去势大鼠骨中BMP-2, BMP-7基因表达
去势大鼠骨中BMP-2, BMP-7基因表达
张勇 马平 刘健 陈苏民 蒲勤
关键词：绝经后骨质疏松；BMP-2；BMP-7；RNA打点杂交
0 引言 BMP-2有很强的诱导及促进成骨细胞分化和诱导体外成骨能力. 许多实验表明BMP-2基因表达是成骨细胞分化必不可少的因素. BMP-7亦有很强的成骨活性. BMP-2及BMP-7在骨折愈合过程中的作用虽已有很多报道，但是在骨质疏松症发病机制中的作用的研究还不深入. 绝经后骨质疏松时骨中BMP-2及BMP-7的基因表达情况如何，与骨质疏松发病有何联系尚未见报道， 为此我们进行了本项工作.
1 材料和方法
1.1 动物分组与处理 选用SD雌性大鼠9 mo龄，体质量(350±25) g，共20只，随机分成去势组和对照组， 每组10只. 均用10 g.L-1戊巴比妥钠麻醉(30 μg.kg-1, ip)下腹部切口，去势组双侧卵巢切除，而对照组仅行开腹术，分笼饲养. 这样绝经后骨质疏松动物模型就制作完成[1]. 各组动物均于术后12 wk处死，取一侧下肢剔除肌肉及软组织.
, 百拇医药
1.2 分子杂交及检测 取股骨近端骨组织0.15 g，用总RNA提取试剂盒(华美生物技术公司产品)，按说明提取其中总RNA. 用紫外分光光度计测量总RNA含量. 将样品变性后点样于硝酸纤维素膜(NC膜)上， 80℃干烤2 h待用. 地高辛标记及检测试剂盒为德国宝灵曼公司产品. 将BMP cDNA探针(本校生物化学教研室馈赠)按说明进行随机引物法标记. 然后将点样后的NC膜置入杂交液中杂交及显色检测. 显色结果进行图像分析测定灰度值. 判定方法：显色越淡数值越大.
统计分析：用t检验比较两组间的差异. 以P<0.05为显著性差异.
2 结果
2.1 RNA打点杂交结果 见图1， 2.
图1 BMP-2打点杂交结果(上排 去势组；下排 对照组)
, 百拇医药 图2 BMP-7打点杂交后结果(上排 去势组；下排 对照组)
2.2 图像分析结果 见表1.
表1 BMP-2，BMP-7打点杂交后图像分析结果
(n=10，X±s)
组别
BMP-2组灰度值
BMP-7组灰度值
去势
165.8±1.8b
160.8±3.6
对照
, 百拇医药
161.9±2.3
159.6±9.8
bP<0.01 vs对照组. 去势组BMP-2杂交结果显示灰度值大于对照组数值，组间差异显著(P<0.01). 而BMP-7的灰度值两组未见统计学差异.
3 讨论 绝经后骨质疏松的基本的发病机制是由于女性雌激素水平降低导至人体内环境紊乱而引起骨代谢的异常增高，即骨形成和骨丢失均加速，呈高转换型骨代谢，其中骨丢失强于骨形成. 以往研究注重引起骨丢失的各种因素的变化，而成骨方面，尤其是细胞因子涉及较少.
具有成骨作用的细胞因子很多，其中BMP即骨形成蛋白在成骨过程中起着重要作用. BMP的作用很广泛，但是最显著的是成骨作用. 它具有使未分化的间充质细胞定向分化为骨细胞并形成骨组织的能力. 而其中最重要的并且近年来研究较多的是BMP-2及BMP-7. BMP-2有诱导促进成骨细胞分化和诱导体外成骨能力. 有实验表明：将重组BMP-2植入到大鼠肌肉中，可促进异位骨形成[2]. 离体的BMP-2可诱导成骨细胞前体细胞分化为较成熟的成骨细胞样细胞[3]. 以上结果提示BMP-2基因表达对于成骨细胞分化是必不可少的. BMP-7又称成骨蛋白-1，单独使用即有很强成骨活性，在富含成骨细胞的细胞培养中，BMP-7能促进细胞增生及胶原合成[4]. 由于它们在成骨方面有显著作用，两者在绝经后骨质疏松中的变化就有很重要的意义. 已有实验证实[5]：严重的绝经后骨质疏松症患者血中BMP浓度明显降低. 间接表明局部BMP含量可能发生变化. 本实验从分子生物学水平研究局部BMP的变化并发现BMP-2基因表达在去势大鼠局部显著降低，因此这可能与绝经后骨质疏松的发病有密切联系. 而BMP-7在分子生物学水平未发现显著变化，但是在蛋白水平是否有变化，二者之间有何相互作用, 其他的BMP在绝经后骨质疏松中是否骨内表达也有变化，这些都有待于进一步研究.
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39570772)
作者简介：张 勇(1972-)，男(汉族)，陕西省西安市人. 硕士生. Tel.(029)3374957
张勇(第四军医大学：西京医院全军骨科研究所，陕西 西安 710033)
马平(第四军医大学：西京医院全军骨科研究所，陕西 西安 710033)
刘健(第四军医大学：西京医院全军骨科研究所，陕西 西安 710033)
陈苏民(第四军医大学：分子生物学研究所，陕西 西安 710033)
蒲勤(第四军医大学：分子生物学研究所，陕西 西安 710033)
, http://www.100md.com 参考文献
[1]Wronski TJ, Walsh CC, Ignaaszeweski LA et al. Histologic evidence for ostepenia and increased bone turnover in ovariectomized rats [J]. Bone, 1986;7(2):119-123.
[2]Wozney JM, Rosen V, Celeste AJ et al. Novel regulators of bone for mation: Molecular clone and activities [J]. Science, 1988;242(4885):1528-1 534.
[3]Yamaguchi A, Katagiri T, Ikeda T et al. Reconbinant human bone morphogenetic protein-2 stimulates osteoblastic maturation and inhibits myogenic differentiation in vitro [J]. J Cell Biol,1991;113(3):681-687.
, http://www.100md.com
[4]Maliakal JC, Asahina I, Hauschka PV et al. Osteogenic protein- 7 (BMP-7) inhibits cell proliferation stimulates the expression of makers characteristic of osteoblast phenotype in rat osteosarcoma cells [J]. Growth Factors, 1994;11(3):227-234.
[5]Urist MR, Nillsson OS, Hudak R et al. Immunologic evidence of a bone morphogenetic protein in the milieu interieur [J]. Ann Biol Clin Paris , 1985;43(5):755-766., 百拇医药
张勇 马平 刘健 陈苏民 蒲勤
关键词：绝经后骨质疏松；BMP-2；BMP-7；RNA打点杂交
0 引言 BMP-2有很强的诱导及促进成骨细胞分化和诱导体外成骨能力. 许多实验表明BMP-2基因表达是成骨细胞分化必不可少的因素. BMP-7亦有很强的成骨活性. BMP-2及BMP-7在骨折愈合过程中的作用虽已有很多报道，但是在骨质疏松症发病机制中的作用的研究还不深入. 绝经后骨质疏松时骨中BMP-2及BMP-7的基因表达情况如何，与骨质疏松发病有何联系尚未见报道， 为此我们进行了本项工作.
1 材料和方法
1.1 动物分组与处理 选用SD雌性大鼠9 mo龄，体质量(350±25) g，共20只，随机分成去势组和对照组， 每组10只. 均用10 g.L-1戊巴比妥钠麻醉(30 μg.kg-1, ip)下腹部切口，去势组双侧卵巢切除，而对照组仅行开腹术，分笼饲养. 这样绝经后骨质疏松动物模型就制作完成[1]. 各组动物均于术后12 wk处死，取一侧下肢剔除肌肉及软组织.
, 百拇医药
1.2 分子杂交及检测 取股骨近端骨组织0.15 g，用总RNA提取试剂盒(华美生物技术公司产品)，按说明提取其中总RNA. 用紫外分光光度计测量总RNA含量. 将样品变性后点样于硝酸纤维素膜(NC膜)上， 80℃干烤2 h待用. 地高辛标记及检测试剂盒为德国宝灵曼公司产品. 将BMP cDNA探针(本校生物化学教研室馈赠)按说明进行随机引物法标记. 然后将点样后的NC膜置入杂交液中杂交及显色检测. 显色结果进行图像分析测定灰度值. 判定方法：显色越淡数值越大.
统计分析：用t检验比较两组间的差异. 以P<0.05为显著性差异.
2 结果
2.1 RNA打点杂交结果 见图1， 2.
图1 BMP-2打点杂交结果(上排 去势组；下排 对照组)
, 百拇医药 图2 BMP-7打点杂交后结果(上排 去势组；下排 对照组)
2.2 图像分析结果 见表1.
表1 BMP-2，BMP-7打点杂交后图像分析结果
(n=10，X±s)
组别
BMP-2组灰度值
BMP-7组灰度值
去势
165.8±1.8b
160.8±3.6
对照
, 百拇医药
161.9±2.3
159.6±9.8
bP<0.01 vs对照组. 去势组BMP-2杂交结果显示灰度值大于对照组数值，组间差异显著(P<0.01). 而BMP-7的灰度值两组未见统计学差异.
3 讨论 绝经后骨质疏松的基本的发病机制是由于女性雌激素水平降低导至人体内环境紊乱而引起骨代谢的异常增高，即骨形成和骨丢失均加速，呈高转换型骨代谢，其中骨丢失强于骨形成. 以往研究注重引起骨丢失的各种因素的变化，而成骨方面，尤其是细胞因子涉及较少.
具有成骨作用的细胞因子很多，其中BMP即骨形成蛋白在成骨过程中起着重要作用. BMP的作用很广泛，但是最显著的是成骨作用. 它具有使未分化的间充质细胞定向分化为骨细胞并形成骨组织的能力. 而其中最重要的并且近年来研究较多的是BMP-2及BMP-7. BMP-2有诱导促进成骨细胞分化和诱导体外成骨能力. 有实验表明：将重组BMP-2植入到大鼠肌肉中，可促进异位骨形成[2]. 离体的BMP-2可诱导成骨细胞前体细胞分化为较成熟的成骨细胞样细胞[3]. 以上结果提示BMP-2基因表达对于成骨细胞分化是必不可少的. BMP-7又称成骨蛋白-1，单独使用即有很强成骨活性，在富含成骨细胞的细胞培养中，BMP-7能促进细胞增生及胶原合成[4]. 由于它们在成骨方面有显著作用，两者在绝经后骨质疏松中的变化就有很重要的意义. 已有实验证实[5]：严重的绝经后骨质疏松症患者血中BMP浓度明显降低. 间接表明局部BMP含量可能发生变化. 本实验从分子生物学水平研究局部BMP的变化并发现BMP-2基因表达在去势大鼠局部显著降低，因此这可能与绝经后骨质疏松的发病有密切联系. 而BMP-7在分子生物学水平未发现显著变化，但是在蛋白水平是否有变化，二者之间有何相互作用, 其他的BMP在绝经后骨质疏松中是否骨内表达也有变化，这些都有待于进一步研究.
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39570772)
作者简介：张 勇(1972-)，男(汉族)，陕西省西安市人. 硕士生. Tel.(029)3374957
张勇(第四军医大学：西京医院全军骨科研究所，陕西 西安 710033)
马平(第四军医大学：西京医院全军骨科研究所，陕西 西安 710033)
刘健(第四军医大学：西京医院全军骨科研究所，陕西 西安 710033)
陈苏民(第四军医大学：分子生物学研究所，陕西 西安 710033)
蒲勤(第四军医大学：分子生物学研究所，陕西 西安 710033)
, http://www.100md.com 参考文献
[1]Wronski TJ, Walsh CC, Ignaaszeweski LA et al. Histologic evidence for ostepenia and increased bone turnover in ovariectomized rats [J]. Bone, 1986;7(2):119-123.
[2]Wozney JM, Rosen V, Celeste AJ et al. Novel regulators of bone for mation: Molecular clone and activities [J]. Science, 1988;242(4885):1528-1 534.
[3]Yamaguchi A, Katagiri T, Ikeda T et al. Reconbinant human bone morphogenetic protein-2 stimulates osteoblastic maturation and inhibits myogenic differentiation in vitro [J]. J Cell Biol,1991;113(3):681-687.
, http://www.100md.com
[4]Maliakal JC, Asahina I, Hauschka PV et al. Osteogenic protein- 7 (BMP-7) inhibits cell proliferation stimulates the expression of makers characteristic of osteoblast phenotype in rat osteosarcoma cells [J]. Growth Factors, 1994;11(3):227-234.
[5]Urist MR, Nillsson OS, Hudak R et al. Immunologic evidence of a bone morphogenetic protein in the milieu interieur [J]. Ann Biol Clin Paris , 1985;43(5):755-766., 百拇医药