昆虫杆状病毒表达系统中人骨形成蛋白3的表达及鉴定
昆虫杆状病毒表达系统中人骨形成蛋白3的表达及鉴定
卢兹凡 陈苏民 陈南春 高磊 路凡 蒲勤
摘 要: 目的 探索人骨形成蛋白3(hBMP3)在昆虫杆状病毒系统中的表达规律. 方法 将hBMP3全长cDNA克隆入转移载体BacPK8中，酶切鉴定后, 将此载体与病毒DNA经脂质体包裹转染昆虫细胞，重组病毒经蓝白筛选后，提取其DNA进行PCR反应，鉴定目的基因. 收集重组病毒感染5 d的细胞进行免疫荧光及电子显微镜观察. 结果 克隆了目的基因的重组载体经内切酶消化后，琼脂糖电泳示有相应大小的目的基因片段切下. PCR电泳结果见有目的基因片段的扩增. 免疫荧光检测见阳性颗粒分布在昆虫细胞的胞质及胞膜，电镜下见重组病毒无多角体颗粒，与野生型杆状病毒完全不同. 结论 初步证实hBMP3在此套系统中获得了表达
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关键词：杆状病毒；骨形成蛋白；蛋白表达
0 引言
人骨形成蛋白(human bone morphogenetic protein, hBMP)单独作用就可以在动物体内异位诱导成骨,在临床治疗骨缺损方面显示出极大的应用潜力. 至今大约有13种以上的hBMP分子被发现并克隆. 新的研究表明hBMP不仅是一类诱导骨生成的分化因子，而且在人体多个系统的胚胎发育、细胞分化、增殖甚至凋亡中扮演重要角色，具有更广阔的应用前景. 昆虫杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的真核表达系统, 利用杆状病毒结构基因中多角体蛋白的强启动子构建的表达载体, 可以使很多真核目的基因得到有效甚至高水平表达. 由于hBMP3的活性形式是二聚体，中间有7个保守半胱氨酸，研究其在此套系统中能否获得表达具有一定的实用价值.
1 材料和方法
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1.1 材料 含有hBMP3全长cDNA的质粒由本室用PCR方法从人胚胎肾cDNA库中扩增、克隆获得. MC3T3小鼠成纤维细胞由本室保存. 昆虫杆状病毒表达系统Kit购于Clontech公司(包括Sf9 cell, 线性化病毒DNA，转染试剂等). 昆虫细胞培养基(Grace's Medium, Yeastolate, Latalbumin)购于Gibco公司. 小牛或胎牛血清购自杭州四季青生物材料研究所.限制性内切酶，DNA marker等购自华美公司. FITC标记的抗鼠IgG抗体购自Sigma公司.
1.2 方法 质粒提取、酶切、连接、转化及克隆鉴定参照文献[1]. 采用昆虫细胞培养基(100 mL.L-1 FBS)，27℃饱和湿度下培养昆虫细胞，无需CO2. 用脂质体包裹含有目的基因的重组转移载体和线状病毒DNA，转染昆虫细胞，收集转染上清，取部分上清做多轮空斑实验，筛选并纯化重组病毒，其余上清无菌保存. 将挑取的多个重组病毒上清进一步鉴定. 重组病毒的鉴定、PCR、免疫荧光及电镜观察参照文献[2].
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2 结果
2.1 hBMP3全长cDNA在转移载体BacPK8中的克隆 将含有hBMP3 cDNA的质粒先经NcoⅠ酶切， Klenow补平后，再用XbaⅠ酶切，电泳回收全长cDNA 1.48 kb的片段. 转移载体先经BamHⅠ酶切，Klenow补平后，再经XbaⅠ酶切，回收线状质粒，并与目的基因片段在16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α (Fig 1). 分别挑取6个克隆，小量法提质粒酶切鉴定. 由于hBMP3 cDNA中位于600 bp左右处有一EcoRⅤ位点，所以经EcoRⅤ+BglⅡ双酶切应切下两个大小各为600 bp和800 bp左右的片段(Fig 2),证明已得到hBMP3 cDNA的重组转移载体B3K8.
图 1 含有hBMP3基因的重组转移载体B3K8的构建
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Fig 1 Construction of B3K8 recombinant transfer vector with hBMP3 gene
图 2 酶切鉴定B3K8重组转移载体
Fig 2 Identification of B3K8 recombinant transfer vector
by digestion with restriction enzyme
1:Positive; M:Standard MW of nucleic acid.
, 百拇医药 2.2 PCR方法鉴定重组病毒DNA 取适量重组病毒上清,侵染细胞，感染后5 d收集细胞. 经酚-氯仿提取病毒基因组DNA. 取适量DNA作模板，加入hBMP2成熟肽引物. 经PCR反应扩增，12 g.L-1琼脂糖电泳观察有无目的基因的扩增片段，结果显示5个克隆中有4个出现目的片段. 初步证实它们为重组克隆(Fig 3).
图 3 PCR鉴定重组病毒DNA内的外源基因 hBMP3
Fig 3 Identification of heterologous gene hBMP3
by PCR analysis of recombinant virus DNA
, 百拇医药
1:Standard Mr of nucleic acid; 2: PCR of recombinant virus DNA.
2.3 免疫荧光检测重组病毒 分别在病毒感染细胞的3～5 d收集细胞，用丙酮固定在玻片上，加鼠抗hBMP3单抗细胞培养上清进行免疫荧光反应，在荧光显微镜下观察细胞的荧光染色：3 d时颗粒荧光主要分布在胞核周围的胞质中，5 d后荧光颗粒明显向细胞膜移动，且胞膜上有分泌突起形成. 而野生型和对照lacZ的未重组病毒在细胞中的荧光强度弱并且呈均一非特异性分布. 说明目的蛋白在昆虫细胞中得到表达，随感染时间延长，表达蛋白逐渐从胞质转移到胞膜，最后分泌至胞外(Fig 4).
图 4 B3病毒感染细胞5 d的免疫荧光检测
, 百拇医药
Fig 4 Immuofluorescence assay of insect cells transfected
by B3 recombinant virus on the 5th day ×40
2.4 电镜观察病毒感染的昆虫细胞 在病毒感染细胞5 d 收集细胞，按常规电镜标本的制作方法进行包埋、切片，在透射电镜下观察细胞内病毒的形成情况. 可见野生型病毒在细胞内形成多角体病毒颗粒，多角体呈规则的多边形，几个病毒包裹在一个多角体中，病毒颗粒呈杆状. hBMP3的重组病毒未形成多角体质，它们形成的杆状病毒颗粒广泛分布在胞核及胞质内，部分病毒冲破胞膜向胞外移动，有些已使细胞破裂，病毒扩散到细胞外区域(Fig 5,6).
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图 5 野生型病毒的电镜观察
Fig 5 Electronmicroscopic observation of wild virus ×10 000
图 6 重组病毒的电镜观察
Fig 6 Electronmicroscopic observation of recombinant virus ×20 000
3 讨论
BMP不但参与成骨过程,而且与胚胎各个系统的发育都有关, 其潜在的应用前景引起许多研究者的高度重视[3]. 利用基因工程手段生产此类活性蛋白在国内外早已研究多年，但至今尚未进入市场[4]. 国外研究大都集中在BMP2，4，7，有关BMP3的研究报告甚少. BMP3在BMP整个家族中与其他成员同源性不高，单独成为一个亚类，崔有宏等[5]利用大肠杆菌表达系统表达的BMP3也具有一定的诱骨活性，并推测它可能参与骨髓的发生. 但BMP3分子的活性形式是二聚体，中间有7个保守半胱氨酸，大肠杆菌表达产物体外复性虽能获得一定量的有正确空间构型的活性蛋白，但随机性大，很难获得理想结果.
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杆状病毒表达系统是近年应用广泛的真核表达系统[6]，它具有真核表达系统的翻译后加工功能，如二硫键的形成，糖基化，磷酸化等，还具有表达水平高，能同时表达多个外源基因的特点,表达的蛋白产物具有天然蛋白特性，对于hBMP3分泌类蛋白可能识别其分泌信号进行加工分泌. 由于病毒多角体蛋白占病毒总蛋的比例非常高，至今已经有很多外源基因在此蛋白的强大启动子作用下获得高效表达. 为减少影响表达的其他因素，我们在克隆hBMP3基因时,自身信号肽序列5′端前没有保留非编码区序列. 杆状病毒基因组庞大，外源基因不能通过酶切连接的方式直接插入，而必须通过转移载体的介导，利用同源重组将外源基因整合到病毒染色体上. 但重组机率低，为此研究者们建立了一系列病毒载体，使重组机率大大提高[2,7]. 如何进行重组病毒的筛选是最关键的步骤. LacZ的蓝白筛选简便易行,它的原理是将编码半乳糖苷酶的基因(lacZ)重组到野生病毒的基因组中，当外源基因不能与病毒DNA发生重组时，加入显色剂x-gal会生成蓝色物质. 相反当外源基因重组到病毒基因组内，lacZ经重组消失，上述反应呈白色，说明病毒发生了重组. 我们发现经过蓝白筛选后的重组病毒，尚存在假阳性的可能，为了进一步确证外源基因的重组，我们运用PCR方法检测重组病毒基因组，获得了目的基因片段. 电镜观察病毒感染后的昆虫细胞，能够清晰地见到重组病毒的形状和分布完全不同于野生型病毒，不含有多角体病毒颗粒，在形态学上补充说明外源基因确实，置换掉了野生型多角体基因. 利用免疫荧光观察见外源蛋白分布在昆虫细胞的胞质和胞膜，进一步证实hBMP3基因经过重组并在昆虫细胞中获得表达. 根据其免疫荧光的阳性分布情况初步认为蛋白产物部分经过胞膜分泌至胞外，对下一步产物的纯化带来方便.
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作者简介:卢兹凡(1966-),女(汉族)，陕西省西安市人. 讲师, 生物化学与分子生物学硕士和博士, 发表论文7篇. Tel.(029)3374516Sf9
卢兹凡(第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710033 )
陈苏民(第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710033 )
陈南春(第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710033 )
高磊(第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710033 )
路凡(第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710033 )
蒲勤(第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710033 )
, 百拇医药
参考文献:
[1] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning A laboratory manual 2nd edition[J]. Cold Sring Harbor Laboratory Press, 1989:265-387.
[2] Luckow VA and Summers MD. Trends in the development of baculovirus expression vectors[J]. Biotechnology, 1992; 6(1): 47-55.
[3] Hogan BLM. Bone morphogenetic proteins: Multifunctional regulators of vertebrate development[J]. Genes Dev, 1996; 10(6): 1580-1594.
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[4] Joseph Alper. Boning up: Newly isolated proteins heal bad breaks[J]. Science, 1994; 263(1): 324-325.
[5] 崔有宏，陈苏民，刘新平et al. 重组人骨形成蛋白3 C端肽在大肠杆菌中的高表达及其诱骨活性[J]. 生物化学杂志, 1997；13(5)：513-515.
[6] Maeda S. Expression of foreign genes in insects using baculovirus vector[J]. Annu Rev Entomol, 1989; 34(1): 351-372.
[7] 蔡文琴， 王伯沄. 实用免疫组织化学与核酸分子杂交技术[M]. 成都：四川科学技术出版社，1994:52-68., http://www.100md.com
卢兹凡 陈苏民 陈南春 高磊 路凡 蒲勤
摘 要: 目的 探索人骨形成蛋白3(hBMP3)在昆虫杆状病毒系统中的表达规律. 方法 将hBMP3全长cDNA克隆入转移载体BacPK8中，酶切鉴定后, 将此载体与病毒DNA经脂质体包裹转染昆虫细胞，重组病毒经蓝白筛选后，提取其DNA进行PCR反应，鉴定目的基因. 收集重组病毒感染5 d的细胞进行免疫荧光及电子显微镜观察. 结果 克隆了目的基因的重组载体经内切酶消化后，琼脂糖电泳示有相应大小的目的基因片段切下. PCR电泳结果见有目的基因片段的扩增. 免疫荧光检测见阳性颗粒分布在昆虫细胞的胞质及胞膜，电镜下见重组病毒无多角体颗粒，与野生型杆状病毒完全不同. 结论 初步证实hBMP3在此套系统中获得了表达
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关键词：杆状病毒；骨形成蛋白；蛋白表达
0 引言
人骨形成蛋白(human bone morphogenetic protein, hBMP)单独作用就可以在动物体内异位诱导成骨,在临床治疗骨缺损方面显示出极大的应用潜力. 至今大约有13种以上的hBMP分子被发现并克隆. 新的研究表明hBMP不仅是一类诱导骨生成的分化因子，而且在人体多个系统的胚胎发育、细胞分化、增殖甚至凋亡中扮演重要角色，具有更广阔的应用前景. 昆虫杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的真核表达系统, 利用杆状病毒结构基因中多角体蛋白的强启动子构建的表达载体, 可以使很多真核目的基因得到有效甚至高水平表达. 由于hBMP3的活性形式是二聚体，中间有7个保守半胱氨酸，研究其在此套系统中能否获得表达具有一定的实用价值.
1 材料和方法
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1.1 材料 含有hBMP3全长cDNA的质粒由本室用PCR方法从人胚胎肾cDNA库中扩增、克隆获得. MC3T3小鼠成纤维细胞由本室保存. 昆虫杆状病毒表达系统Kit购于Clontech公司(包括Sf9 cell, 线性化病毒DNA，转染试剂等). 昆虫细胞培养基(Grace's Medium, Yeastolate, Latalbumin)购于Gibco公司. 小牛或胎牛血清购自杭州四季青生物材料研究所.限制性内切酶，DNA marker等购自华美公司. FITC标记的抗鼠IgG抗体购自Sigma公司.
1.2 方法 质粒提取、酶切、连接、转化及克隆鉴定参照文献[1]. 采用昆虫细胞培养基(100 mL.L-1 FBS)，27℃饱和湿度下培养昆虫细胞，无需CO2. 用脂质体包裹含有目的基因的重组转移载体和线状病毒DNA，转染昆虫细胞，收集转染上清，取部分上清做多轮空斑实验，筛选并纯化重组病毒，其余上清无菌保存. 将挑取的多个重组病毒上清进一步鉴定. 重组病毒的鉴定、PCR、免疫荧光及电镜观察参照文献[2].
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2 结果
2.1 hBMP3全长cDNA在转移载体BacPK8中的克隆 将含有hBMP3 cDNA的质粒先经NcoⅠ酶切， Klenow补平后，再用XbaⅠ酶切，电泳回收全长cDNA 1.48 kb的片段. 转移载体先经BamHⅠ酶切，Klenow补平后，再经XbaⅠ酶切，回收线状质粒，并与目的基因片段在16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α (Fig 1). 分别挑取6个克隆，小量法提质粒酶切鉴定. 由于hBMP3 cDNA中位于600 bp左右处有一EcoRⅤ位点，所以经EcoRⅤ+BglⅡ双酶切应切下两个大小各为600 bp和800 bp左右的片段(Fig 2),证明已得到hBMP3 cDNA的重组转移载体B3K8.
图 1 含有hBMP3基因的重组转移载体B3K8的构建
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Fig 1 Construction of B3K8 recombinant transfer vector with hBMP3 gene
图 2 酶切鉴定B3K8重组转移载体
Fig 2 Identification of B3K8 recombinant transfer vector
by digestion with restriction enzyme
1:Positive; M:Standard MW of nucleic acid.
, 百拇医药 2.2 PCR方法鉴定重组病毒DNA 取适量重组病毒上清,侵染细胞，感染后5 d收集细胞. 经酚-氯仿提取病毒基因组DNA. 取适量DNA作模板，加入hBMP2成熟肽引物. 经PCR反应扩增，12 g.L-1琼脂糖电泳观察有无目的基因的扩增片段，结果显示5个克隆中有4个出现目的片段. 初步证实它们为重组克隆(Fig 3).
图 3 PCR鉴定重组病毒DNA内的外源基因 hBMP3
Fig 3 Identification of heterologous gene hBMP3
by PCR analysis of recombinant virus DNA
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1:Standard Mr of nucleic acid; 2: PCR of recombinant virus DNA.
2.3 免疫荧光检测重组病毒 分别在病毒感染细胞的3～5 d收集细胞，用丙酮固定在玻片上，加鼠抗hBMP3单抗细胞培养上清进行免疫荧光反应，在荧光显微镜下观察细胞的荧光染色：3 d时颗粒荧光主要分布在胞核周围的胞质中，5 d后荧光颗粒明显向细胞膜移动，且胞膜上有分泌突起形成. 而野生型和对照lacZ的未重组病毒在细胞中的荧光强度弱并且呈均一非特异性分布. 说明目的蛋白在昆虫细胞中得到表达，随感染时间延长，表达蛋白逐渐从胞质转移到胞膜，最后分泌至胞外(Fig 4).
图 4 B3病毒感染细胞5 d的免疫荧光检测
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Fig 4 Immuofluorescence assay of insect cells transfected
by B3 recombinant virus on the 5th day ×40
2.4 电镜观察病毒感染的昆虫细胞 在病毒感染细胞5 d 收集细胞，按常规电镜标本的制作方法进行包埋、切片，在透射电镜下观察细胞内病毒的形成情况. 可见野生型病毒在细胞内形成多角体病毒颗粒，多角体呈规则的多边形，几个病毒包裹在一个多角体中，病毒颗粒呈杆状. hBMP3的重组病毒未形成多角体质，它们形成的杆状病毒颗粒广泛分布在胞核及胞质内，部分病毒冲破胞膜向胞外移动，有些已使细胞破裂，病毒扩散到细胞外区域(Fig 5,6).
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图 5 野生型病毒的电镜观察
Fig 5 Electronmicroscopic observation of wild virus ×10 000
图 6 重组病毒的电镜观察
Fig 6 Electronmicroscopic observation of recombinant virus ×20 000
3 讨论
BMP不但参与成骨过程,而且与胚胎各个系统的发育都有关, 其潜在的应用前景引起许多研究者的高度重视[3]. 利用基因工程手段生产此类活性蛋白在国内外早已研究多年，但至今尚未进入市场[4]. 国外研究大都集中在BMP2，4，7，有关BMP3的研究报告甚少. BMP3在BMP整个家族中与其他成员同源性不高，单独成为一个亚类，崔有宏等[5]利用大肠杆菌表达系统表达的BMP3也具有一定的诱骨活性，并推测它可能参与骨髓的发生. 但BMP3分子的活性形式是二聚体，中间有7个保守半胱氨酸，大肠杆菌表达产物体外复性虽能获得一定量的有正确空间构型的活性蛋白，但随机性大，很难获得理想结果.
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杆状病毒表达系统是近年应用广泛的真核表达系统[6]，它具有真核表达系统的翻译后加工功能，如二硫键的形成，糖基化，磷酸化等，还具有表达水平高，能同时表达多个外源基因的特点,表达的蛋白产物具有天然蛋白特性，对于hBMP3分泌类蛋白可能识别其分泌信号进行加工分泌. 由于病毒多角体蛋白占病毒总蛋的比例非常高，至今已经有很多外源基因在此蛋白的强大启动子作用下获得高效表达. 为减少影响表达的其他因素，我们在克隆hBMP3基因时,自身信号肽序列5′端前没有保留非编码区序列. 杆状病毒基因组庞大，外源基因不能通过酶切连接的方式直接插入，而必须通过转移载体的介导，利用同源重组将外源基因整合到病毒染色体上. 但重组机率低，为此研究者们建立了一系列病毒载体，使重组机率大大提高[2,7]. 如何进行重组病毒的筛选是最关键的步骤. LacZ的蓝白筛选简便易行,它的原理是将编码半乳糖苷酶的基因(lacZ)重组到野生病毒的基因组中，当外源基因不能与病毒DNA发生重组时，加入显色剂x-gal会生成蓝色物质. 相反当外源基因重组到病毒基因组内，lacZ经重组消失，上述反应呈白色，说明病毒发生了重组. 我们发现经过蓝白筛选后的重组病毒，尚存在假阳性的可能，为了进一步确证外源基因的重组，我们运用PCR方法检测重组病毒基因组，获得了目的基因片段. 电镜观察病毒感染后的昆虫细胞，能够清晰地见到重组病毒的形状和分布完全不同于野生型病毒，不含有多角体病毒颗粒，在形态学上补充说明外源基因确实，置换掉了野生型多角体基因. 利用免疫荧光观察见外源蛋白分布在昆虫细胞的胞质和胞膜，进一步证实hBMP3基因经过重组并在昆虫细胞中获得表达. 根据其免疫荧光的阳性分布情况初步认为蛋白产物部分经过胞膜分泌至胞外，对下一步产物的纯化带来方便.
, 百拇医药
作者简介:卢兹凡(1966-),女(汉族)，陕西省西安市人. 讲师, 生物化学与分子生物学硕士和博士, 发表论文7篇. Tel.(029)3374516Sf9
卢兹凡(第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710033 )
陈苏民(第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710033 )
陈南春(第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710033 )
高磊(第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710033 )
路凡(第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710033 )
蒲勤(第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710033 )
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参考文献:
[1] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning A laboratory manual 2nd edition[J]. Cold Sring Harbor Laboratory Press, 1989:265-387.
[2] Luckow VA and Summers MD. Trends in the development of baculovirus expression vectors[J]. Biotechnology, 1992; 6(1): 47-55.
[3] Hogan BLM. Bone morphogenetic proteins: Multifunctional regulators of vertebrate development[J]. Genes Dev, 1996; 10(6): 1580-1594.
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[4] Joseph Alper. Boning up: Newly isolated proteins heal bad breaks[J]. Science, 1994; 263(1): 324-325.
[5] 崔有宏，陈苏民，刘新平et al. 重组人骨形成蛋白3 C端肽在大肠杆菌中的高表达及其诱骨活性[J]. 生物化学杂志, 1997；13(5)：513-515.
[6] Maeda S. Expression of foreign genes in insects using baculovirus vector[J]. Annu Rev Entomol, 1989; 34(1): 351-372.
[7] 蔡文琴， 王伯沄. 实用免疫组织化学与核酸分子杂交技术[M]. 成都：四川科学技术出版社，1994:52-68., http://www.100md.com