生物芯片技术及其应用前景
刘彦华 仝文斌 吴小意 陶其敏
关键词；生物芯片 生物芯片技术是近几年发展起来的，广泛应用于基因序列分析、杂交、基因突变检测及多态性分析、基因组文库图型分析以及疾病的基因诊断等领域的一项新技术。该技术同时将大量不同的探针固定于同一支持物上，因而可以一次性对同一样品进行大量序列检测和核酸分析。它的技术核心是生物芯片的制备及反应信号的检测。所谓生物芯片是由固定于不同种类支持介质上的高密度的寡核苷酸分子、基因片段或多肽分子的微阵列组成，其中每个分子的位置及序列为已知，当荧光标记的靶分子与芯片上的探针分子结合后，可通过激光共聚焦荧光扫描或电荷偶联摄影像机(CCD)对荧光信号的强度进行检测，从而对杂交结果进行量化分析。
一、生物芯片的种类
1.根据支持介质划分。制备芯片的固相介质有玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等。在选择固相介质时，应考虑其荧光背景的大小、化学稳定性、结构复杂性、介质对化学修饰作用的反应，介质表面积及其承载能力以及非特异吸附的程度等因素。目前较为常用的支持介质是玻片，无论是原位合成法还是合成点样法都可以使用玻片作其固相介质，而且在制备芯片前对该介质的预处理也相对简单易行。
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2.根据制备方法划分。芯片制备的方法主要有原位合成与合成点样。其中原位合成又可分为光引导聚合法和喷墨打印合成法(压电打印法)。光引导聚合法在合成前需先对介质进行处理，使之衍生出羟基或氨基并与光敏保护基建立共价连接，合成单体的一端用固相合成法活化，另一端与光敏保护基相连。在合成反应过程中，通过蔽光膜使特定的位点透光，其余位点不透光，只有受光的位点才能脱掉保护基并与特定单体活化端相连，单体的光敏保护端露出，经过若干上述循环反应后，使每个位点按需要合成特定序列的探针，其中每次合成反应中哪些位点上连接哪种单体，由更换不同的蔽光膜来控制[1]。喷墨打印合成法的原理类似于喷墨打印机，通过4个喷印头将4种碱基按序列要求依次喷印在芯片的特定位点上。合成点样法是指将预先合成好的探针用点样机点到介质上，点样前需将介质表面包被氨基硅烷或多聚赖氨酸，使之带上正电荷来吸附核酸分子。除上述3种方法外，还有用聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，将胶块(40 μm×40 μm×20 μm间隔80 μm，或100 μm×100 μm×20 μm间隔200 μm )固定在玻璃上，然后将合成好的不同探针分别加到不同的胶块上，制成以凝胶块为阵点的芯片[2]，或者也可以通过导电的吡咯单体的聚合形成微阵列。其基本原理是：在硅片上镀一层500 nm厚的金层，通过蚀刻技术在硅片上形成金-微电极，吡咯单体经过聚合在微电极上形成一层聚吡咯膜，其中与吡咯单体相连的探针在吡咯的聚合过程中连到电极上，每种探针的位置通过特定电极的开启与关闭来控制[3，4]。Ferguson等[5]还利用光纤束建立了光纤生物传感微阵列，它是将每根光纤维(直径200 μm)的一端共价连接上寡核苷酸探针，然后将这些连有不同寡核苷酸探针的光纤维装配成光纤束，构成光纤微阵列。检测时只需将光纤束连有不同探针的一端直接浸入靶样品溶液中即可，产生的荧光杂交信号可通过光纤维传导至光纤束的另一端，并通过荧光显微电荷偶联摄影系统对传导过来的信号进行检测。
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3.根据芯片上的探针划分。按芯片上探针的不同，生物芯片可分为基因芯片和蛋白芯片。如果芯片上固定的分子是寡核甘酸探针或靶DNA，则称为基因芯片；如果芯片上固定的是肽或蛋白，则称为肽芯片或蛋白芯片。其中基因芯片又包括模式Ⅰ和模式Ⅱ两种，模式Ⅰ是指将靶DNA固定于支持物上，适合于大量不同靶DNA的分析；模式Ⅱ是将大量探针分子固定于支持物上，适合于对同一靶DNA进行不同探针序列的分析。
二、基因芯片技术研究进展
1.基因芯片的制备。在制备基因芯片时要考虑阵列的密度、再生性、操作的简便性、成本的高低等几方面的因素 。光引导合成法与喷墨打印法、合成点样法相比，最大的优点是，它可以合成密度极高的阵列；但它的最大缺点是耗时、操作复杂，而且为保证在不同位点加上不同的单体，从而在不同的位点合成不同的探针，需要不断更换不同的蔽光膜，对一个含25个碱基的探针的微阵列，一般需更换100个蔽光膜，需1天多的时间才能完成[6]。合成点样法虽然芯片上探针的密度相对较低，每个样品都要预合成、纯化，在芯片制备前还需妥善保存合成的探针，但是它的最大优点是操作简便。目前很多公司采用这种方法来制备芯片。聚丙烯酰胺凝胶作为三维支持介质提高了寡核苷酸探针的容量，最大容量达50 mmol/L，可相当100倍于玻璃介质的二维固定容量[2]，而且凝胶单元彼此分开，降低了不同探针间与样品杂交的干扰，但受扩散效率的影响，只适合短的探针。通过导电的聚吡咯膜形成的芯片，由于聚吡咯的化学稳定性很高，芯片很容易通过碱变性处理而再生，且再生处理后没有残留的荧光[3，4]。光纤生物传导芯片最大的优点则是检测快速(<10分钟)、灵敏度高(10 nmol/L)[5]。
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2.样品的获得与标记。由于目前的检测体系还不能检测出未扩增的标记样品，所以待测样品DNA在杂交前一般都要进行聚合酶链反应(PCR)，在扩增的过程中，对靶DNA进行标记。目前DNA样品的扩增一般是通过液相反应来完成，但由于低浓度核酸很难检测到，在溶液中通过PCR反应获得线性扩增也很困难；另外，不同靶DNA对引物的竞争，意味着某一序列的扩增优于其他序列。为了解决上述问题，一些公司正在研究新的方法。如固相PCR系统，该系统是将2种引物排列在丙烯酰胺膜上，与DNA样品、PCR试剂混合，如样品含有靶序列，则开始扩增反应；通过这种固相PCR体系，可避免对引物的竞争，同时也降低了遗留污染[7]。
样品的标记主要是荧光标记。荧光标记基本分为2种，一种是使用荧光标记的引物，一种是使用荧光标记的三磷酸脱氧核糖核苷酸。目前常使用的荧光物质有：荧光素、罗丹明、HEX、TMR、FAM、Cy3、Cy5等。根据扩增产物分离的方法不同，标记的方法也不同：进行单引物标记的，其扩增产物通常由聚丙烯酰胺凝胶电泳分离[2]；对一个引物用生物素标记，另一个引物用荧光素标记的，一般用亲合素偶联的磁珠捕捉其扩增产物，通过变性处理使荧光标记的产物解链[8]。此外，也有用生物素残基标记引物，将生物素标记的扩增产物与芯片杂交，洗涤后加入亲合素连接的荧光物，通过生物素与亲合素的结合及靶序列与探针的结合产生荧光信号，然后利用荧光检测系统对荧光信号进行检测[4]。
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3.杂交反应。杂交反应是一个复杂的过程，受很多因素的影响，而杂交反应的质量和效率直接关系到检测结果的准确性。这些影响因素包括：(1)寡核苷酸探针密度的影响。低覆盖率使杂交信号减弱，而过高的覆盖率会造成相邻探针之间的杂交干扰。(2)支持介质与杂交序列间的间隔序列长度的影响。研究表明当间隔序列长度提高到15个寡核苷酸时杂交信号显著增强[8]。有研究表明，选择合适长度的间隔序列，可使杂交信号增强150倍[7]。(3)杂交序列长度的影响。在杂交反应中经常发生碱基错配现象，区分正常配对的互补复合物与单个或2个碱基的错配形成的复合物，主要依赖于形成的复合物的稳定性不同，而杂交序列的长度是影响复合物稳定性的一个重要因素，一般说来，短的杂交序列更容易区分碱基的错配，但复合物的稳定性要差一些；而长杂交序列形成的复合物稳定，而区分碱基错配能力要差一些。研究表明，12、15、20个碱基产生的杂交信号强度接近，但15个碱基的杂交序列区分错配碱基效果最好[8]。(4)GC含量的影响。GC含量不同的序列其复合物的稳定性也不同。(5)探针浓度的影响。以凝胶为支持介质的芯片，提高了寡核苷酸的浓度，在胶内进行的杂交更象在液相中进行的杂交反应，这些因素提高了对错配碱基的分辨率，同时也提高了芯片检测的灵敏度[2，9]。(6)核酸二级结构的影响。在使用凝胶作为支持介质时，单链核酸越长，则样品进入凝胶单元的时间越长，也就越容易形成链内二级结构从而影响其与芯片上探针的杂交，因而样品制备过程中，对核酸的片段化处理，不仅可提高杂交信号的强度，还可提高杂交速度[9]。
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4.信号检测。生物芯片的2个关键技术是芯片的制备与结果检测。目前荧光检测主要有2种：激光共聚焦荧光显微扫描和CCD荧光显微照相检测。前者检测灵敏度、分辨率均较高，但扫描时间长；后者扫描时间短，但灵敏度和分辨率不如前者。虽然荧光检测在芯片技术中得到了广泛的应用，但是荧光标记的靶DNA只要结合到芯片上就会产生荧光信号，而目前的检测系统还不能区分来自某一位点的荧光信号是由正常配对产生的，还是单个或2个碱基的错配产生的，或者兼而有之，甚或是由非特异性吸附产生的，因而目前的荧光检测系统还有待于进一步完善与发展。有研究者正试图绕过荧光标记，建立新的检测系统，以提高杂交信号检测的灵敏度。
5.基因芯片的应用
基因芯片技术由于可在1次反应中对1个样品进行大量杂交反应，并可对这些杂交信号进行平行分析，因而被广泛用于DNA序列分析、特别是杂交测序(sequence by hybridization, SbH)和邻堆杂交技术(contiguous stacking hybridization, CSH)。以上技术的应用和发展，使人类基因组计划的研究工作得到了很大的提高。
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随着cDNA芯片的发展，芯片技术在基因表达的监测及疾病诊断的研究中正在得到广泛应用。其基本原理是用2种不同荧光染料标记的靶序列同时与同1个cDNA芯片杂交，通过不同颜色的荧光信号强度分析即可反映出基因表达的变化。Pollack等[10]分别用Cy5(红色)和Cy3(绿色)标记来自乳腺癌患者细胞及正常人白细胞的DNA样品，然后与来自乳腺癌患者及正常人细胞的cDNA构成的微阵列杂交，产生不同颜色的荧光信号，其中红色代表增加的DNA拷贝数，绿色代表减少的DNA拷贝数，黄色代表DNA拷贝数没有变化。经上述比较，分析乳腺癌患者基因拷贝数的变化。Wang等[11]用类似技术分析了与卵巢癌的发展有关的基因。
此外，芯片技术还可用于基因组比较分析，Wilson等[12]用2种荧光染料分别标记药物处理前以及药物处理后的结核杆菌DNA，然后与包括结核杆菌97%开放阅读框架的DNA构成的微阵列杂交，通过不同颜色的荧光信号强度分析发现该药物诱导多个基因表达。Livache等[13]将HCV的5′UTR区及其型特异探针固定于硅芯片上，与不同标本的、扩增标记的DNA样品杂交，从而对其进行基因分型，结果表明，该技术用于基因分型灵敏度很高。
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尽管基因芯片的应用得到迅速发展，一些公司相继开发出自己的产品，其中p53基因芯片可检出大于80%的抑癌基因的突变，假阳性率很低(2%)；人免疫缺陷病毒(HIV)PRT 440也已广泛用于HIV1病毒的测序、分型及多态性分析。但由于该技术较为复杂，且成本高，目前对其的应用仍大多停留在实验室研究阶段，离临床检验及疾病诊断的普及性应用还有一段距离。
三、蛋白芯片
相对基因芯片而言，蛋白芯片(肽芯片)的研究和应用则较少。蛋白(肽)芯片是由固定于支持介质上的蛋白或多肽构成的微阵列。很多基因芯片的制备方法，如光引导聚合法、合成点样等，也可应用于蛋白(肽)芯片的制备。Lueking等[14]将已知蛋白点印在PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上，制成蛋白微阵列，并将抗体与该芯片进行孵育反应，再将辣根过氧化物酶(HRP)标记的第二抗体与芯片-抗体复合物反应，通过显色反应检测抗体的存在情况，从而对抗体进行筛选。该方法不仅适合于抗原、抗体的筛选，同样也可用于受体-配体的相互作用的研究。目前，国内已有学者在从事蛋白芯片的研究，期待近期将有相关报道。
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四、生物芯片的应用前景
生物芯片技术因其可在一次反应中进行多种信息的平行分析，而受到众多研究者的瞩目，特别是基因芯片在人类基因组计划的研究工作中的应用，不仅极大地促进了该项工作的进行，也使芯片技术在短短的几年间得到了长足的发展，并迅速在杂交测序以外的领域得到广泛的应用，如上所述的基因表达分析、基因组比较分析、多态性分析以及疾病的基因诊断等。但该技术成本高，芯片的制备比较复杂，样品的准备与标记较为繁琐，且其信号检测的灵敏度也有待于进一步提高，这些问题使得该技术的普及与进一步推广存在一定的难度。目前国外正在致力于这些问题的解决与研究，国内也有研究者正在积极地开展该项研究工作。我们有理由相信，随着该技术的不断完善与发展，在将来，无论是基因芯片还是蛋白芯片都会作为一种简便快捷的技术，为我们的研究工作与临床检测带来极大的便利。
作者单位：刘彦华(100037 北京市德易生物化学研究所)
仝文斌(100037 北京市德易生物化学研究所)
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吴小意(100037 北京市德易生物化学研究所)
陶其敏(北京医科大学人民医院肝病研究所)
参考文献
1，Pease AC, Solas D, Sullivan EJ, et al. Light-generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91:5022-5026.
2，Yershov G, Barsky V, Belgovskiy A, et al. DNA analysis and diagnostics on oligonucleotide microchips. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93:4913-4918.
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3，Livache T, Bazin H, Mathis G. Conducting polymers on microelectronic devices as tools for biological analyses. Clin Chim Acta, 1998, 278:171-176.
4，Livache T, Fouque B, Roget A, et al. Polypyrrole DNA chip on a silicon device: example of hepatitis C virus genotyping. Anal Biochem, 1998, 255:188-194.
5，Ferguson JA, Boles TC, Adams CP, et al. A fiber-optic DNA biosensor microarray for the analysis of gene expression. Nat Biotechnol, 1996, 14:1681-1684.
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6，Blanchard AP, Kaiser JR, Hood LE, et al. High-density oligonucleotide arrays. Biosens Bioelectron, 1996, 11:687-690.
7，Marshall A, Hodgson J. DNA chips: an array of possibilities. Nat Biotechnol,1998, 16:27-31.
8，Guo Z, Guilfoyle RA, Thiel AJ, et al. Direct fluorescence analysis of genetic polymorphisms by hybridization with oligonucleotide arrays on glass supports. Nucl Acids Res, 1994, 22:5456-5465.
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9，Drobyshev A, Mologina N, Shik V, et al. Sequence analysis by hybridization with oligonucleotide microchip:identification of β-thalassemia mutations. Gene, 1997, 188:45-52.
10，Pollack JR, Perou CM, Alizadeh AA, et al. Genome-wide analysis of DNA copy-number changes using cDNA microarrays. Nat Genet, 1999, 23:41-46.
11，Wang K, Gan L, Jeffery E, et al. Monitoring gene expression profile changes in ovarian carcinomas using cDNA microarray. Gene, 1999, 229:101-108.
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12，Wilson M, DeRisi J, Kristensen HH, et al. Exploring drug-induced alterations in gene expression in mycobacterium tuberculosis by microarray hybridization. PNAS, 1999, 96:12833-12838.
13，Livache T, Fouque B,Roget A, et al. Polypyrrole DNA chip on silicon device:example of hepatitis C Virus genotyping. Anal Biochem, 1998, 255:188-194.
14，Lueking A, Horn M, Eickhoff H, et al. Protein microarrays for gene expression and antibody screening. Anal Biochem, 1999, 270:103-111., 百拇医药
关键词；生物芯片 生物芯片技术是近几年发展起来的，广泛应用于基因序列分析、杂交、基因突变检测及多态性分析、基因组文库图型分析以及疾病的基因诊断等领域的一项新技术。该技术同时将大量不同的探针固定于同一支持物上，因而可以一次性对同一样品进行大量序列检测和核酸分析。它的技术核心是生物芯片的制备及反应信号的检测。所谓生物芯片是由固定于不同种类支持介质上的高密度的寡核苷酸分子、基因片段或多肽分子的微阵列组成，其中每个分子的位置及序列为已知，当荧光标记的靶分子与芯片上的探针分子结合后，可通过激光共聚焦荧光扫描或电荷偶联摄影像机(CCD)对荧光信号的强度进行检测，从而对杂交结果进行量化分析。
一、生物芯片的种类
1.根据支持介质划分。制备芯片的固相介质有玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等。在选择固相介质时，应考虑其荧光背景的大小、化学稳定性、结构复杂性、介质对化学修饰作用的反应，介质表面积及其承载能力以及非特异吸附的程度等因素。目前较为常用的支持介质是玻片，无论是原位合成法还是合成点样法都可以使用玻片作其固相介质，而且在制备芯片前对该介质的预处理也相对简单易行。
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2.根据制备方法划分。芯片制备的方法主要有原位合成与合成点样。其中原位合成又可分为光引导聚合法和喷墨打印合成法(压电打印法)。光引导聚合法在合成前需先对介质进行处理，使之衍生出羟基或氨基并与光敏保护基建立共价连接，合成单体的一端用固相合成法活化，另一端与光敏保护基相连。在合成反应过程中，通过蔽光膜使特定的位点透光，其余位点不透光，只有受光的位点才能脱掉保护基并与特定单体活化端相连，单体的光敏保护端露出，经过若干上述循环反应后，使每个位点按需要合成特定序列的探针，其中每次合成反应中哪些位点上连接哪种单体，由更换不同的蔽光膜来控制[1]。喷墨打印合成法的原理类似于喷墨打印机，通过4个喷印头将4种碱基按序列要求依次喷印在芯片的特定位点上。合成点样法是指将预先合成好的探针用点样机点到介质上，点样前需将介质表面包被氨基硅烷或多聚赖氨酸，使之带上正电荷来吸附核酸分子。除上述3种方法外，还有用聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，将胶块(40 μm×40 μm×20 μm间隔80 μm，或100 μm×100 μm×20 μm间隔200 μm )固定在玻璃上，然后将合成好的不同探针分别加到不同的胶块上，制成以凝胶块为阵点的芯片[2]，或者也可以通过导电的吡咯单体的聚合形成微阵列。其基本原理是：在硅片上镀一层500 nm厚的金层，通过蚀刻技术在硅片上形成金-微电极，吡咯单体经过聚合在微电极上形成一层聚吡咯膜，其中与吡咯单体相连的探针在吡咯的聚合过程中连到电极上，每种探针的位置通过特定电极的开启与关闭来控制[3，4]。Ferguson等[5]还利用光纤束建立了光纤生物传感微阵列，它是将每根光纤维(直径200 μm)的一端共价连接上寡核苷酸探针，然后将这些连有不同寡核苷酸探针的光纤维装配成光纤束，构成光纤微阵列。检测时只需将光纤束连有不同探针的一端直接浸入靶样品溶液中即可，产生的荧光杂交信号可通过光纤维传导至光纤束的另一端，并通过荧光显微电荷偶联摄影系统对传导过来的信号进行检测。
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3.根据芯片上的探针划分。按芯片上探针的不同，生物芯片可分为基因芯片和蛋白芯片。如果芯片上固定的分子是寡核甘酸探针或靶DNA，则称为基因芯片；如果芯片上固定的是肽或蛋白，则称为肽芯片或蛋白芯片。其中基因芯片又包括模式Ⅰ和模式Ⅱ两种，模式Ⅰ是指将靶DNA固定于支持物上，适合于大量不同靶DNA的分析；模式Ⅱ是将大量探针分子固定于支持物上，适合于对同一靶DNA进行不同探针序列的分析。
二、基因芯片技术研究进展
1.基因芯片的制备。在制备基因芯片时要考虑阵列的密度、再生性、操作的简便性、成本的高低等几方面的因素 。光引导合成法与喷墨打印法、合成点样法相比，最大的优点是，它可以合成密度极高的阵列；但它的最大缺点是耗时、操作复杂，而且为保证在不同位点加上不同的单体，从而在不同的位点合成不同的探针，需要不断更换不同的蔽光膜，对一个含25个碱基的探针的微阵列，一般需更换100个蔽光膜，需1天多的时间才能完成[6]。合成点样法虽然芯片上探针的密度相对较低，每个样品都要预合成、纯化，在芯片制备前还需妥善保存合成的探针，但是它的最大优点是操作简便。目前很多公司采用这种方法来制备芯片。聚丙烯酰胺凝胶作为三维支持介质提高了寡核苷酸探针的容量，最大容量达50 mmol/L，可相当100倍于玻璃介质的二维固定容量[2]，而且凝胶单元彼此分开，降低了不同探针间与样品杂交的干扰，但受扩散效率的影响，只适合短的探针。通过导电的聚吡咯膜形成的芯片，由于聚吡咯的化学稳定性很高，芯片很容易通过碱变性处理而再生，且再生处理后没有残留的荧光[3，4]。光纤生物传导芯片最大的优点则是检测快速(<10分钟)、灵敏度高(10 nmol/L)[5]。
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2.样品的获得与标记。由于目前的检测体系还不能检测出未扩增的标记样品，所以待测样品DNA在杂交前一般都要进行聚合酶链反应(PCR)，在扩增的过程中，对靶DNA进行标记。目前DNA样品的扩增一般是通过液相反应来完成，但由于低浓度核酸很难检测到，在溶液中通过PCR反应获得线性扩增也很困难；另外，不同靶DNA对引物的竞争，意味着某一序列的扩增优于其他序列。为了解决上述问题，一些公司正在研究新的方法。如固相PCR系统，该系统是将2种引物排列在丙烯酰胺膜上，与DNA样品、PCR试剂混合，如样品含有靶序列，则开始扩增反应；通过这种固相PCR体系，可避免对引物的竞争，同时也降低了遗留污染[7]。
样品的标记主要是荧光标记。荧光标记基本分为2种，一种是使用荧光标记的引物，一种是使用荧光标记的三磷酸脱氧核糖核苷酸。目前常使用的荧光物质有：荧光素、罗丹明、HEX、TMR、FAM、Cy3、Cy5等。根据扩增产物分离的方法不同，标记的方法也不同：进行单引物标记的，其扩增产物通常由聚丙烯酰胺凝胶电泳分离[2]；对一个引物用生物素标记，另一个引物用荧光素标记的，一般用亲合素偶联的磁珠捕捉其扩增产物，通过变性处理使荧光标记的产物解链[8]。此外，也有用生物素残基标记引物，将生物素标记的扩增产物与芯片杂交，洗涤后加入亲合素连接的荧光物，通过生物素与亲合素的结合及靶序列与探针的结合产生荧光信号，然后利用荧光检测系统对荧光信号进行检测[4]。
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3.杂交反应。杂交反应是一个复杂的过程，受很多因素的影响，而杂交反应的质量和效率直接关系到检测结果的准确性。这些影响因素包括：(1)寡核苷酸探针密度的影响。低覆盖率使杂交信号减弱，而过高的覆盖率会造成相邻探针之间的杂交干扰。(2)支持介质与杂交序列间的间隔序列长度的影响。研究表明当间隔序列长度提高到15个寡核苷酸时杂交信号显著增强[8]。有研究表明，选择合适长度的间隔序列，可使杂交信号增强150倍[7]。(3)杂交序列长度的影响。在杂交反应中经常发生碱基错配现象，区分正常配对的互补复合物与单个或2个碱基的错配形成的复合物，主要依赖于形成的复合物的稳定性不同，而杂交序列的长度是影响复合物稳定性的一个重要因素，一般说来，短的杂交序列更容易区分碱基的错配，但复合物的稳定性要差一些；而长杂交序列形成的复合物稳定，而区分碱基错配能力要差一些。研究表明，12、15、20个碱基产生的杂交信号强度接近，但15个碱基的杂交序列区分错配碱基效果最好[8]。(4)GC含量的影响。GC含量不同的序列其复合物的稳定性也不同。(5)探针浓度的影响。以凝胶为支持介质的芯片，提高了寡核苷酸的浓度，在胶内进行的杂交更象在液相中进行的杂交反应，这些因素提高了对错配碱基的分辨率，同时也提高了芯片检测的灵敏度[2，9]。(6)核酸二级结构的影响。在使用凝胶作为支持介质时，单链核酸越长，则样品进入凝胶单元的时间越长，也就越容易形成链内二级结构从而影响其与芯片上探针的杂交，因而样品制备过程中，对核酸的片段化处理，不仅可提高杂交信号的强度，还可提高杂交速度[9]。
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4.信号检测。生物芯片的2个关键技术是芯片的制备与结果检测。目前荧光检测主要有2种：激光共聚焦荧光显微扫描和CCD荧光显微照相检测。前者检测灵敏度、分辨率均较高，但扫描时间长；后者扫描时间短，但灵敏度和分辨率不如前者。虽然荧光检测在芯片技术中得到了广泛的应用，但是荧光标记的靶DNA只要结合到芯片上就会产生荧光信号，而目前的检测系统还不能区分来自某一位点的荧光信号是由正常配对产生的，还是单个或2个碱基的错配产生的，或者兼而有之，甚或是由非特异性吸附产生的，因而目前的荧光检测系统还有待于进一步完善与发展。有研究者正试图绕过荧光标记，建立新的检测系统，以提高杂交信号检测的灵敏度。
5.基因芯片的应用
基因芯片技术由于可在1次反应中对1个样品进行大量杂交反应，并可对这些杂交信号进行平行分析，因而被广泛用于DNA序列分析、特别是杂交测序(sequence by hybridization, SbH)和邻堆杂交技术(contiguous stacking hybridization, CSH)。以上技术的应用和发展，使人类基因组计划的研究工作得到了很大的提高。
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随着cDNA芯片的发展，芯片技术在基因表达的监测及疾病诊断的研究中正在得到广泛应用。其基本原理是用2种不同荧光染料标记的靶序列同时与同1个cDNA芯片杂交，通过不同颜色的荧光信号强度分析即可反映出基因表达的变化。Pollack等[10]分别用Cy5(红色)和Cy3(绿色)标记来自乳腺癌患者细胞及正常人白细胞的DNA样品，然后与来自乳腺癌患者及正常人细胞的cDNA构成的微阵列杂交，产生不同颜色的荧光信号，其中红色代表增加的DNA拷贝数，绿色代表减少的DNA拷贝数，黄色代表DNA拷贝数没有变化。经上述比较，分析乳腺癌患者基因拷贝数的变化。Wang等[11]用类似技术分析了与卵巢癌的发展有关的基因。
此外，芯片技术还可用于基因组比较分析，Wilson等[12]用2种荧光染料分别标记药物处理前以及药物处理后的结核杆菌DNA，然后与包括结核杆菌97%开放阅读框架的DNA构成的微阵列杂交，通过不同颜色的荧光信号强度分析发现该药物诱导多个基因表达。Livache等[13]将HCV的5′UTR区及其型特异探针固定于硅芯片上，与不同标本的、扩增标记的DNA样品杂交，从而对其进行基因分型，结果表明，该技术用于基因分型灵敏度很高。
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尽管基因芯片的应用得到迅速发展，一些公司相继开发出自己的产品，其中p53基因芯片可检出大于80%的抑癌基因的突变，假阳性率很低(2%)；人免疫缺陷病毒(HIV)PRT 440也已广泛用于HIV1病毒的测序、分型及多态性分析。但由于该技术较为复杂，且成本高，目前对其的应用仍大多停留在实验室研究阶段，离临床检验及疾病诊断的普及性应用还有一段距离。
三、蛋白芯片
相对基因芯片而言，蛋白芯片(肽芯片)的研究和应用则较少。蛋白(肽)芯片是由固定于支持介质上的蛋白或多肽构成的微阵列。很多基因芯片的制备方法，如光引导聚合法、合成点样等，也可应用于蛋白(肽)芯片的制备。Lueking等[14]将已知蛋白点印在PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上，制成蛋白微阵列，并将抗体与该芯片进行孵育反应，再将辣根过氧化物酶(HRP)标记的第二抗体与芯片-抗体复合物反应，通过显色反应检测抗体的存在情况，从而对抗体进行筛选。该方法不仅适合于抗原、抗体的筛选，同样也可用于受体-配体的相互作用的研究。目前，国内已有学者在从事蛋白芯片的研究，期待近期将有相关报道。
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四、生物芯片的应用前景
生物芯片技术因其可在一次反应中进行多种信息的平行分析，而受到众多研究者的瞩目，特别是基因芯片在人类基因组计划的研究工作中的应用，不仅极大地促进了该项工作的进行，也使芯片技术在短短的几年间得到了长足的发展，并迅速在杂交测序以外的领域得到广泛的应用，如上所述的基因表达分析、基因组比较分析、多态性分析以及疾病的基因诊断等。但该技术成本高，芯片的制备比较复杂，样品的准备与标记较为繁琐，且其信号检测的灵敏度也有待于进一步提高，这些问题使得该技术的普及与进一步推广存在一定的难度。目前国外正在致力于这些问题的解决与研究，国内也有研究者正在积极地开展该项研究工作。我们有理由相信，随着该技术的不断完善与发展，在将来，无论是基因芯片还是蛋白芯片都会作为一种简便快捷的技术，为我们的研究工作与临床检测带来极大的便利。
作者单位：刘彦华(100037 北京市德易生物化学研究所)
仝文斌(100037 北京市德易生物化学研究所)
, 百拇医药
吴小意(100037 北京市德易生物化学研究所)
陶其敏(北京医科大学人民医院肝病研究所)
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