100 mL.L-1胎牛血清，37℃，50 mL.L-1. PCR引物: 由上海Sangon公司合成p53 (扩增产物620 bp):上游1: 5′-TACTCCCCTGCCCTCAACAAGA-3′下游2: 5′-CTTAGCAC
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CTGAAGGGTGAAATATTC-3′; tubulin: ( 扩增
产物410 bp)： 上游: 5′-CTCATCACAGGCAAGG
AAGAT-3′, 下游: 5′- TTAAGGTAAGTGTAGG
TTGGG-3′.
1.2 方法 重组体腺病毒的繁殖、纯化、滴度测定， 病毒感染， 重组腺病毒的转导效率测定， 细胞存活率测定，克隆形成实验，流式细胞仪对细胞周期、RT-PCR分析及凋亡的分析参照有关文献[1]. 扩增 p53反应条件： 95℃ 5 min， 94℃ 30 s， 65℃ 1 min， 72℃ 1 min， 72℃ 1 min， 26个循环. 统计分析采用SAS统计软件包.
2 结果
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2.1 重组体腺病毒滴度的测定 重组腺病毒纯化后的滴度分别为Ad-p53： 2.0 ×1010 pfu.mL-1，Ad-LacZ：1.0×1010 pfu.mL-1.
2.2 重组体腺病毒的转导效率 在MOI(Multiplicity of Infection)大于100的感染强度时，重组体腺病毒即可达到90.0%以上的转导效率[1].
2.3 腺病毒介导外源性p53的表达 Ad-p53使QBC939细胞中p53 mRNA的水平明显升高， 感染前QBC939细胞中无p53 mRNA (Fig 1).
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图 1 RT-PCR 分析Ad-p53 感染前后QBC939细胞的表达
Fig 1 RT-PCR analysis of p53 expression mediated by adenovirus in QBC939
M: marker，d4: 4 day after infection, C:control.
2.4 腺病毒介导野生型p53基因对QBC939细胞生长的影响 Ad-p53(100 MOI)对QBC939生长抑制率可达到和24.4%(8 day),与对照组及Ad-LacZ组(1.4%)比较，有显著差异(P<0.01). 抑瘤效应有显著的剂量与时间依赖性.
2.5 腺病毒介导野生型p53基因对QBC939细胞克隆形成能力的影响 QBC939细胞感染Ad-p53(MOI为100) 后，克隆形成数减少，抑制率为41.8，与对照组及Ad-LacZ组比较，有显著差异(P<0.01)，大大降低了QBC939细胞的克隆形成能力.
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2.6 腺病毒介导野生型p53基因感染后QBC939细胞的形态学变化 感染Ad-p53的QBC939细胞，在2 d左右便见细胞开始变圆、肿胀、胞质中出现空泡、随后细胞发生脱落，悬浮于培养基中(Fig 2). 变化的程度与剂量和时间有关. 剂量越大，时间越长，变化越严重. 一般当MOI达到100以上，经过5～6 d时间，所有的细胞均出现典型病变.
图 2 Ad-p53(B，3 d,100 MOI)感染QBC939细胞后形态变化(A,感染前)
Fig 2 Phase-contrast photomicrographs of Ad-LacZ-transfected (A) and Ad-p53-transfected (B) QBC939 cells at MOI of 100, 3 days after infection
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表 1 流式细胞仪分析Ad-p53对QBC939细胞周期的作用
Tab 1 Effects of Ad-p53 on cell cycle of QBC939 mediated by FCM analysis(%,X±s)
Groups
% of cells in different phases
G1
S
G2/M
Control(4 d)
22.6±3.6
43.8±1.9
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33.6±2.6
Ad-LacZ(100MOI, 4 d)
35.5±2.7
36.3±3.8
28.5±4.7
Ad-p53(100MOI, 4 d)
46.4±4.5a
22.0±6.3a
31.6±5.4
aP<0.05 vs control, Ad-LacZ. 2.7 腺病毒介导p53基因对细胞周期和诱导QBC939细胞凋亡的作用 以Ad-LacZ(MOI为 100)为对照，对Ad-p53(MOI为 100)感染4 d的QBC939细胞进行流式细胞计数分析(FCM)， 结果见Teb 1. Ad-p53能引起QBC939细胞的G1期阻滞和剂量依赖性的细胞凋亡. 提取感染细胞的DNA进行电泳分析的结果，Ad-p53引起QBC939细胞典型的DNA梯形裂缝现象(Fig 3).
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图 3 QBC939 细胞转染重组腺病毒Ad-p53后体外DNA片段化分析
Fig 3 DNA fragmentation QBC939 cells infected with recombinant adenoviruses
C:Control, 2，4，6 d: Ad-p53 infection for 2 or 4 or 6 days, M:Marker.
3 讨论
恶性肿瘤的基因治疗仍处于探索阶段，其突破仍需要新的概念和手段. 目前基因治疗的基本策略主要是细胞因子的基因转染和肿瘤疫苗[2-5]. 第一个被转导到不同肿瘤组织的抑癌基因是p53基因，它在调节细胞的增殖和凋亡方面起着很重要的作用，且它的正常功能在部分肿瘤中是丧失的[6-8]. 人们寄希望于将野生型p53基因转导到该基因缺失的肿瘤和使其高表达以达到抑制肿瘤生长的目的.
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p53基因产物为p53蛋白，由393个氨基酸组成能与特异的DNA序列结合并且激活转录. Hanas等[9]研究发现野生型p53可诱导p21/WAF1基因产生p21蛋白，此蛋白能与多种Cyclin/CDK复合物结合，抑制CDK的活性，导致Rb蛋白去磷酸化，从而阻滞细胞从G1期进入S期. p21还能与增殖细胞核抗原(PCNA)结合，抑制细胞DNA复制. 另外，p53诱导产生的一种GADD45蛋白也能与PCNA结合，抑制DNA合成. 野生型p53诱导有DNA损伤的细胞进入G1期，抑制细胞增殖，直到损伤的DNA修复. 一旦DNA不能被修复，野生型p53就活化那些诱导细胞凋亡的基因转录，使细胞凋亡. p21/WAF1本身并不能引起肿瘤细胞的凋亡[9-11] . 研究表明，p53只能使Rb阴性的肿瘤细胞发生凋亡. p53的高表达可以促使p16阳性细胞明显凋亡，其原因是p16阻断了Rb径路的结果[10，12]. 凋亡的发生需要两个条件，一是G1期的阻滞，二是一个低的pRb/p53的比例，两者缺一不可.
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Ad-p53对胆管癌QBC939细胞生长体外的生长抑制率为24.4%(8 d) (100 MOI)，且能显著地抑制肿瘤细胞的克隆形成能力. 通过对转导了p53基因的肿瘤细胞进行流式细胞计数和细胞DNA片段化，显示p53可能通过导致QBC939发生明显的细胞G1期阻滞和诱导其发生明显的凋亡. 到目前为止，p53基因对一些肿瘤具有一定的生长抑制作用，但其结果仍不令人满意. 寻找及开发新的基因治疗策略以使基因治疗达到更理想的效果已是人们追求的目标. 我们通过p53和p16及与顺铂联合应用明显提高对QBC939细胞的抑制作用(另文报道).
肿瘤的基因治疗仍处于不断发展阶段，需要对细胞周期的调节及凋亡的理论进行进一步的研究和探讨. 随着这两个理论的不断发展，将有助于基因治疗的生物学原则的不断完善. 结合传统的肿瘤治疗方法，如手术、化疗及放疗等，最终有效的控制肿瘤，直至根除肿瘤.
基金项目:863高科学技术发展资助项目(Z20-01-02)
, 百拇医药
作者简介:鲁建国(1963-), 男(汉族), 湖北省武昌人. 博士(导师黄志强院士)，主治医师. Tel.(029)3577732 Email.ligui@fmmu.edu.cn
鲁建国(第四军医大学唐都医院普外科, 陕西,西安 710038)
林晨(中国医学科学院,中国协和医科大学肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室,北京100021)
黄志强(解放军总医院普外研究所,北京100853)
吴金生(第四军医大学唐都医院普外科, 陕西,西安 710038)
付明(中国医学科学院,中国协和医科大学肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室,北京100021)
张雪艳(中国医学科学院,中国协和医科大学肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室,北京100021)
, 百拇医药
梁萧(中国医学科学院,中国协和医科大学肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室,北京100021)
要秀(第四军医大学唐都医院普外科, 陕西,西安 710038)
吴日文(解放军总医院普外研究所,北京100853)
参考文献：
[1] 鲁建国，林晨，吴金生et al. 腺病毒介导的p16对胆管癌细胞的生长抑制作用[J]. 第四军医大学学报，2000；21(4):464-468.
[2] Anderson WF. Gene therapy for cancer[J]. Hum Gene Ther, 1994; 5(1):1-2.
[3] Culver KW, Lisa A, David E et al. In vivo gene transfer with retroviral vector producer cells for treatment of experimentalbrain tumors[J]. Science,1992; 256(5063):1150-1152.
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[4] Zhang Y. Retroviral vector-mediated transduction of K-ras antisense RNA into human cancer cells inhibits expression of the malignant phenotypy[J]. Hum Gene Ther,1993; 4(4): 451-460.
[5] Friedmann T. Gene therapy of cancer through restoration of tumor-suppressor function[J]? Cancer, 1992;70(6 Suppl):1810-1817.
[6] Ohashi M, Kanai F, Ueno H et al. Adenovirus mediated p53 tumor suppressor gene therapy for human gastric cancer cells in vitro and in vivo[J]. Gut, 1999; 44(3): 366-371.
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[7] Merkle C, Fritsche M, Mundt M et al. Transcriptional regulation and induction of apoptosis: Implications for the use of monomeric p53 variants in gene therapy[J]. Gene Ther, 1998; 5(12):1631-1641.
[8] Wiman KG. New p53-based anti-cancer therapeutic strategies[J]. Med Oncol, 1998;15(4): 222-228.
[9] Hanas JS, Lerner MR, Lightfoot SA et al. Expression of the cyclin-dependent kinase inhibitor p21(WAF1/CIP1) and p53 tumor suppressor in dysplastic progression and adenocarcinoma in barrett esophagus[J]. Cancer, 1999;86(5):756-763.
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[10] Merkle C, Fritsche M, Mundt M et al. Transcriptional regulation and induction of apoptosis:Implications for the use of monomeric p53 variants in gene therapy[J]. Gene Ther, 1998; 5 (12):1631-1641.
[11] Steele RJ, Thompson AM, Hall PA et al. The p53 tumour suppressor gene[J]. Br J Surg, 1998; 85(11):1460-1467.
[12] Weinberg RA. The retinoblastoma protein and cycle control[J]. Cell, 1995; 81(3):323-330., http://www.100md.com