四倍体菘蓝毛状根的抗内毒素作用
四倍体菘蓝毛状根的抗内毒素作用
李博华 张汉明 王寅 丁如贤 许铁峰
摘 要 目的：从菘蓝的同源四倍体植物诱导出毛状根，并探讨用毛状根代替自然根作为药用的可能性。方法：利用发根农杆菌A4菌株感染四倍体菘蓝，采用细菌内毒素检查法考察诱导所得毛状根的抗内毒素作用。结果：A4菌株能诱导四倍体菘蓝产生毛状根，毛状根具有较强的抗内毒素作用。结论：发根农杆菌诱导四倍体植物产生的毛状根有可能成为传统中药材的一种代用品。
关键词：菘蓝，四倍体；毛状根；抗内毒素作用
板蓝根是十字花科植物菘蓝(Isatis indigotica Fort.)的干燥根，它具有清热解毒、凉血利咽的功效。现代医学对清热解毒作用的解释集中在以下两点：一是抗内毒素作用，二是抗病原微生物作用。有关板蓝根上述两个方面的研究都有报道。用秋水仙碱处理萌发的菘蓝种子或幼苗生长点，获得菘蓝四倍体植物，经过数代选育，获得了性状稳定、繁殖力正常、根与叶中活性均较大幅度提高的、生产性能良好的品系[1]。经国家科委批准，已列为国家科技成果重点推广项目。毛状根由于其生长迅速，生理、生化性状和遗传性状稳定，以及易于进行遗传操作等特点，近年来已发展成为继细胞培养后的又一实用培养系统[2～6]。我们在建立四倍体菘蓝毛状根培养系统的基础上，对四倍体菘蓝毛状根与二倍体菘蓝和四倍体菘蓝自然根的抗内毒素作用进行比较，以探讨用毛状根作为板蓝根代用品的可能性。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 细菌菌株 发根农杆菌A4菌株，感染前置于YEB固体培养基于27℃活化3次，然后转至YEB液体培养液中。于黑暗、25℃，100 r/min振荡培养。使用处于对数生长期的菌液转化植物。
1.2 植物材料 四倍体菘蓝种子由本室乔传卓教授提供。先将种子用清水冲洗干净后在75%乙醇中浸泡3 min，再用0.1%升汞消毒30 min，无菌水冲洗4次，置于MS固体培养基于培养室萌发。
1.3 主要试剂 鲎试剂(福州东方鲎试剂厂，批号971208) 0.1 ml/支，活性0.5 EU/ml；细菌内毒素工作标准品(福州东方鲎试剂厂，批号980105)10 EU/支，以0.9%生理盐水溶解备用；0.9% 生理盐水(上海市长海医院，批号980407)。
1.4 药材 板蓝根(2n)：产于河北安国，经本室乔传卓教授鉴定为菘蓝的干燥根；板蓝根(4n)：经数代选育获得的菘蓝四倍体植物的干燥根。
, 百拇医药
1.5 实验方法
1.5.1 毛状根的诱导与培养方法 将四倍体菘蓝的子叶切成0.5 cm×0.5 cm的小块，浸入已达对数生长期的发根农杆菌A4菌液进行共培养。10 min后取出共培养的叶片用无菌滤纸吸干菌液，置于MS固体培养基上培养2 d，然后取出，用无菌水冲洗4次，置于含头孢噻肟钠500 mg/L的MS固体培养基上，25℃、光照12 h/d下培养，每隔5 d转接1次。待毛状根长出后，分离毛状根，转移至含500 mg/L头孢噻肟钠的MS固体上除菌，转移4～5次直至无菌为止。然后将毛状根移至无激素的MS固体或液体培养基进行大量培养。
1.5.2 甘露碱检测方法 取毛状根100 mg置于1 ml Eppendorf管,加入0.1 mol/L HCl 100 μl,捣成匀浆，低温浸提2 h，1.5×104 r/min离心5 min,取上清液10 μl及甘露碱标准品分别点样于Whatman 3 mm滤纸上进行高压纸电泳。电泳条件和染色参照Morgan等[7]的方法进行。
, 百拇医药
1.5.3 药材提取液制备 将烘干后的毛状根或板蓝根粉碎，过60目筛。各称取10 g，加500 ml水煎煮30 min，过滤，重复3次，合并滤液，水浴浓缩至约100 ml，加乙醇至醇浓度为80%，冷藏24 h后过滤，回收乙醇至无醇味，以蒸馏水定容至10 ml，调节pH为7.0～7.5，压滤除菌及其他杂质颗粒，用安瓿分装，封口，煮沸消毒，备用。
1.5.4 抗内毒素实验[8] 分别取0.5 ml上述药材提取液于1，2号试管内，在2号试管加入0.5 ml 生理盐水，混匀，吸取0.5 ml于已加有0.5 ml 生理盐水的3号管中，依次按同法稀释，得到稀释倍数分别为1，2，4，8，16，32，64和128的系列溶液，并使各管的药液容量都为0.5 ml。分别加入预先配制的内毒素液0.5 ml(10 EU/ml)，摇匀，(55±2)℃水浴保温30 min。分别取0.2 ml加于0.1 ml鲎试剂中，溶解，封口，(37±1)℃水浴中温育60 min。
, 百拇医药
加0.2 ml细菌内毒素检查用水于0.1 ml鲎试剂中，作阴性对照；加0.1 ml细菌内毒素检查用水和0.1 ml 10 EU/ml内毒素液到0.1 ml鲎试剂中，作阳性对照。其余同药材组处理。
2 结 果
2.1 毛状根的诱导与培养 发根农杆菌A4感染四倍体菘蓝子叶10 d后在叶片切口处出根。多数根具典型毛状根特征，有许多白色根毛，分枝多且根尖向上生长。毛状根在无激素的MS固体或液体培养基中快速生长并不断分枝。
2.2 甘露碱检测 通过高压纸电泳，从菘蓝同源四倍体的毛状根中检测到了原植物中没有的甘露碱，表明发根农杆菌的RiT-DNA部分已在植物毛状根中整合和表达。
2.3 抗内毒素作用比较 从表1可以看出，四倍体菘蓝的毛状根具有明显的抗内毒素作用，其作用虽比四倍体板蓝根稍弱，但与二倍体板蓝根相似。
, http://www.100md.com
表1 四倍体菘蓝毛状根的抗内毒素作用
Tab 1 Antiendotoxic action of hairy roots of
autotetraploid Isatis indigotica Fort. (n=3)
Sample
Dilution multiple
1
2
4
8
16
32
, http://www.100md.com
64
128
Negative control
-
-
-
-
-
-
-
-
Positive control
+
, http://www.100md.com
+
+
+
+
+
+
+
Diploid (2n)
-
-
-
-
±
+
, 百拇医药
+
+
Tetraploid (4n)
-
-
-
-
-
±
+
+
Hairy roots
-
, 百拇医药
-
-
-
±
+
+
+
-： No gel formed； +： Gel formed； ± ： Gel formed, but deformed or flowed after overturn
3 讨 论
关于四倍体植物和菘蓝的农杆菌转化国内外均未见报道。本研究证明了发根农杆菌同样能诱导四倍体植物产生发状根。经诱导出的四倍体菘蓝毛状根具有典型二倍体毛状根的特征，根毛多、无向地性，且生长快速。
, http://www.100md.com
由于整合进植物核基因组中的RiT-DNA片段上有甘露碱合成的酶基因[9]，因此，发状根能合成原植物中所没有的甘露碱。我们从菘蓝同源四倍体的毛状根中检测到甘露碱，进一步证明RiT-DNA已在毛状根中整合和表达。
植物根部合成的次生代谢物(药物、色素、香料等)都可通过发状根培养的方法得到，如人参的发状根在无外源激素的条件下，人参皂甙(Rb和Rg)含量可达干质量的0.95%，远高于天然栽培根(0.4%)[10]，完全有代替人参作为药用的可能性。因为有近1/3的传统药材以根入药，该培养系统有可能为中药材的工业化生产提供一条新的途径。
鲎试剂与内毒素之间的凝集反应具有高度的特异性和灵敏性，通常，试样中微量内毒素(<1 EU/ml)的存在就可激活鲎试剂中凝固酶，使凝固蛋白原转变为凝固蛋白产生凝集反应[11]。板蓝根具有明显的抗内毒素作用，在加入其水溶液后鲎试剂与内毒素之间的凝集反应被抑制[12]。从本研究结果可看出，四倍体菘蓝的毛状根具有与正常根相类似的抗内毒素作用。为了进一步探讨毛状根作为根类药材代用品的可能性，我们将对四倍体菘蓝毛状根的抗病毒和抗菌等药理作用作深入研究。■
, http://www.100md.com
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870919)
作者简介：李博华(1973-)，男(汉族)，博士生，现在第二军医大学国际合作肿瘤研究所。
李博华(第二军医大学药学院落生药学教研室，上海200433)
张汉明(第二军医大学药学院落生药学教研室，上海200433)
王寅(第二军医大学药学院落生药学教研室，上海200433)
丁如贤(第二军医大学药学院落生药学教研室，上海200433)
许铁峰(第二军医大学药学院落生药学教研室，上海200433)
参考文献
, 百拇医药
[1] 乔传卓，吴美枢，戴富宝，等. 菘蓝多倍体育种的研究[J]. 植物学报, 1989, 31(9): 678-683.
[2] Parr AJ, Peerless ACJ, Hamill JD， et al. Alkaloid production by transformed root cultures of Lithospermum roseus[J]. Plant Cell Rep,1988,7(5):309-312.
[3] 胡之璧，郑志仁，李幸平，等. 膜夹黄芪毛状根培养系统的建立和外界因子对其生长的影响[J]. 植物学报，1998，40(5)：448-452.
[4] Toivonen L. Utilization of hairy root cultures for production of secondary metabolites[J]. Biotechnol Prog, 1993,9(1):12-20.
, 百拇医药
[5] Zhou Y, Hirotani M, Yoshikawa T, et al. Flavonoids and phenylethanoids from hairy root cultures of Scutellaria baicalensis[J]. Phytochemistry, 1997,44(1): 83-87.
[6] 常振战, 果德安，沈 昕，等. 掌叶大黄毛状根培养及培养物中蒽醌类成分分析[J]. 药学学报，1998，33(11)：869-872.
[7] Morgan AJ, Cox PN, Turner DA，et al. Transformation of tomato using an Ri plasmid vector[J]. Plant Sci, 1987,49(1):37-49.
[8] 乔传卓，张汉明，陈万生，等. 抗内毒素实验评价四倍体板蓝根[J]. 第二军医大学学报，1995，16(4)：395-396.
, 百拇医药
[9] Petit A, David C, Dahl GA, et al. Further extension of the opine concept: plasmid in Agrobacrerium tumefaciens cooperate for opine degradation[J]. Mol Gen Genet,1983,190(2 ):204-214.
[10] Yoshikawa T, Furuya T. Saponia production by cultures of Panax ginseng transformed with Agrobacterium rhizogenes[J]. Plant Cell Rep,1987,6(6):449-453.
[11] 刘云海. 板蓝根注射液抗内毒素作用的实验研究[J]. 中草药,1993,24(8):413-414.
[12] 刘云海. 板蓝根抗内毒素作用研究[J]. 中国药科大学学报,1995,26(5):297-299., 百拇医药
李博华 张汉明 王寅 丁如贤 许铁峰
摘 要 目的：从菘蓝的同源四倍体植物诱导出毛状根，并探讨用毛状根代替自然根作为药用的可能性。方法：利用发根农杆菌A4菌株感染四倍体菘蓝，采用细菌内毒素检查法考察诱导所得毛状根的抗内毒素作用。结果：A4菌株能诱导四倍体菘蓝产生毛状根，毛状根具有较强的抗内毒素作用。结论：发根农杆菌诱导四倍体植物产生的毛状根有可能成为传统中药材的一种代用品。
关键词：菘蓝，四倍体；毛状根；抗内毒素作用
板蓝根是十字花科植物菘蓝(Isatis indigotica Fort.)的干燥根，它具有清热解毒、凉血利咽的功效。现代医学对清热解毒作用的解释集中在以下两点：一是抗内毒素作用，二是抗病原微生物作用。有关板蓝根上述两个方面的研究都有报道。用秋水仙碱处理萌发的菘蓝种子或幼苗生长点，获得菘蓝四倍体植物，经过数代选育，获得了性状稳定、繁殖力正常、根与叶中活性均较大幅度提高的、生产性能良好的品系[1]。经国家科委批准，已列为国家科技成果重点推广项目。毛状根由于其生长迅速，生理、生化性状和遗传性状稳定，以及易于进行遗传操作等特点，近年来已发展成为继细胞培养后的又一实用培养系统[2～6]。我们在建立四倍体菘蓝毛状根培养系统的基础上，对四倍体菘蓝毛状根与二倍体菘蓝和四倍体菘蓝自然根的抗内毒素作用进行比较，以探讨用毛状根作为板蓝根代用品的可能性。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 细菌菌株 发根农杆菌A4菌株，感染前置于YEB固体培养基于27℃活化3次，然后转至YEB液体培养液中。于黑暗、25℃，100 r/min振荡培养。使用处于对数生长期的菌液转化植物。
1.2 植物材料 四倍体菘蓝种子由本室乔传卓教授提供。先将种子用清水冲洗干净后在75%乙醇中浸泡3 min，再用0.1%升汞消毒30 min，无菌水冲洗4次，置于MS固体培养基于培养室萌发。
1.3 主要试剂 鲎试剂(福州东方鲎试剂厂，批号971208) 0.1 ml/支，活性0.5 EU/ml；细菌内毒素工作标准品(福州东方鲎试剂厂，批号980105)10 EU/支，以0.9%生理盐水溶解备用；0.9% 生理盐水(上海市长海医院，批号980407)。
1.4 药材 板蓝根(2n)：产于河北安国，经本室乔传卓教授鉴定为菘蓝的干燥根；板蓝根(4n)：经数代选育获得的菘蓝四倍体植物的干燥根。
, 百拇医药
1.5 实验方法
1.5.1 毛状根的诱导与培养方法 将四倍体菘蓝的子叶切成0.5 cm×0.5 cm的小块，浸入已达对数生长期的发根农杆菌A4菌液进行共培养。10 min后取出共培养的叶片用无菌滤纸吸干菌液，置于MS固体培养基上培养2 d，然后取出，用无菌水冲洗4次，置于含头孢噻肟钠500 mg/L的MS固体培养基上，25℃、光照12 h/d下培养，每隔5 d转接1次。待毛状根长出后，分离毛状根，转移至含500 mg/L头孢噻肟钠的MS固体上除菌，转移4～5次直至无菌为止。然后将毛状根移至无激素的MS固体或液体培养基进行大量培养。
1.5.2 甘露碱检测方法 取毛状根100 mg置于1 ml Eppendorf管,加入0.1 mol/L HCl 100 μl,捣成匀浆，低温浸提2 h，1.5×104 r/min离心5 min,取上清液10 μl及甘露碱标准品分别点样于Whatman 3 mm滤纸上进行高压纸电泳。电泳条件和染色参照Morgan等[7]的方法进行。
, 百拇医药
1.5.3 药材提取液制备 将烘干后的毛状根或板蓝根粉碎，过60目筛。各称取10 g，加500 ml水煎煮30 min，过滤，重复3次，合并滤液，水浴浓缩至约100 ml，加乙醇至醇浓度为80%，冷藏24 h后过滤，回收乙醇至无醇味，以蒸馏水定容至10 ml，调节pH为7.0～7.5，压滤除菌及其他杂质颗粒，用安瓿分装，封口，煮沸消毒，备用。
1.5.4 抗内毒素实验[8] 分别取0.5 ml上述药材提取液于1，2号试管内，在2号试管加入0.5 ml 生理盐水，混匀，吸取0.5 ml于已加有0.5 ml 生理盐水的3号管中，依次按同法稀释，得到稀释倍数分别为1，2，4，8，16，32，64和128的系列溶液，并使各管的药液容量都为0.5 ml。分别加入预先配制的内毒素液0.5 ml(10 EU/ml)，摇匀，(55±2)℃水浴保温30 min。分别取0.2 ml加于0.1 ml鲎试剂中，溶解，封口，(37±1)℃水浴中温育60 min。
, 百拇医药
加0.2 ml细菌内毒素检查用水于0.1 ml鲎试剂中，作阴性对照；加0.1 ml细菌内毒素检查用水和0.1 ml 10 EU/ml内毒素液到0.1 ml鲎试剂中，作阳性对照。其余同药材组处理。
2 结 果
2.1 毛状根的诱导与培养 发根农杆菌A4感染四倍体菘蓝子叶10 d后在叶片切口处出根。多数根具典型毛状根特征，有许多白色根毛，分枝多且根尖向上生长。毛状根在无激素的MS固体或液体培养基中快速生长并不断分枝。
2.2 甘露碱检测 通过高压纸电泳，从菘蓝同源四倍体的毛状根中检测到了原植物中没有的甘露碱，表明发根农杆菌的RiT-DNA部分已在植物毛状根中整合和表达。
2.3 抗内毒素作用比较 从表1可以看出，四倍体菘蓝的毛状根具有明显的抗内毒素作用，其作用虽比四倍体板蓝根稍弱，但与二倍体板蓝根相似。
, http://www.100md.com
表1 四倍体菘蓝毛状根的抗内毒素作用
Tab 1 Antiendotoxic action of hairy roots of
autotetraploid Isatis indigotica Fort. (n=3)
Sample
Dilution multiple
1
2
4
8
16
32
, http://www.100md.com
64
128
Negative control
-
-
-
-
-
-
-
-
Positive control
+
, http://www.100md.com
+
+
+
+
+
+
+
Diploid (2n)
-
-
-
-
±
+
, 百拇医药
+
+
Tetraploid (4n)
-
-
-
-
-
±
+
+
Hairy roots
-
, 百拇医药
-
-
-
±
+
+
+
-： No gel formed； +： Gel formed； ± ： Gel formed, but deformed or flowed after overturn
3 讨 论
关于四倍体植物和菘蓝的农杆菌转化国内外均未见报道。本研究证明了发根农杆菌同样能诱导四倍体植物产生发状根。经诱导出的四倍体菘蓝毛状根具有典型二倍体毛状根的特征，根毛多、无向地性，且生长快速。
, http://www.100md.com
由于整合进植物核基因组中的RiT-DNA片段上有甘露碱合成的酶基因[9]，因此，发状根能合成原植物中所没有的甘露碱。我们从菘蓝同源四倍体的毛状根中检测到甘露碱，进一步证明RiT-DNA已在毛状根中整合和表达。
植物根部合成的次生代谢物(药物、色素、香料等)都可通过发状根培养的方法得到，如人参的发状根在无外源激素的条件下，人参皂甙(Rb和Rg)含量可达干质量的0.95%，远高于天然栽培根(0.4%)[10]，完全有代替人参作为药用的可能性。因为有近1/3的传统药材以根入药，该培养系统有可能为中药材的工业化生产提供一条新的途径。
鲎试剂与内毒素之间的凝集反应具有高度的特异性和灵敏性，通常，试样中微量内毒素(<1 EU/ml)的存在就可激活鲎试剂中凝固酶，使凝固蛋白原转变为凝固蛋白产生凝集反应[11]。板蓝根具有明显的抗内毒素作用，在加入其水溶液后鲎试剂与内毒素之间的凝集反应被抑制[12]。从本研究结果可看出，四倍体菘蓝的毛状根具有与正常根相类似的抗内毒素作用。为了进一步探讨毛状根作为根类药材代用品的可能性，我们将对四倍体菘蓝毛状根的抗病毒和抗菌等药理作用作深入研究。■
, http://www.100md.com
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870919)
作者简介：李博华(1973-)，男(汉族)，博士生，现在第二军医大学国际合作肿瘤研究所。
李博华(第二军医大学药学院落生药学教研室，上海200433)
张汉明(第二军医大学药学院落生药学教研室，上海200433)
王寅(第二军医大学药学院落生药学教研室，上海200433)
丁如贤(第二军医大学药学院落生药学教研室，上海200433)
许铁峰(第二军医大学药学院落生药学教研室，上海200433)
参考文献
, 百拇医药
[1] 乔传卓，吴美枢，戴富宝，等. 菘蓝多倍体育种的研究[J]. 植物学报, 1989, 31(9): 678-683.
[2] Parr AJ, Peerless ACJ, Hamill JD， et al. Alkaloid production by transformed root cultures of Lithospermum roseus[J]. Plant Cell Rep,1988,7(5):309-312.
[3] 胡之璧，郑志仁，李幸平，等. 膜夹黄芪毛状根培养系统的建立和外界因子对其生长的影响[J]. 植物学报，1998，40(5)：448-452.
[4] Toivonen L. Utilization of hairy root cultures for production of secondary metabolites[J]. Biotechnol Prog, 1993,9(1):12-20.
, 百拇医药
[5] Zhou Y, Hirotani M, Yoshikawa T, et al. Flavonoids and phenylethanoids from hairy root cultures of Scutellaria baicalensis[J]. Phytochemistry, 1997,44(1): 83-87.
[6] 常振战, 果德安，沈 昕，等. 掌叶大黄毛状根培养及培养物中蒽醌类成分分析[J]. 药学学报，1998，33(11)：869-872.
[7] Morgan AJ, Cox PN, Turner DA，et al. Transformation of tomato using an Ri plasmid vector[J]. Plant Sci, 1987,49(1):37-49.
[8] 乔传卓，张汉明，陈万生，等. 抗内毒素实验评价四倍体板蓝根[J]. 第二军医大学学报，1995，16(4)：395-396.
, 百拇医药
[9] Petit A, David C, Dahl GA, et al. Further extension of the opine concept: plasmid in Agrobacrerium tumefaciens cooperate for opine degradation[J]. Mol Gen Genet,1983,190(2 ):204-214.
[10] Yoshikawa T, Furuya T. Saponia production by cultures of Panax ginseng transformed with Agrobacterium rhizogenes[J]. Plant Cell Rep,1987,6(6):449-453.
[11] 刘云海. 板蓝根注射液抗内毒素作用的实验研究[J]. 中草药,1993,24(8):413-414.
[12] 刘云海. 板蓝根抗内毒素作用研究[J]. 中国药科大学学报,1995,26(5):297-299., 百拇医药