细胞信号转导、基因表达、DNA复制保真度与哺乳细胞非定标性突变——致癌物诱发基因突变分子机制研究
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中国病理生理杂志 2000年第10期第16卷 第七届肿瘤和第
作者：余应年 孙雪敏 冯朝晖 胡文蔚 宋韬 谢海洋
单位：浙江大学医学院病理生理教研室和医学分子生物学实验室，浙江 杭州 310031
关键词：
中国病理生理杂志0010169
本实验室曾应用一携带SupF tRNA 基因的穿梭质粒pZ189，转染在24h前经受半寿期仅1.1h的烷化剂N-甲基-N'-硝基-N-亚硝胍(MNNG)攻击的vero细胞，从回收的在细胞中进行过复制的质粒中选出了靶基因SupF tRNA的突变体，并有突变发生的序列特异性，由此证明烷化剂MNNG攻击后可在非损伤碱基部位诱发突变(非定标性突变)。对其发生机制进行了系统研究。主要结果如下：
一、非定标性突变的基因表达依存性
, 百拇医药
细胞在MNNG攻击后不同时间转染质粒pZ189靶基因SupF tRNA中的非定标性突变在3h时开始显现，随后逐渐升高，于12h达最高峰，以后逐渐下降。经0.2 μmol/L MNNG处理2.5h后3、6、12、24、36h转染pZ189，靶基因中的诱发和自发突变频率的比分别为1.49、4.42(P<0.01)、5.44(P<0.01)、1.94和1.22；细胞在MNNG攻击后用0.5 μg/mL放线菌素-D阻断基因转录，非定标性突变形成被完全抑制。诱发突变频率(x 10-4)自8.24降至2.28(P<0.01)，后者与自发突变频率2.54无显著差异(P>0.05)。
二、筛选到两个可影响非定标性突变形成的cDNA片段
运用mRNA差异显示技术从MNNG攻击过的细胞中分离到23个表达有差异的cDNA片段(表达序列标识)，通过构建含反向插入片段的真核细胞表达重组体并转染细胞，获得了以反义RNA阻断相应基因表达的细胞系。观察了这些细胞的MNNG诱发的非定标性突变的发生率的改变。筛选到两个片段(片段9和10)，可显著影响突变的发生。片段9的相关基因表达被阻断后MNNG诱发的非定标性突变频率(x 10-4)自25.0增高至67.0(P<0.05))，而相应的自发突变频率分别为4.7和4.0(与相应的诱发突变频率相比P皆<0.01)；片段10的相关基因表达被阻断后MNNG诱发的非定标性突变频率(x 10-4)自16.1降至2.5(P<0.01)，而相应的自发突变频率分别为4.6和5.0(前者与相应的诱发突变频率相比P<0.05，后者P>0.05)。
, 百拇医药
三、MNNG诱发细胞DNA复制保真度、错配碱基识别和校正功能
应用体外DNA复制系统证明在MNNG攻击过的细胞抽提液中进行复制的质粒pZ189DNA的产物中靶基因中的复制差错明显升高。在0.2 μmol/L MNNG处理后6、12、24h的细胞抽提液中进行复制所获得的pZ189转化宿主菌后的突变频率(x 10-4)分别为12.7、15.7和10.3，显著高于在对照细胞抽提液中的1.8(P<0.01，P<0.05)；但用合成的有碱基错配的寡核苷酸双链的凝胶阻滞试验和特定设计的酶切位点改变检查在不同浓度MNNG处理的细胞在不同时间都未发现碱基错配识别蛋白和碱基错配校正功能异常。
四、MNNG诱发细胞DNA聚合酶酶谱改变
用定量RT-PCR证明细胞经MNNG攻击后无校读功能的DNA聚合酶beta表达明显升高，DNA聚合酶的RT-PCR产物的光密度值与内参照b2-微球蛋白的光密度值的比在MNNG处理后的12、24、30h分别为0.975+0.092、1.013+0.081和0.964+0.116显著高于对照的0.458+0.086(P<0.05)，其它时间段则与对照无显著差异；DNA聚合酶alpha、delta、episilon和拓扑异构酶II alpha未发现表达改变。
, 百拇医药
五、MNNG诱发的非定标性突变形成中有细胞信号转导途径的激活
可激活应激信号转导的蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHM) 5 μg/mL 可促进0.2 μg/L MNNG 诱发的非定标性突变。 其突变频率(x 10-4)自6.38增高至12.27(P<0.05)；在磷饥饿后在含[32P]标记磷酸盐培养基中培养的细胞中用双向蛋白电泳发现在MNNG或CHM处理后都出现两个分子量分别为68和43kD左右的磷酸化蛋白斑；用抗磷酸酪氨酸抗体的Western印迹试验也证明MNNG和CHM处理细胞中有62和45kD蛋白质发生酪氨酸残基磷酸化程度增强：用抗Jun-N-末端激酶(JNK/SAPK)抗体的Western印迹试验证明JNK磷酸化增强，用固相酶活性测定证明JNK的活性于MNNG或CHM处理后升高了6.7和3.0倍。在MNNG处理细胞中cAMP含量、PKA活性和CREB丝氨酸残基磷酸化程度都有一过性升高；用共聚焦显微镜技术证明MNNG处理细胞出现表皮生长因子受体和肿瘤坏死因子受体的聚簇。这些结果提示MNNG处理可引起细胞信号通路的激活。
根据以上研究结果，对致癌物诱发的以基因非定标性突变为特征的遗传不稳定的发生机制，提出以下假设：化学致癌物→DNA损伤和非DNA损伤性应激→细胞信号转导途径激活→基因表达改变→DNA聚合酶酶谱和其它有关改变→DNA复制保真度降低→细胞遗传不稳定→基因非定标性突变
国家自然科学基金； 浙江省自然科学基金资助, 百拇医药
单位：浙江大学医学院病理生理教研室和医学分子生物学实验室，浙江 杭州 310031
关键词：
中国病理生理杂志0010169
本实验室曾应用一携带SupF tRNA 基因的穿梭质粒pZ189，转染在24h前经受半寿期仅1.1h的烷化剂N-甲基-N'-硝基-N-亚硝胍(MNNG)攻击的vero细胞，从回收的在细胞中进行过复制的质粒中选出了靶基因SupF tRNA的突变体，并有突变发生的序列特异性，由此证明烷化剂MNNG攻击后可在非损伤碱基部位诱发突变(非定标性突变)。对其发生机制进行了系统研究。主要结果如下：
一、非定标性突变的基因表达依存性
, 百拇医药
细胞在MNNG攻击后不同时间转染质粒pZ189靶基因SupF tRNA中的非定标性突变在3h时开始显现，随后逐渐升高，于12h达最高峰，以后逐渐下降。经0.2 μmol/L MNNG处理2.5h后3、6、12、24、36h转染pZ189，靶基因中的诱发和自发突变频率的比分别为1.49、4.42(P<0.01)、5.44(P<0.01)、1.94和1.22；细胞在MNNG攻击后用0.5 μg/mL放线菌素-D阻断基因转录，非定标性突变形成被完全抑制。诱发突变频率(x 10-4)自8.24降至2.28(P<0.01)，后者与自发突变频率2.54无显著差异(P>0.05)。
二、筛选到两个可影响非定标性突变形成的cDNA片段
运用mRNA差异显示技术从MNNG攻击过的细胞中分离到23个表达有差异的cDNA片段(表达序列标识)，通过构建含反向插入片段的真核细胞表达重组体并转染细胞，获得了以反义RNA阻断相应基因表达的细胞系。观察了这些细胞的MNNG诱发的非定标性突变的发生率的改变。筛选到两个片段(片段9和10)，可显著影响突变的发生。片段9的相关基因表达被阻断后MNNG诱发的非定标性突变频率(x 10-4)自25.0增高至67.0(P<0.05))，而相应的自发突变频率分别为4.7和4.0(与相应的诱发突变频率相比P皆<0.01)；片段10的相关基因表达被阻断后MNNG诱发的非定标性突变频率(x 10-4)自16.1降至2.5(P<0.01)，而相应的自发突变频率分别为4.6和5.0(前者与相应的诱发突变频率相比P<0.05，后者P>0.05)。
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三、MNNG诱发细胞DNA复制保真度、错配碱基识别和校正功能
应用体外DNA复制系统证明在MNNG攻击过的细胞抽提液中进行复制的质粒pZ189DNA的产物中靶基因中的复制差错明显升高。在0.2 μmol/L MNNG处理后6、12、24h的细胞抽提液中进行复制所获得的pZ189转化宿主菌后的突变频率(x 10-4)分别为12.7、15.7和10.3，显著高于在对照细胞抽提液中的1.8(P<0.01，P<0.05)；但用合成的有碱基错配的寡核苷酸双链的凝胶阻滞试验和特定设计的酶切位点改变检查在不同浓度MNNG处理的细胞在不同时间都未发现碱基错配识别蛋白和碱基错配校正功能异常。
四、MNNG诱发细胞DNA聚合酶酶谱改变
用定量RT-PCR证明细胞经MNNG攻击后无校读功能的DNA聚合酶beta表达明显升高，DNA聚合酶的RT-PCR产物的光密度值与内参照b2-微球蛋白的光密度值的比在MNNG处理后的12、24、30h分别为0.975+0.092、1.013+0.081和0.964+0.116显著高于对照的0.458+0.086(P<0.05)，其它时间段则与对照无显著差异；DNA聚合酶alpha、delta、episilon和拓扑异构酶II alpha未发现表达改变。
, 百拇医药
五、MNNG诱发的非定标性突变形成中有细胞信号转导途径的激活
可激活应激信号转导的蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHM) 5 μg/mL 可促进0.2 μg/L MNNG 诱发的非定标性突变。 其突变频率(x 10-4)自6.38增高至12.27(P<0.05)；在磷饥饿后在含[32P]标记磷酸盐培养基中培养的细胞中用双向蛋白电泳发现在MNNG或CHM处理后都出现两个分子量分别为68和43kD左右的磷酸化蛋白斑；用抗磷酸酪氨酸抗体的Western印迹试验也证明MNNG和CHM处理细胞中有62和45kD蛋白质发生酪氨酸残基磷酸化程度增强：用抗Jun-N-末端激酶(JNK/SAPK)抗体的Western印迹试验证明JNK磷酸化增强，用固相酶活性测定证明JNK的活性于MNNG或CHM处理后升高了6.7和3.0倍。在MNNG处理细胞中cAMP含量、PKA活性和CREB丝氨酸残基磷酸化程度都有一过性升高；用共聚焦显微镜技术证明MNNG处理细胞出现表皮生长因子受体和肿瘤坏死因子受体的聚簇。这些结果提示MNNG处理可引起细胞信号通路的激活。
根据以上研究结果，对致癌物诱发的以基因非定标性突变为特征的遗传不稳定的发生机制，提出以下假设：化学致癌物→DNA损伤和非DNA损伤性应激→细胞信号转导途径激活→基因表达改变→DNA聚合酶酶谱和其它有关改变→DNA复制保真度降低→细胞遗传不稳定→基因非定标性突变
国家自然科学基金； 浙江省自然科学基金资助, 百拇医药