低密度脂蛋白对肾小球系膜细胞、TGF-β和FN mRNA
低密度脂蛋白对肾小球系膜细胞、TGF-β和FN mRNA
表达的影响
王丽 梅长林 田毅华 王永午
摘 要 目的：观察低密度脂蛋白(LDL)对体外培养的大鼠肾小球系膜细胞(MsC)生长及转化生长因子β(TGF-β)和纤维连接蛋白(FN)基因表达的影响。方法：体外培养的MsC培养液中加入LDL共同孵育，采用3H-TdR渗入法检测MsC增殖情况；应用Northern blot检测TGF-β mRNA和FN mRNA的表达；应用斑点杂交法检测抗TGF-β抗体对FN mRNA表达的影响。结果：(1) LDL刺激MsC在小剂量以剂量依赖(50～150 μg/ml)和时间依赖(24～72 h)促进增殖(P<0.05)，大剂量(200 μg/ml)抑制增殖(P<0.05)。(2) Northern blot显示LDL刺激MsC增殖，其TGF-β和FN mRNA表达以剂量和时间依赖方式增强。TGF-β mRNA表达较FN mRNA提前24 h。(3) Dot blot 显示，加入抗TGF-β抗体后，FN mRNA的表达较未加前明显减弱。结论：LDL不仅可刺激肾小球MsC的增殖，并且增加TGF-β和FN mRNA的表达。
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关键词：脂蛋白类，LDL；肾小球膜；转化生长因子β；纤维连接蛋白
肾小球系膜细胞(MsC)增生是各种类型肾小球疾病常见而又突出的病理学特征，是引起肾小球细胞外基质(ECM)增多，并进一步导致肾小球硬化的重要原因。研究资料表明，脂质可介导肾小球损伤，其所引起的肾小球增殖性病变对加速肾脏疾病进展的作用越来越引起人们的重视[1]。我们通过动物实验，体外观察低密度脂蛋白(LDL)对MsC的增殖及转化生长因子β(TGF-β)和纤维连接蛋白(FN) mRNA 表达的影响，以探讨LDL在MsC增生过程中的作用。
1 材料和方法
1.1 MsC的培养与鉴定 MsC株取自健康雄性SD大鼠，4～6周龄，体质量100～150 g。无菌条件下切取肾皮质经不同大小孔径筛网滤过，后用Ⅳ型胶原酶(Sigma公司)消化，置于含20%小牛血清的RPMI 1640培养液中培养，3 d后见扁平上皮细胞生长，以后逐渐消失，3周后被梭形细胞取代，经2～3次传代后为均一的梭形细胞。实验所用细胞为第3～4代。
, 百拇医药
1.2 LDL的分离纯化和鉴定 采用两步离心法分离人血清LDL，经琼脂糖凝胶电泳鉴定为单带，0.22 μm无菌滤器滤过除菌，Lowny法测定LDL浓度。
1.3 MsC增殖的测定 MsC经Trysin-EDTA消化，系膜细胞培养液Ⅱ号悬浮细胞，镜下计数细胞密度1.0×105个/ml，转种于75 cm2培养瓶，培养2 d，换用5% FBS的Ⅱ号液24 h。(1)分别将质量浓度为50,100,150,200 μg/ml的LDL加入MsC中，培养24 h，同时用LDL 150 μg/ml加入MsC中分别培养24,48,72 h，对照组只加正常培养液；培养结束前16 h加入3H-TdR 37 kBq/ml，ZT-Ⅲ型微量多头细胞收集器收集细胞于49型玻璃纤维滤膜上，LKB 1209型液体闪烁计数行β计数。(2)LDL质量浓度为50,100,150,200 μg/ml刺激MsC时，分别加入抗TGF-β抗体10 μg/ml，培养24 h；同时用LDL 150 μg/ml刺激MsC 24,48,72 h，分别在培养结束前24 h加抗TGF-β抗体10 μg/ml，对照组只加正常培养液。
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1.4 MsC RNA 提取及Northern blot, Dot blot杂交 以相同细胞密度接种培养，分组同前，用无菌DEPC-PBS洗，以氯仿-异戊醇一步法提取细胞总RNA，经甲醛变性、凝胶电泳、吸印转移至硝酸纤维素膜上，80℃烘烤2 h。FN cDNA探针(美国ADCC公司)长1.3 kb；TGF-β cDNA探针(美国ADCC公司)长2.138 kb。采用随机引物标记试剂盒(Promega公司)以α-32P-dCTP(北京福瑞公司)标记。经吸印转移好的膜放入杂交袋中，加入预杂交液(50%去离子甲酰胺、5×SSC，1×Denhart液、50 mmol/L Na3PO4， pH 6.5，250 μg/ml变性鲑精DNA)于42℃预杂交24 h，加入标记的探针及鲑精DNA杂交24 h，经SSC/SDS漂洗，直至背景放射性消失为止。膜片稍干后，包X光片，-70℃放射自显影。放射自显影片经Shimadazacs 9300密度扫描仪测定其显影带的积分光密度。
, 百拇医药 1.5 统计学处理 MsC增殖测定数据以
±s表示，组间比较采用方差分析。
2 结 果
2.1 LDL对MsC增殖的影响 表1中3H-TdR 掺入法显示，LDL刺激MsC时，在小剂量以剂量依赖方式(50～150 μg/ml)和时间依赖(24～72 h)方式促进增殖(P<0.05)，在大剂量(200 μg/ml)则抑制MsC增殖(P<0.05)。
表1 LDL对MsC3H-TdR掺入率的影响
Tab 1 The effect of LDL on MsC 3H-TdR incorporation(n=4,±s)
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Group
Culture time (t/h)
24
48
72
Control
1015±103
1247±146
1337±354
LDL (ρB/μg*ml-1)
50
1928±786
, http://www.100md.com
2137±234
2853±342
100
2738±438
2982±425
3505±101
150
3724±651
4213±899
4977±734
, 百拇医药
200
907±154
835±170
663±137
P<0.05， P<0.01 vs control group
2.2 LDL对MsC TGF-β，FN mRNA表达的影响 Northern blot显示，不同质量浓度LDL(50～200 μg/ml)和LDL不同时间(24～72 h)刺激MsC后，细胞TGF-β，FN mRNA呈剂量和时间依赖方式增加，前者在LDL 150 μg/ml作用下MsC TGF-β, FN mRNA表达最强，在200 μg/ml则有所下降；后者LDL 150 μg/ml 刺激MsC TGF-β mRNA在48 h表达最强，FN mRNA在72 h表达最强(图1，2)。
, 百拇医药
图1 LDL (150 μg/ml)不同时间刺激MsC后
FN mRNA的表达
Fig 1 Expression of FN mRNA from LDL-
treated (150 μg/ml) MsC
2.3 抗TGF-β抗体对MsC FN mRNA表达的作用 LDL以不同质量浓度和不同时间与抗TGF-β抗体共同刺激MsC后，MsC FN mRNA表达均较未加抗TGF-β抗体时明显减少(图3)。
图2 LDL (150 μg/ml)不同时间刺激MsC后
, 百拇医药
TGF-β mRNA的表达
Fig 2 Expression of TGF-β mRNA from LDL-treated
(150 μg/ml) MsC
图3 抗TGF-β抗体对LDL刺激后MsC
FN mRNA表达的影响
Fig 3 Effect of antibody to TGF-β on FN mRNA
expression in MsC treated by LDL
, 百拇医药
A：MsC control; B: Anti-TNF-β antibody treated MsC
3 讨 论
多种肾脏疾病均伴随或并发脂质代谢紊乱。经研究证明，LDL是导致肾损害的重要脂质成分之一，能刺激体外培养的大鼠和人MsC增殖，并呈双向作用，小剂量时以剂量依赖、时间依赖的方式促进MsC增殖，大剂量时抑制MsC增殖[1，2]。本实验进一步证实上述结论。
肾小球系膜区基质进行性积聚是肾小球发生硬化的主要病理基础。FN不仅是肾小球系膜区的重要组成部分，还具有调节MsC生长和基质合成的功能[3]。在肾小球病变发生发展的过程中，FN含量往往增多，且变化早而明显，是促进肾脏纤维化或硬化进行发展的一个重要因素。研究发现，肾小球免疫性损伤中，MsC能分泌细胞因子TGF-β，通过与MsC上相应受体结合来调节它的增殖速度及其基质蛋白的合成。而且FN和蛋白多糖的合成与TGF-β的升高和系膜基质增多相一致[4]。应用抗TGF-β抗体则见基质蛋白合成受抑制，组织学病变也缓解。本实验结果表明，LDL在刺激MsC增殖的同时，从基因转录水平促进TGF-β的增加及FN的合成，而且在LDL一定浓度的刺激下，TGF-β的增加较FN合成增加提前24 h。加入抗TGF-β抗体后，FN合成明显减少，提示LDL能促进MsC产生更多的ECM，与MsC产生TGF-β增加导致ECM合成增强与降解受抑可能有密切关系。TGF-β本身也是金属蛋白酶的一种抑制因子[5]，高浓度的TGF-β可抑制MsC增殖，但作用机制尚不清楚，可能主要涉及细胞核内的反应调控环节[6]。本实验结果显示，高浓度LDL(200 μg/ml)抑制MsC增殖，同时伴有TGF-β mRNA表达下降。据此推测LDL损伤MsC，一方面可能由于MsC合成分泌TGF-β达一定水平后，它具有自身反馈调节分泌机制，除抑制MsC增殖外还可能抑制TGF-β的自分泌。我们认为，脂质导致肾小球损伤过程中，TGF-β对系膜增殖的双向调节机制可能是肾小球硬化形成的中心环节。
, 百拇医药
虽然，肾小球的免疫炎症损伤是引起肾小球系膜增生和ECM积聚的主要原因，我们通过实验发现LDL对肾小球损伤同样具有实验性大鼠肾小球体外培养中相似成分(TGF-β和FN)的变化，进一步证实了LDL的肾毒性作用，同时为临床上治疗肾病患者的高脂血症提供一定的实验依据。■
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670721)
作者简介：李娟(1971～)，女(汉族)，硕士，主治医师
王丽(第二军医大学教学医院，济南军区总医院妇产科，济南 250031)
梅长林(第二军医大学教学医院，济南军区总医院妇产科，济南 250031)
田毅华(第二军医大学教学医院，济南军区总医院妇产科，济南 250031)
, 百拇医药
王永午(第二军医大学教学医院，济南军区总医院妇产科，济南 250031)
参考文献
[1] 张爱华，王海燕，高 进，等. 低密度脂蛋白对人肾小球系膜细胞增殖的影响[J]. 中华内科杂志，1994，33(11):758-762.
[2] Pahl MV, Wang J, Zhou XJ， et al. Effects of LDL on cultured rat mesangial cell proliferation, intracellular [Ca2+] and pH[J]. J Am Soc Nephrol, 1995， 6(7): 515-521.
[3] Pai R, Michael A, Vaijinath S， et al. Cholesterol, macrophages and gene expression of TGF-β1 and fibronectin during nephrosis[J]. Kidney Int， 1995，48(3)：1254-1263.
, http://www.100md.com
[4] Kim SB, Kanh SA, Choy J， et al. LDL stimulates mesangial fibronectin production and chemoattractant expression[J]. Nephron, 1994，67(5)：427-436.
[5] Wolf G, Sharma K, Chen Y， et al. High glucose-induced proliferation in mesangial cells is reversed by autocrine TGF-β[J]. Kidney Int, 1992，42(9)：647-657.
[6] Jaffer F, Sannders C, Shultz P， et al. Regulation of nesangial cell growth by polypeptide mitogens-inhibition role of TGF-β[J]. Am J Pathol，1998，135(8)：261-270., 百拇医药
表达的影响
王丽 梅长林 田毅华 王永午
摘 要 目的：观察低密度脂蛋白(LDL)对体外培养的大鼠肾小球系膜细胞(MsC)生长及转化生长因子β(TGF-β)和纤维连接蛋白(FN)基因表达的影响。方法：体外培养的MsC培养液中加入LDL共同孵育，采用3H-TdR渗入法检测MsC增殖情况；应用Northern blot检测TGF-β mRNA和FN mRNA的表达；应用斑点杂交法检测抗TGF-β抗体对FN mRNA表达的影响。结果：(1) LDL刺激MsC在小剂量以剂量依赖(50～150 μg/ml)和时间依赖(24～72 h)促进增殖(P<0.05)，大剂量(200 μg/ml)抑制增殖(P<0.05)。(2) Northern blot显示LDL刺激MsC增殖，其TGF-β和FN mRNA表达以剂量和时间依赖方式增强。TGF-β mRNA表达较FN mRNA提前24 h。(3) Dot blot 显示，加入抗TGF-β抗体后，FN mRNA的表达较未加前明显减弱。结论：LDL不仅可刺激肾小球MsC的增殖，并且增加TGF-β和FN mRNA的表达。
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关键词：脂蛋白类，LDL；肾小球膜；转化生长因子β；纤维连接蛋白
肾小球系膜细胞(MsC)增生是各种类型肾小球疾病常见而又突出的病理学特征，是引起肾小球细胞外基质(ECM)增多，并进一步导致肾小球硬化的重要原因。研究资料表明，脂质可介导肾小球损伤，其所引起的肾小球增殖性病变对加速肾脏疾病进展的作用越来越引起人们的重视[1]。我们通过动物实验，体外观察低密度脂蛋白(LDL)对MsC的增殖及转化生长因子β(TGF-β)和纤维连接蛋白(FN) mRNA 表达的影响，以探讨LDL在MsC增生过程中的作用。
1 材料和方法
1.1 MsC的培养与鉴定 MsC株取自健康雄性SD大鼠，4～6周龄，体质量100～150 g。无菌条件下切取肾皮质经不同大小孔径筛网滤过，后用Ⅳ型胶原酶(Sigma公司)消化，置于含20%小牛血清的RPMI 1640培养液中培养，3 d后见扁平上皮细胞生长，以后逐渐消失，3周后被梭形细胞取代，经2～3次传代后为均一的梭形细胞。实验所用细胞为第3～4代。
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1.2 LDL的分离纯化和鉴定 采用两步离心法分离人血清LDL，经琼脂糖凝胶电泳鉴定为单带，0.22 μm无菌滤器滤过除菌，Lowny法测定LDL浓度。
1.3 MsC增殖的测定 MsC经Trysin-EDTA消化，系膜细胞培养液Ⅱ号悬浮细胞，镜下计数细胞密度1.0×105个/ml，转种于75 cm2培养瓶，培养2 d，换用5% FBS的Ⅱ号液24 h。(1)分别将质量浓度为50,100,150,200 μg/ml的LDL加入MsC中，培养24 h，同时用LDL 150 μg/ml加入MsC中分别培养24,48,72 h，对照组只加正常培养液；培养结束前16 h加入3H-TdR 37 kBq/ml，ZT-Ⅲ型微量多头细胞收集器收集细胞于49型玻璃纤维滤膜上，LKB 1209型液体闪烁计数行β计数。(2)LDL质量浓度为50,100,150,200 μg/ml刺激MsC时，分别加入抗TGF-β抗体10 μg/ml，培养24 h；同时用LDL 150 μg/ml刺激MsC 24,48,72 h，分别在培养结束前24 h加抗TGF-β抗体10 μg/ml，对照组只加正常培养液。
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1.4 MsC RNA 提取及Northern blot, Dot blot杂交 以相同细胞密度接种培养，分组同前，用无菌DEPC-PBS洗，以氯仿-异戊醇一步法提取细胞总RNA，经甲醛变性、凝胶电泳、吸印转移至硝酸纤维素膜上，80℃烘烤2 h。FN cDNA探针(美国ADCC公司)长1.3 kb；TGF-β cDNA探针(美国ADCC公司)长2.138 kb。采用随机引物标记试剂盒(Promega公司)以α-32P-dCTP(北京福瑞公司)标记。经吸印转移好的膜放入杂交袋中，加入预杂交液(50%去离子甲酰胺、5×SSC，1×Denhart液、50 mmol/L Na3PO4， pH 6.5，250 μg/ml变性鲑精DNA)于42℃预杂交24 h，加入标记的探针及鲑精DNA杂交24 h，经SSC/SDS漂洗，直至背景放射性消失为止。膜片稍干后，包X光片，-70℃放射自显影。放射自显影片经Shimadazacs 9300密度扫描仪测定其显影带的积分光密度。
, 百拇医药 1.5 统计学处理 MsC增殖测定数据以
±s表示，组间比较采用方差分析。2 结 果
2.1 LDL对MsC增殖的影响 表1中3H-TdR 掺入法显示，LDL刺激MsC时，在小剂量以剂量依赖方式(50～150 μg/ml)和时间依赖(24～72 h)方式促进增殖(P<0.05)，在大剂量(200 μg/ml)则抑制MsC增殖(P<0.05)。
表1 LDL对MsC3H-TdR掺入率的影响
Tab 1 The effect of LDL on MsC 3H-TdR incorporation(n=4,
±s), http://www.100md.com
Group
Culture time (t/h)
24
48
72
Control
1015±103
1247±146
1337±354
LDL (ρB/μg*ml-1)
50
1928±786
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2137±234
2853±342
100
2738±438
2982±425
3505±101
150
3724±651
4213±899
4977±734
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200
907±154
835±170
663±137
P<0.05， P<0.01 vs control group
2.2 LDL对MsC TGF-β，FN mRNA表达的影响 Northern blot显示，不同质量浓度LDL(50～200 μg/ml)和LDL不同时间(24～72 h)刺激MsC后，细胞TGF-β，FN mRNA呈剂量和时间依赖方式增加，前者在LDL 150 μg/ml作用下MsC TGF-β, FN mRNA表达最强，在200 μg/ml则有所下降；后者LDL 150 μg/ml 刺激MsC TGF-β mRNA在48 h表达最强，FN mRNA在72 h表达最强(图1，2)。
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图1 LDL (150 μg/ml)不同时间刺激MsC后
FN mRNA的表达
Fig 1 Expression of FN mRNA from LDL-
treated (150 μg/ml) MsC
2.3 抗TGF-β抗体对MsC FN mRNA表达的作用 LDL以不同质量浓度和不同时间与抗TGF-β抗体共同刺激MsC后，MsC FN mRNA表达均较未加抗TGF-β抗体时明显减少(图3)。
图2 LDL (150 μg/ml)不同时间刺激MsC后
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TGF-β mRNA的表达
Fig 2 Expression of TGF-β mRNA from LDL-treated
(150 μg/ml) MsC
图3 抗TGF-β抗体对LDL刺激后MsC
FN mRNA表达的影响
Fig 3 Effect of antibody to TGF-β on FN mRNA
expression in MsC treated by LDL
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A：MsC control; B: Anti-TNF-β antibody treated MsC
3 讨 论
多种肾脏疾病均伴随或并发脂质代谢紊乱。经研究证明，LDL是导致肾损害的重要脂质成分之一，能刺激体外培养的大鼠和人MsC增殖，并呈双向作用，小剂量时以剂量依赖、时间依赖的方式促进MsC增殖，大剂量时抑制MsC增殖[1，2]。本实验进一步证实上述结论。
肾小球系膜区基质进行性积聚是肾小球发生硬化的主要病理基础。FN不仅是肾小球系膜区的重要组成部分，还具有调节MsC生长和基质合成的功能[3]。在肾小球病变发生发展的过程中，FN含量往往增多，且变化早而明显，是促进肾脏纤维化或硬化进行发展的一个重要因素。研究发现，肾小球免疫性损伤中，MsC能分泌细胞因子TGF-β，通过与MsC上相应受体结合来调节它的增殖速度及其基质蛋白的合成。而且FN和蛋白多糖的合成与TGF-β的升高和系膜基质增多相一致[4]。应用抗TGF-β抗体则见基质蛋白合成受抑制，组织学病变也缓解。本实验结果表明，LDL在刺激MsC增殖的同时，从基因转录水平促进TGF-β的增加及FN的合成，而且在LDL一定浓度的刺激下，TGF-β的增加较FN合成增加提前24 h。加入抗TGF-β抗体后，FN合成明显减少，提示LDL能促进MsC产生更多的ECM，与MsC产生TGF-β增加导致ECM合成增强与降解受抑可能有密切关系。TGF-β本身也是金属蛋白酶的一种抑制因子[5]，高浓度的TGF-β可抑制MsC增殖，但作用机制尚不清楚，可能主要涉及细胞核内的反应调控环节[6]。本实验结果显示，高浓度LDL(200 μg/ml)抑制MsC增殖，同时伴有TGF-β mRNA表达下降。据此推测LDL损伤MsC，一方面可能由于MsC合成分泌TGF-β达一定水平后，它具有自身反馈调节分泌机制，除抑制MsC增殖外还可能抑制TGF-β的自分泌。我们认为，脂质导致肾小球损伤过程中，TGF-β对系膜增殖的双向调节机制可能是肾小球硬化形成的中心环节。
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虽然，肾小球的免疫炎症损伤是引起肾小球系膜增生和ECM积聚的主要原因，我们通过实验发现LDL对肾小球损伤同样具有实验性大鼠肾小球体外培养中相似成分(TGF-β和FN)的变化，进一步证实了LDL的肾毒性作用，同时为临床上治疗肾病患者的高脂血症提供一定的实验依据。■
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670721)
作者简介：李娟(1971～)，女(汉族)，硕士，主治医师
王丽(第二军医大学教学医院，济南军区总医院妇产科，济南 250031)
梅长林(第二军医大学教学医院，济南军区总医院妇产科，济南 250031)
田毅华(第二军医大学教学医院，济南军区总医院妇产科，济南 250031)
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王永午(第二军医大学教学医院，济南军区总医院妇产科，济南 250031)
参考文献
[1] 张爱华，王海燕，高 进，等. 低密度脂蛋白对人肾小球系膜细胞增殖的影响[J]. 中华内科杂志，1994，33(11):758-762.
[2] Pahl MV, Wang J, Zhou XJ， et al. Effects of LDL on cultured rat mesangial cell proliferation, intracellular [Ca2+] and pH[J]. J Am Soc Nephrol, 1995， 6(7): 515-521.
[3] Pai R, Michael A, Vaijinath S， et al. Cholesterol, macrophages and gene expression of TGF-β1 and fibronectin during nephrosis[J]. Kidney Int， 1995，48(3)：1254-1263.
, http://www.100md.com
[4] Kim SB, Kanh SA, Choy J， et al. LDL stimulates mesangial fibronectin production and chemoattractant expression[J]. Nephron, 1994，67(5)：427-436.
[5] Wolf G, Sharma K, Chen Y， et al. High glucose-induced proliferation in mesangial cells is reversed by autocrine TGF-β[J]. Kidney Int, 1992，42(9)：647-657.
[6] Jaffer F, Sannders C, Shultz P， et al. Regulation of nesangial cell growth by polypeptide mitogens-inhibition role of TGF-β[J]. Am J Pathol，1998，135(8)：261-270., 百拇医药