甲1(H1N1)亚型流感病毒相变异分子生物学基础的研究
甲1(H1N1)亚型流感病毒相变异分子生物学基础的研究
郭元吉 董婕 王敏 张烨 郭俊峰 贝东
摘 要 目的 阐明甲1(H1N1)亚型毒株相变异的分子生物学基础。方法 病毒RNA经逆转录合成cDNA，利用聚合酶链反应(PCR)进行扩增，产物纯化，采用双脱氧链末端终止法进行核苷酸序列测定，最后用DNA STAR公司出品的序列分析软件MegAlign(1.03版)和Editseq(3.69版)对核苷酸序列进行分析。结果 见不到“O”、“D”相毒株HA1蛋白分子间有特殊氨基酸的差异。但1995年前后毒株在-2，-7，130和139位存在有差别。很有意义地发现了，自1995年以来，在我国人群中同时流行着两种HA基因不同的H1N1亚型流感病毒：一种与1995年之前所分离到的H1N1病毒相比较，其HA1区蛋白分子上氨基酸没发生任何丢失，另一种在第130位丢失一个氨基酸。结论 未发现H1N1亚型病毒“O”、“D”相毒株HA1区蛋白分子间有特殊氨基酸的差异。发现了自1995年以来，我国人群中同时流行着两种HA基因不同的H1N1亚型毒株。
, http://www.100md.com
关键词：正粘病毒A型，人 抗原性变异 分子生物学
1957年以前从人标本所分离出的H1N1亚型流感病毒均具有“O”相特性。而1957年以后，在人群中所出现的H2N2，H3N2及1977年重现的H1N1亚型毒株均表现出“D”相特性[1]。时隔30余年后，H1N1亚型毒株又重现了“O”相特性[2]。而且一直延续至今日。
流感病毒是依靠其毒粒表面HA1蛋白来识别和结合红细胞表面含唾液酸的糖蛋白或糖脂受体，导致了红细胞的凝集。Wei等[3]采用X射线分析法弄清了HA1蛋白结合唾液酸的结构。Nobusawa等[4]观察到了HA1蛋白受体结合位点中个别氨基酸替换就能直接影响HA1蛋白对红细胞结合的能力。故我们测定了H1N1亚型毒株於1977年重现以来，其HA1区基因的核苷酸序列，以便弄清“O”相特性重现的分子生物学基础。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 甲1(H1N1)亚型毒株的来源 见表1。除A/USSR/90/77由WHO提供外，其余均来自国家流感中心。
表1 本研究采用的甲1(H1N1)亚型流感病毒
Tab.1 Influenza A(H1N1) viruses examined in the current study
病毒
Viruses
简称
Abbreviation
相
Phase
, 百拇医药
A/USSR/90/77
USSR/90/77
D
A/Singapore/6/86
SIG/6/86
D
A/Rongfang/4/88
RF/4/88
D
A/Beijin/1/88
BEIJ/1/88
D
, 百拇医药
A/Beijing/262/95
BEIJ/262/95
D
A/Beijing/260/95
BEIJ/260/95
D
A/Shenzhen/227/95
SHZ/227/95
D
A/Beijing/50/96
BEIJ/50/96
, 百拇医药
O
A/Shenzhen/30/96
SHZ/30/96
D
A/Beijing/34/96
BEIJ/34/96
O
A/Beijing/48/96
BEIJ/48/96
O
A/Beijing/34/96
BEIJ/34/96
, 百拇医药
D
A/Beijing/48/96
BEIJ/48/96
D
A/Tianjin/35/96
TJ/35/96
D
A/Guangdong/105/97
GUD/105/97
O
A/Shenzhen/240/97
SHZ/240/97
, 百拇医药
O
A/Shenzhen/223/97
SHZ/223/97
D
1.2 病毒增殖 “D”相毒株按常规法接种9～11d龄鸡胚尿囊腔进行增殖，收获尿囊液，鸡红细胞凝集滴度≥40，细菌培养阴性者；“O”相毒株按常规接种MDCK细胞，收细胞维持液，对豚鼠红细胞凝集滴度≥40，并细菌培养阴性者。
1.3 “O”、“D”相转变 将具有“O”相特性的A/京科/34/96(H1N1)和A/京科/48/96(H1N1)毒株经鸡胚尿囊腔适应传代，当所收获的尿囊液对豚鼠和鸡红细胞凝集能力相等时，再经鸡胚尿囊腔传两代即为已从“O”相转变成“D”相。
1.4 病毒粒RNA提取 采用德国1995年出品的RNeasy RNA kit，按Q/AquickTM Handbook所提供的方法[5]。
, 百拇医药
1.5 引物，35S-ATP，逆转录酶，PCR试剂盒，PCR产物纯化试剂盒及Sequence System试剂盒均由美国CDC提供。
1.6 核苷酸序列分析 用DNA STAR公司出品的序列分析软件，MegAlign(1.03版)和Editseq(3.69版)。
2 结果
17株测定病毒，其HA1基因长度，1995年以前毒株均为978个核苷酸，而1995年之后毒株中1/3毒株与以前的毒株相同，2/3其长度为975个核苷酸(掉失一个编码130位氨基酸的密码子)。但它们彼此间无任何核苷酸插入。现根据所测出的核苷酸序列，推导出的氨基酸序列于图1。
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*:丢失；----：潜在糖基化位点丢失；—：潜在糖基化位点；O：“O”相
图1 甲1(H1N1)亚型毒株间HA1蛋白分子上氨基酸序列比较
Fig.1 Comparison of the deduced amino acid sequences of the HA gene HA1 domain among influenza A(H1N1) viruses means deletion.----potential glycosylation site deletion.—means potential glycosylation site.O means“O”phase
首先从图1先分析和比较潜在的糖基化位点，为便于比较把它们列于表2。
表2 甲1(H1N1)毒株HA1蛋白区潜在糖基化位点比较
, 百拇医药
Tab.2 Comparison of position and number of potential glycosylation sites on HA1 domain among influenza A(H1N1) viruses
病毒
Virus
潜在糖基化位点Potential glycosylation sites
10
11
23
63
87
123
, 百拇医药
125
155
160
205
269
287
Total
USSR/90/77
+
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+
-
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-
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9
IG/6/86
+
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+
-
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9
RF/4/88
+
+
+
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+
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9
BEIJ/1/88
+
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-
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10
BEIJ/262/95
+
+
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9
BEIJ/260/95
+
+
+
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+
, 百拇医药
+
-
-
+
-
+
+
9
SHZ/227/95
+
+
+
+
+
, 百拇医药
-
+
-
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-
+
8
O BEIJ/50/96
+
+
+
+
-
, 百拇医药
+
-
-
+
-
+
+
8
SHZ/30/96
+
+
+
+
+
, 百拇医药
-
+
-
+
-
-
+
8
O BEIJ/34/96
+
+
+
+
+
, 百拇医药
+
-
-
+
-
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+
8
O BEIJ/48/96
+
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+
+
+
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+
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8
BEIJ/34/96
+
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+
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8
BEIJ/48/96
+
+
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+
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+
-
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8
TJ/35/96
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+
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+
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-
+
-
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8
O GUD/105/97
+
+
+
+
-
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+
-
-
-
-
+
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7
O SHZ/240/97
+
+
+
+
+
, 百拇医药
+
-
-
+
-
+
+
9
SHZ/223/97
+
+
+
+
+
, 百拇医药
+
-
-
+
-
-
+
8
O表示“O”相. O represents “O” phase
表2结果表明，测定毒株潜在的糖基化位点为7～10个，其中两头：10，11，23和287位为所有毒株间共同的；“O”、“D”相毒株间见不到潜在糖基化位点有差异。然而，1988年以来毒株中，63位多了一个糖基化位点，除BEIJ/1/88毒株外，其余的155位均丢失了一个糖基化位点。
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其次从图1来看氨基酸序列演变情况，首先看第130位点(加上信号肽序列为147位)，1995年出现的2/3毒株此位点丢失；其次可看出，139位(抗原决定族Ca2区)，1995年之前毒株为K，而1995年及后毒株为N；157位(抗原决定族SB区)，1995年以来毒株均为L，之前除RF/4/88毒株外均为S；除此而外，-2和-7位1995年前后毒株间存在着差异。然而，“O”、“D”相毒株间见不到有氨基酸序列差异。
接着对测定毒株进行HA1基因进化树分析，结果于图2。
水平距离为HA核苷酸序列差异数
图2 甲1(H1N1)亚型毒株HA基因进化树
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Fig.2 Phylogenetic tree for the HA genes of influenza A(H1N1) viruses
Horizontal distance is proportional to the minimum number of nucleotide differences to join nodes in the HA sequence.Vertical lines are for spacing the branches
图2结果出乎意料地表明，1977年甲1(H1N1)亚型毒株重现以来，其HA基因进化不是延一条主干进行，可分为四组：第一组为USSR/90/77，SHZ/30/96和SHZ/227/97；第二组为SIG/6/86，RF/1/88和BEIJ/1/88；第三组为BEIJ/50/96，SHZ/240/97和GUD/105/97；第四组为图上方的8个毒株。
, 百拇医药
3 讨论
Morishita等人[6]报道了甲1(H1N1)亚型毒株“O”、“D”相间，其HA多肽分子上见不到有氨基酸序列差异，这点与我们结果是相符的。他们用嵌合和点突变实验证实“O”相毒株出现是由于1986年之前H1N1亚型毒株HA蛋白分子上193，196和197位点已发生了改变，接着1986年之后225位又发生了改变所造成，但我们结果未能证实这一点。
甲型流感病毒在其基因进化中发生插入或丢失是罕见的。据我们所知，H1N1毒株HA基因编码子丢失这属国际上首次发现。美国疾病控制中心内部资料已证实了这点，日本[6]直至1996年还尚未发现有编码子丢失的毒株。
Cox等人[7]报道了H1N1毒株HA基因进行是多途径的，我们结果进一步证实了这一点。
我们结果表明了，1995～1996年H1N1亚型毒株活动加强是由于其HA蛋白分子上氨基酸(130位点)发生丢失，139和157位点氨基酸发生了替换，及同时流行着基因特性不同毒株所造成。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670037)
作者单位：郭元吉(100052 北京，中国预防医学科学院病毒学研究所流感研究室)
董婕(100052 北京，中国预防医学科学院病毒学研究所流感研究室)
王敏(100052 北京，中国预防医学科学院病毒学研究所流感研究室)
张烨(100052 北京，中国预防医学科学院病毒学研究所流感研究室)
郭俊峰(100052 北京，中国预防医学科学院病毒学研究所流感研究室)
贝东(100052 北京，中国预防医学科学院病毒学研究所流感研究室)
参考文献
, 百拇医药
1，郭元吉，程小雯.流行性感冒病毒及其实验技术.北京：中国三峡出版社，1997.41-47.
2，郭元吉，赵惠芬，王敏，等.流感病毒相变异的发现及其意义.中华实验和临床病毒学杂志.1996，10：101-103.
3，Wei SW, Brown JH, Cusac K, et al. Structure of the influenza virus haemagglutinin complex with its receptor. Nature, 1988, 333: 426-431.
4，Nakajima NE. Amino acid subtitution at 226 of the hemagglutinin molecule of influenza A(H1N1) affects receptor binding activity but not fusion activity. Virology, 1988,167:8-13.
, http://www.100md.com
5，郭元吉，董婕，王敏，等.甲3(H3N2)亚型流感病毒相变异分子生物学基础的研究.中华实验和临床病毒学杂志.1998，12：18-22.
6，Morishita T, Nobusawa E, Nakajima K, et al. Studies on the molecular basis for loss of the ability of recent influenza A(H1N1) virus strains to agglutinate chicken erythrocytes. J Gen Virol, 1996,77:2499-2506.
7，Cox NJ, Black RA, Kendal AP. Pathways of evolution of influenza A(H1N1) viruses from 1977 to 1986 as determined by oligonucletide mapping and sequencing studies. J Gen Virol,1989,70:299-313., http://www.100md.com
郭元吉 董婕 王敏 张烨 郭俊峰 贝东
摘 要 目的 阐明甲1(H1N1)亚型毒株相变异的分子生物学基础。方法 病毒RNA经逆转录合成cDNA，利用聚合酶链反应(PCR)进行扩增，产物纯化，采用双脱氧链末端终止法进行核苷酸序列测定，最后用DNA STAR公司出品的序列分析软件MegAlign(1.03版)和Editseq(3.69版)对核苷酸序列进行分析。结果 见不到“O”、“D”相毒株HA1蛋白分子间有特殊氨基酸的差异。但1995年前后毒株在-2，-7，130和139位存在有差别。很有意义地发现了，自1995年以来，在我国人群中同时流行着两种HA基因不同的H1N1亚型流感病毒：一种与1995年之前所分离到的H1N1病毒相比较，其HA1区蛋白分子上氨基酸没发生任何丢失，另一种在第130位丢失一个氨基酸。结论 未发现H1N1亚型病毒“O”、“D”相毒株HA1区蛋白分子间有特殊氨基酸的差异。发现了自1995年以来，我国人群中同时流行着两种HA基因不同的H1N1亚型毒株。
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关键词：正粘病毒A型，人 抗原性变异 分子生物学
1957年以前从人标本所分离出的H1N1亚型流感病毒均具有“O”相特性。而1957年以后，在人群中所出现的H2N2，H3N2及1977年重现的H1N1亚型毒株均表现出“D”相特性[1]。时隔30余年后，H1N1亚型毒株又重现了“O”相特性[2]。而且一直延续至今日。
流感病毒是依靠其毒粒表面HA1蛋白来识别和结合红细胞表面含唾液酸的糖蛋白或糖脂受体，导致了红细胞的凝集。Wei等[3]采用X射线分析法弄清了HA1蛋白结合唾液酸的结构。Nobusawa等[4]观察到了HA1蛋白受体结合位点中个别氨基酸替换就能直接影响HA1蛋白对红细胞结合的能力。故我们测定了H1N1亚型毒株於1977年重现以来，其HA1区基因的核苷酸序列，以便弄清“O”相特性重现的分子生物学基础。
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1 材料和方法
1.1 甲1(H1N1)亚型毒株的来源 见表1。除A/USSR/90/77由WHO提供外，其余均来自国家流感中心。
表1 本研究采用的甲1(H1N1)亚型流感病毒
Tab.1 Influenza A(H1N1) viruses examined in the current study
病毒
Viruses
简称
Abbreviation
相
Phase
, 百拇医药
A/USSR/90/77
USSR/90/77
D
A/Singapore/6/86
SIG/6/86
D
A/Rongfang/4/88
RF/4/88
D
A/Beijin/1/88
BEIJ/1/88
D
, 百拇医药
A/Beijing/262/95
BEIJ/262/95
D
A/Beijing/260/95
BEIJ/260/95
D
A/Shenzhen/227/95
SHZ/227/95
D
A/Beijing/50/96
BEIJ/50/96
, 百拇医药
O
A/Shenzhen/30/96
SHZ/30/96
D
A/Beijing/34/96
BEIJ/34/96
O
A/Beijing/48/96
BEIJ/48/96
O
A/Beijing/34/96
BEIJ/34/96
, 百拇医药
D
A/Beijing/48/96
BEIJ/48/96
D
A/Tianjin/35/96
TJ/35/96
D
A/Guangdong/105/97
GUD/105/97
O
A/Shenzhen/240/97
SHZ/240/97
, 百拇医药
O
A/Shenzhen/223/97
SHZ/223/97
D
1.2 病毒增殖 “D”相毒株按常规法接种9～11d龄鸡胚尿囊腔进行增殖，收获尿囊液，鸡红细胞凝集滴度≥40，细菌培养阴性者；“O”相毒株按常规接种MDCK细胞，收细胞维持液，对豚鼠红细胞凝集滴度≥40，并细菌培养阴性者。
1.3 “O”、“D”相转变 将具有“O”相特性的A/京科/34/96(H1N1)和A/京科/48/96(H1N1)毒株经鸡胚尿囊腔适应传代，当所收获的尿囊液对豚鼠和鸡红细胞凝集能力相等时，再经鸡胚尿囊腔传两代即为已从“O”相转变成“D”相。
1.4 病毒粒RNA提取 采用德国1995年出品的RNeasy RNA kit，按Q/AquickTM Handbook所提供的方法[5]。
, 百拇医药
1.5 引物，35S-ATP，逆转录酶，PCR试剂盒，PCR产物纯化试剂盒及Sequence System试剂盒均由美国CDC提供。
1.6 核苷酸序列分析 用DNA STAR公司出品的序列分析软件，MegAlign(1.03版)和Editseq(3.69版)。
2 结果
17株测定病毒，其HA1基因长度，1995年以前毒株均为978个核苷酸，而1995年之后毒株中1/3毒株与以前的毒株相同，2/3其长度为975个核苷酸(掉失一个编码130位氨基酸的密码子)。但它们彼此间无任何核苷酸插入。现根据所测出的核苷酸序列，推导出的氨基酸序列于图1。
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*:丢失；----：潜在糖基化位点丢失；—：潜在糖基化位点；O：“O”相
图1 甲1(H1N1)亚型毒株间HA1蛋白分子上氨基酸序列比较
Fig.1 Comparison of the deduced amino acid sequences of the HA gene HA1 domain among influenza A(H1N1) viruses means deletion.----potential glycosylation site deletion.—means potential glycosylation site.O means“O”phase
首先从图1先分析和比较潜在的糖基化位点，为便于比较把它们列于表2。
表2 甲1(H1N1)毒株HA1蛋白区潜在糖基化位点比较
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Tab.2 Comparison of position and number of potential glycosylation sites on HA1 domain among influenza A(H1N1) viruses
病毒
Virus
潜在糖基化位点Potential glycosylation sites
10
11
23
63
87
123
, 百拇医药
125
155
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205
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Total
USSR/90/77
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IG/6/86
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BEIJ/1/88
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O BEIJ/50/96
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O BEIJ/48/96
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O表示“O”相. O represents “O” phase
表2结果表明，测定毒株潜在的糖基化位点为7～10个，其中两头：10，11，23和287位为所有毒株间共同的；“O”、“D”相毒株间见不到潜在糖基化位点有差异。然而，1988年以来毒株中，63位多了一个糖基化位点，除BEIJ/1/88毒株外，其余的155位均丢失了一个糖基化位点。
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其次从图1来看氨基酸序列演变情况，首先看第130位点(加上信号肽序列为147位)，1995年出现的2/3毒株此位点丢失；其次可看出，139位(抗原决定族Ca2区)，1995年之前毒株为K，而1995年及后毒株为N；157位(抗原决定族SB区)，1995年以来毒株均为L，之前除RF/4/88毒株外均为S；除此而外，-2和-7位1995年前后毒株间存在着差异。然而，“O”、“D”相毒株间见不到有氨基酸序列差异。
接着对测定毒株进行HA1基因进化树分析，结果于图2。
水平距离为HA核苷酸序列差异数
图2 甲1(H1N1)亚型毒株HA基因进化树
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Fig.2 Phylogenetic tree for the HA genes of influenza A(H1N1) viruses
Horizontal distance is proportional to the minimum number of nucleotide differences to join nodes in the HA sequence.Vertical lines are for spacing the branches
图2结果出乎意料地表明，1977年甲1(H1N1)亚型毒株重现以来，其HA基因进化不是延一条主干进行，可分为四组：第一组为USSR/90/77，SHZ/30/96和SHZ/227/97；第二组为SIG/6/86，RF/1/88和BEIJ/1/88；第三组为BEIJ/50/96，SHZ/240/97和GUD/105/97；第四组为图上方的8个毒株。
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3 讨论
Morishita等人[6]报道了甲1(H1N1)亚型毒株“O”、“D”相间，其HA多肽分子上见不到有氨基酸序列差异，这点与我们结果是相符的。他们用嵌合和点突变实验证实“O”相毒株出现是由于1986年之前H1N1亚型毒株HA蛋白分子上193，196和197位点已发生了改变，接着1986年之后225位又发生了改变所造成，但我们结果未能证实这一点。
甲型流感病毒在其基因进化中发生插入或丢失是罕见的。据我们所知，H1N1毒株HA基因编码子丢失这属国际上首次发现。美国疾病控制中心内部资料已证实了这点，日本[6]直至1996年还尚未发现有编码子丢失的毒株。
Cox等人[7]报道了H1N1毒株HA基因进行是多途径的，我们结果进一步证实了这一点。
我们结果表明了，1995～1996年H1N1亚型毒株活动加强是由于其HA蛋白分子上氨基酸(130位点)发生丢失，139和157位点氨基酸发生了替换，及同时流行着基因特性不同毒株所造成。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670037)
作者单位：郭元吉(100052 北京，中国预防医学科学院病毒学研究所流感研究室)
董婕(100052 北京，中国预防医学科学院病毒学研究所流感研究室)
王敏(100052 北京，中国预防医学科学院病毒学研究所流感研究室)
张烨(100052 北京，中国预防医学科学院病毒学研究所流感研究室)
郭俊峰(100052 北京，中国预防医学科学院病毒学研究所流感研究室)
贝东(100052 北京，中国预防医学科学院病毒学研究所流感研究室)
参考文献
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1，郭元吉，程小雯.流行性感冒病毒及其实验技术.北京：中国三峡出版社，1997.41-47.
2，郭元吉，赵惠芬，王敏，等.流感病毒相变异的发现及其意义.中华实验和临床病毒学杂志.1996，10：101-103.
3，Wei SW, Brown JH, Cusac K, et al. Structure of the influenza virus haemagglutinin complex with its receptor. Nature, 1988, 333: 426-431.
4，Nakajima NE. Amino acid subtitution at 226 of the hemagglutinin molecule of influenza A(H1N1) affects receptor binding activity but not fusion activity. Virology, 1988,167:8-13.
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5，郭元吉，董婕，王敏，等.甲3(H3N2)亚型流感病毒相变异分子生物学基础的研究.中华实验和临床病毒学杂志.1998，12：18-22.
6，Morishita T, Nobusawa E, Nakajima K, et al. Studies on the molecular basis for loss of the ability of recent influenza A(H1N1) virus strains to agglutinate chicken erythrocytes. J Gen Virol, 1996,77:2499-2506.
7，Cox NJ, Black RA, Kendal AP. Pathways of evolution of influenza A(H1N1) viruses from 1977 to 1986 as determined by oligonucletide mapping and sequencing studies. J Gen Virol,1989,70:299-313., http://www.100md.com