p62dok蛋白氨基酸和cDNA序列测定
作者：汪长华 董峰 董传仁 刘峰 董群
单位：汪长华 董峰 董传仁(湖北医科大学病理生理学教研室，湖北 武汉 430071)；刘峰 董群(Dept. of Pharm,UTHSCSA, USA)
关键词：
中国病理生理杂志0010271
目的：报道p62dok蛋白的纯化和氨基酸及cDNA序列的测定方法和结果，拟为研究p62dok在胰岛素信息传递中的作用提供必需的技术方法和试剂。方法：过渡表达人类胰岛素受体的中国仓鼠卵巢细胞(CHO/IR)细胞用含10%胎牛血清的Hams F-12培养12 h(37℃)后，加入胰岛素+Vanadate或Pervanadate处理。加入溶解液溶解经处理的CHO/IR细胞，15，000 r/min 10min，4℃离心，取上清液加入结合抗磷酸酪氨酸单克隆抗体PY20的琼脂糖，4℃孵育16 h，洗脱蛋白并浓缩，SDS-PAGE电泳分离p62dok，考马斯亮蓝染色定位p62dok，取含p62dok胶块消化、洗脱、HPLC分离肽片段，进行常规micropeptide序列分析。常规方法提取经处理的CHO/IR细胞的mRNA，根据氨基酸序列设计相应引物，RT-PCR(变性95℃ 30 s，退火58℃ 10 s，聚合72℃ 10 s，43个放大循环)得多个克隆，纯化cDNA，EcoR1酶切得到cDNA插入体，并克隆进pBEX载体以cDNA序列分析，常规方法测序。CHO/IR细胞中分离的p62dok蛋白由624个氨基酸组成，其相应cDNA长度为1872 bps，具有34个单切酶位点。结果：本实验分离的p62dok蛋白具有以下特点：①p62dok蛋白氨基端含有一个PH(pleckstrin homology)区，提示p62dok可能参与蛋白-蛋白或蛋白-脂质的相互作用；②p62dok蛋白含有10个PXXP富脯氨酸基元(motif)，提示p62dok可能与其它具有SH3区的信号分子相互作用；③p62dok蛋白氨基酸序列中含有15个酪氨酸残基，其中10个残基位于靠近C-末端的1/3分子中，p62dok蛋白酪氨酸残基的磷酸化可能使之与具有SH2区的其它信号分子相互作用。胰岛素抵抗是导致Ⅱ型糖尿病、高血压和心血管疾病的重要因素之一，其机制之一与胰岛素信息传递功能异常有关。p62dok是酪氨酸激酶下游蛋白，其蛋白结构表明p62dok可能与p21rasGTP酶激活蛋白(p21rasGAP)具有高亲和性，因而可能在胰岛素信息传递过程中具有重要的调控作用。
卫生部资助课题, 百拇医药
单位：汪长华 董峰 董传仁(湖北医科大学病理生理学教研室，湖北 武汉 430071)；刘峰 董群(Dept. of Pharm,UTHSCSA, USA)
关键词：
中国病理生理杂志0010271
目的：报道p62dok蛋白的纯化和氨基酸及cDNA序列的测定方法和结果，拟为研究p62dok在胰岛素信息传递中的作用提供必需的技术方法和试剂。方法：过渡表达人类胰岛素受体的中国仓鼠卵巢细胞(CHO/IR)细胞用含10%胎牛血清的Hams F-12培养12 h(37℃)后，加入胰岛素+Vanadate或Pervanadate处理。加入溶解液溶解经处理的CHO/IR细胞，15，000 r/min 10min，4℃离心，取上清液加入结合抗磷酸酪氨酸单克隆抗体PY20的琼脂糖，4℃孵育16 h，洗脱蛋白并浓缩，SDS-PAGE电泳分离p62dok，考马斯亮蓝染色定位p62dok，取含p62dok胶块消化、洗脱、HPLC分离肽片段，进行常规micropeptide序列分析。常规方法提取经处理的CHO/IR细胞的mRNA，根据氨基酸序列设计相应引物，RT-PCR(变性95℃ 30 s，退火58℃ 10 s，聚合72℃ 10 s，43个放大循环)得多个克隆，纯化cDNA，EcoR1酶切得到cDNA插入体，并克隆进pBEX载体以cDNA序列分析，常规方法测序。CHO/IR细胞中分离的p62dok蛋白由624个氨基酸组成，其相应cDNA长度为1872 bps，具有34个单切酶位点。结果：本实验分离的p62dok蛋白具有以下特点：①p62dok蛋白氨基端含有一个PH(pleckstrin homology)区，提示p62dok可能参与蛋白-蛋白或蛋白-脂质的相互作用；②p62dok蛋白含有10个PXXP富脯氨酸基元(motif)，提示p62dok可能与其它具有SH3区的信号分子相互作用；③p62dok蛋白氨基酸序列中含有15个酪氨酸残基，其中10个残基位于靠近C-末端的1/3分子中，p62dok蛋白酪氨酸残基的磷酸化可能使之与具有SH2区的其它信号分子相互作用。胰岛素抵抗是导致Ⅱ型糖尿病、高血压和心血管疾病的重要因素之一，其机制之一与胰岛素信息传递功能异常有关。p62dok是酪氨酸激酶下游蛋白，其蛋白结构表明p62dok可能与p21rasGTP酶激活蛋白(p21rasGAP)具有高亲和性，因而可能在胰岛素信息传递过程中具有重要的调控作用。
卫生部资助课题, 百拇医药