痰中抗体包裹细菌对院内下呼吸道感染的诊断价值
冯照雷 张庆殷
摘 要： 目的 为了探讨抗体包裹细菌(ACB)对院内下呼吸道感染的诊断价值。方法 痰中病原菌定量培养、鉴定及荧光免疫法检测ACB及其抗体类型。 结果 ACB在含致病菌标本中阳性率为64.4%；在非致病菌标本中阳性率为11.9%，二者差异明显。结论 ACB与痰中致病菌(浓度)密切相关，对于院内下呼吸道感染的诊断、治疗具有重要临床意义。
关键词：抗体包裹细菌(ACB)；下呼吸道感染；医院感染
院内下呼吸道感染在我国医院感染发病率占据首位，病死率很高。确定呼吸道分泌物中的病原菌对该类感染的诊断和治疗具有重要意义，但标本往往受到上呼吸道菌群的污染，造成病原体明确困难；各种侵入性操作虽然能获取不被污染的分泌物标本，但由于会造成患者痛苦，引起严重的并发症[1]，而不适于常规的标本获取。目前，痰仍是绝大多数实验室鉴别下呼吸道感染病原体的最常采集的标本[2、3]。本文通过对痰标本中的病原菌鉴定及抗体包裹细菌(ACB)的检测，探讨ACB对院内下呼吸道感染的诊断意义。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 病例 62例下呼吸道感染住院患者，男性38例，女性24例，年龄在28～76岁间(平均54岁)，53例患者取样前使用过抗生素如青霉素类、头孢菌素类、氨基糖甙类等。病例诊断符合1997年医院感染诊断标准[4]。
1.2 痰标本培养与鉴定 痰标本采集及质量评价参照文献[2～3]，定量培养，取0.2ml痰标本放入0.8ml 0.25%胰蛋白酶试管中，摇匀、孵育，待凝块溶解，用无菌生理盐水稀释103倍，取0.1ml接种血平板，37℃培养24h，区分致病菌并计数，对所分离菌的鉴定经API-staph鉴定。
1.3 ACB检测 用免疫荧光法检测，取10μl痰标本在载玻片上平推成楔面，空气干燥后用95%乙醇固定，将楔面分成4份，然后用pH7.2 PBS缓冲液轻轻冲洗10min，待干。将荧光标记的F(ab1)2段的羊抗人IgG、IgM、IgA及抗人白蛋白抗体(北京帮定生物工程公司提供)按说明稀释至所需滴度，分别滴在上述玻片楔面的分隔区域，4℃静置6h，后者作为阴性对照。用PBS缓冲液冲洗3次，每次10min，玻片干后，用荧光显微镜镜检(01ympus BH型)。将每油镜视野≥5个荧光显色细菌视为抗体阳性(排除与阴性对照显色相同标本)。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 病原菌的种类 62例感染患者分离出65株病原菌，需氧G-菌占66.2%，其中以铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、克雷伯菌为主；G+菌占24.6%，以金黄色葡萄球菌为主；真菌感染占9.2%(表1)。
表1 62例患者65株病原菌分布
病原菌
例数
%
铜绿假单胞菌
17
26.1
大肠埃希菌
, http://www.100md.com
13
20.0
克雷伯菌
10
15.4
枸椽酸杆菌
2
3.1
金黄色葡萄球菌
14
21.5
肺炎链球菌
2
, 百拇医药
3.1
其它假单胞菌
1
1.6
念珠菌属
6
9.2
2.2 痰定量培养结果及ACB阳性率 照文献[4]则在含致病菌标本ACB阳性率为64.4%，在含上呼吸道菌群的标本中ACB阳性率为11.9%；如依照Pirtle标准[5]，将所分离菌株≥107CFU/ml的标本视作病原菌标本，将含分离菌株<107CFU/ml及上呼吸道菌群的标本视作非含致病菌标本，则前者有48份、后者53份，ACB在前、后者的阳性率分别为79.2%和9.4%。在含致病菌痰标本中ACB：阳性率明显高于非含致病菌痰标本阳性率(P<0.01)(表2)。表2 痰中细菌定量培养与ACB结果
, 百拇医药
病原菌
CFU/ml
ACB阳性(%)
N1≥106
N2≥107
N1
N2
铜绿假单胞菌
17
14
70.6
85.7
, http://www.100md.com
金黄色葡萄球菌
14
10
50.0
70.0
大肠埃希菌
13
11
76.9
90.9
克雷伯菌
10
9
, 百拇医药
60.0
66.7
其它致病菌
5
4
60.0
75.0
上呼吸道菌群
42
36
11.9
13.9
2.3 ACB中抗体类型 IgG、IgA、IgM在ABC抗体中分别占55.3%、44.8%、39.5%，两种和3种类型抗体标本为34.2%(表3)。表3 ACB阳性标本中抗体类型
, 百拇医药
抗体类型
标本数
%
IgG
10
26.3
IgA
8
21.1
IgM
9
23.7
IgG+IgA
, http://www.100md.com
5
13.2
IgG+IgM
2
5.3
IgG+IgM+IgA
4
10.5
2.4 ACB的免疫荧光 ACB的荧光显色与非特异性荧光显色明显不同，荧光显示为清晰的细菌轮廓，而后者荧光显色为模糊的似重叠的眩光轮廓(见图1、2)。
图1 ACB特异性荧光显色(10×100)
图2 ACB非特异性显色(10×100)
, http://www.100md.com
3 讨 论
院内下呼吸道感染是医院感染死亡的首要原因，也是最难预防的。确定下呼吸道中的病原菌对于该病的诊断和治疗具有重要意义。痰标本仍是目前鉴别病原菌最常采集的标本，由于人的口腔及上呼吸道存在大量细菌107～109CFU/ml会不可避免地造成标本污染。为了准确地鉴别致病菌，应区分其中污染菌与定植菌，痰的定量培养及ACB检测起着重要的作用。
在定量评价痰中致病菌时，国内目前以≥106CFU/ml为标准[4]；而Pietle以≥107CFU/ml为标准[5]，二者存在一个量级。本文依照国内标准分析了62例院内下呼吸道感染的65株病原菌，结果以G-菌为主，主要包括铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、克雷伯菌等；G+菌以金黄色葡萄球菌为主；真菌感染也占有一定比例，与文献报道基本一致[6]。铜绿假单胞菌的高检出率，可能与其易粘附定植于损伤的细胞表面有关；检测结果还表明病原菌往往含有一种优势菌，污染有唾液的标本常含有多种细菌。
, http://www.100md.com
Tetsuya M以Pirtle标准判定致病菌和非致病菌，前、后者痰标本ACB阳性率分别为69.5%、8.1%[7]；本文作者资料分别为79.2%、9.4%。本文以国内标准判定致病菌与非致病菌，则其阳性率分别为64.4%、11.9%，基本同文献[7]，致病菌组ACB阳性率明显高于非致病菌组。对于菌量多而ACB阴性的致病菌可能并非真正的病原菌，而是污染的上呼吸道和(或)下呼吸道定植细菌；其它的原因可能是：患者感染早期抗体尚未产生、免疫抑制疗法及消耗性疾病抑制了抗体产生、菌体蛋白的改变使细菌逃逸免疫防御机制，难以产生抗体等。
对于所分离到的上呼吸道菌群中ACB阳性结果可能是非特异反应，也可能其中包含引起感染的病原菌。
目前，在评价ACB试验的诊断价值时，尚缺乏用以诊断院内下呼吸道感染的病原菌的标准。因此在解释ACB结果时，尚需将其与革兰氏染色和痰培养结果结合起来分析。
, 百拇医药
在ACB阳性标本中有几种不同抗体类型，我们未能对抗体类型和患者病程的关系进一步观察和明确，但我们认为从机体产生不同类型抗体的时间规律看，抗体类型有助于判断急、慢性呼吸道感染的病程及愈后，了解患者对炎症损害的体液免疫应答情况。本文中抗体类型分别为IgG39.5%、IgA44.8%、IgM55.3%，与文献报道不太一致[7]，可能与所选患者病情、病程不同有关。
我们认为：ACB与痰中致病菌及其浓度密切相关，对于院内下呼吸道感染的诊断、治疗及判断病程、愈后具有重要价值。
冯照雷(山东省济南市中心医院， 山东 济南 250013)
张庆殷(山东省医科大学附属医院， 山东 济南 250013)
参考文献
, 百拇医药 1，Spencer CD, Beaty Hn. Complication of transtracheal aspiration[J]. New Engl J Med, 1972; 286: 304.
2，李影林. 临床微生物学及检验[M]. 北京: 人民卫生出版社, 1995. 663～667.
3，世界卫生组织. 临床细菌学基础实验室程序[M]. 北京: 人民卫生出版社, 1997. 35～36.
4，中华医院感染管理学会. 医院感染诊断标准[M]. 1997. 9.
5，Pirtle HM, Monroe PW, Samllay TK, et al. Diagnosis and therapeutic Value of serial quantitative culture of fresh sputum in bacteria pneumonia[J]. Am Rev Respi Dis, 1969, 100: 831.
6，王枢群, 张邦燮. 医院感染学[M]. 重庆: 科学技术文献出版社重庆分社, 1990. 337～339.
7，Tetsuya M, Mitsuo K, Kazuhiro T, et al. Detection of antibody-coated bacteria in expectorated sputum for diagnosis of lower respiratory infections[J]. Microbiol Immunol, 1994, 38(4): 287., 百拇医药
摘 要： 目的 为了探讨抗体包裹细菌(ACB)对院内下呼吸道感染的诊断价值。方法 痰中病原菌定量培养、鉴定及荧光免疫法检测ACB及其抗体类型。 结果 ACB在含致病菌标本中阳性率为64.4%；在非致病菌标本中阳性率为11.9%，二者差异明显。结论 ACB与痰中致病菌(浓度)密切相关，对于院内下呼吸道感染的诊断、治疗具有重要临床意义。
关键词：抗体包裹细菌(ACB)；下呼吸道感染；医院感染
院内下呼吸道感染在我国医院感染发病率占据首位，病死率很高。确定呼吸道分泌物中的病原菌对该类感染的诊断和治疗具有重要意义，但标本往往受到上呼吸道菌群的污染，造成病原体明确困难；各种侵入性操作虽然能获取不被污染的分泌物标本，但由于会造成患者痛苦，引起严重的并发症[1]，而不适于常规的标本获取。目前，痰仍是绝大多数实验室鉴别下呼吸道感染病原体的最常采集的标本[2、3]。本文通过对痰标本中的病原菌鉴定及抗体包裹细菌(ACB)的检测，探讨ACB对院内下呼吸道感染的诊断意义。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 病例 62例下呼吸道感染住院患者，男性38例，女性24例，年龄在28～76岁间(平均54岁)，53例患者取样前使用过抗生素如青霉素类、头孢菌素类、氨基糖甙类等。病例诊断符合1997年医院感染诊断标准[4]。
1.2 痰标本培养与鉴定 痰标本采集及质量评价参照文献[2～3]，定量培养，取0.2ml痰标本放入0.8ml 0.25%胰蛋白酶试管中，摇匀、孵育，待凝块溶解，用无菌生理盐水稀释103倍，取0.1ml接种血平板，37℃培养24h，区分致病菌并计数，对所分离菌的鉴定经API-staph鉴定。
1.3 ACB检测 用免疫荧光法检测，取10μl痰标本在载玻片上平推成楔面，空气干燥后用95%乙醇固定，将楔面分成4份，然后用pH7.2 PBS缓冲液轻轻冲洗10min，待干。将荧光标记的F(ab1)2段的羊抗人IgG、IgM、IgA及抗人白蛋白抗体(北京帮定生物工程公司提供)按说明稀释至所需滴度，分别滴在上述玻片楔面的分隔区域，4℃静置6h，后者作为阴性对照。用PBS缓冲液冲洗3次，每次10min，玻片干后，用荧光显微镜镜检(01ympus BH型)。将每油镜视野≥5个荧光显色细菌视为抗体阳性(排除与阴性对照显色相同标本)。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 病原菌的种类 62例感染患者分离出65株病原菌，需氧G-菌占66.2%，其中以铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、克雷伯菌为主；G+菌占24.6%，以金黄色葡萄球菌为主；真菌感染占9.2%(表1)。
表1 62例患者65株病原菌分布
病原菌
例数
%
铜绿假单胞菌
17
26.1
大肠埃希菌
, http://www.100md.com
13
20.0
克雷伯菌
10
15.4
枸椽酸杆菌
2
3.1
金黄色葡萄球菌
14
21.5
肺炎链球菌
2
, 百拇医药
3.1
其它假单胞菌
1
1.6
念珠菌属
6
9.2
2.2 痰定量培养结果及ACB阳性率 照文献[4]则在含致病菌标本ACB阳性率为64.4%，在含上呼吸道菌群的标本中ACB阳性率为11.9%；如依照Pirtle标准[5]，将所分离菌株≥107CFU/ml的标本视作病原菌标本，将含分离菌株<107CFU/ml及上呼吸道菌群的标本视作非含致病菌标本，则前者有48份、后者53份，ACB在前、后者的阳性率分别为79.2%和9.4%。在含致病菌痰标本中ACB：阳性率明显高于非含致病菌痰标本阳性率(P<0.01)(表2)。表2 痰中细菌定量培养与ACB结果
, 百拇医药
病原菌
CFU/ml
ACB阳性(%)
N1≥106
N2≥107
N1
N2
铜绿假单胞菌
17
14
70.6
85.7
, http://www.100md.com
金黄色葡萄球菌
14
10
50.0
70.0
大肠埃希菌
13
11
76.9
90.9
克雷伯菌
10
9
, 百拇医药
60.0
66.7
其它致病菌
5
4
60.0
75.0
上呼吸道菌群
42
36
11.9
13.9
2.3 ACB中抗体类型 IgG、IgA、IgM在ABC抗体中分别占55.3%、44.8%、39.5%，两种和3种类型抗体标本为34.2%(表3)。表3 ACB阳性标本中抗体类型
, 百拇医药
抗体类型
标本数
%
IgG
10
26.3
IgA
8
21.1
IgM
9
23.7
IgG+IgA
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5
13.2
IgG+IgM
2
5.3
IgG+IgM+IgA
4
10.5
2.4 ACB的免疫荧光 ACB的荧光显色与非特异性荧光显色明显不同，荧光显示为清晰的细菌轮廓，而后者荧光显色为模糊的似重叠的眩光轮廓(见图1、2)。
图1 ACB特异性荧光显色(10×100)
图2 ACB非特异性显色(10×100)
, http://www.100md.com
3 讨 论
院内下呼吸道感染是医院感染死亡的首要原因，也是最难预防的。确定下呼吸道中的病原菌对于该病的诊断和治疗具有重要意义。痰标本仍是目前鉴别病原菌最常采集的标本，由于人的口腔及上呼吸道存在大量细菌107～109CFU/ml会不可避免地造成标本污染。为了准确地鉴别致病菌，应区分其中污染菌与定植菌，痰的定量培养及ACB检测起着重要的作用。
在定量评价痰中致病菌时，国内目前以≥106CFU/ml为标准[4]；而Pietle以≥107CFU/ml为标准[5]，二者存在一个量级。本文依照国内标准分析了62例院内下呼吸道感染的65株病原菌，结果以G-菌为主，主要包括铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、克雷伯菌等；G+菌以金黄色葡萄球菌为主；真菌感染也占有一定比例，与文献报道基本一致[6]。铜绿假单胞菌的高检出率，可能与其易粘附定植于损伤的细胞表面有关；检测结果还表明病原菌往往含有一种优势菌，污染有唾液的标本常含有多种细菌。
, http://www.100md.com
Tetsuya M以Pirtle标准判定致病菌和非致病菌，前、后者痰标本ACB阳性率分别为69.5%、8.1%[7]；本文作者资料分别为79.2%、9.4%。本文以国内标准判定致病菌与非致病菌，则其阳性率分别为64.4%、11.9%，基本同文献[7]，致病菌组ACB阳性率明显高于非致病菌组。对于菌量多而ACB阴性的致病菌可能并非真正的病原菌，而是污染的上呼吸道和(或)下呼吸道定植细菌；其它的原因可能是：患者感染早期抗体尚未产生、免疫抑制疗法及消耗性疾病抑制了抗体产生、菌体蛋白的改变使细菌逃逸免疫防御机制，难以产生抗体等。
对于所分离到的上呼吸道菌群中ACB阳性结果可能是非特异反应，也可能其中包含引起感染的病原菌。
目前，在评价ACB试验的诊断价值时，尚缺乏用以诊断院内下呼吸道感染的病原菌的标准。因此在解释ACB结果时，尚需将其与革兰氏染色和痰培养结果结合起来分析。
, 百拇医药
在ACB阳性标本中有几种不同抗体类型，我们未能对抗体类型和患者病程的关系进一步观察和明确，但我们认为从机体产生不同类型抗体的时间规律看，抗体类型有助于判断急、慢性呼吸道感染的病程及愈后，了解患者对炎症损害的体液免疫应答情况。本文中抗体类型分别为IgG39.5%、IgA44.8%、IgM55.3%，与文献报道不太一致[7]，可能与所选患者病情、病程不同有关。
我们认为：ACB与痰中致病菌及其浓度密切相关，对于院内下呼吸道感染的诊断、治疗及判断病程、愈后具有重要价值。
冯照雷(山东省济南市中心医院， 山东 济南 250013)
张庆殷(山东省医科大学附属医院， 山东 济南 250013)
参考文献
, 百拇医药 1，Spencer CD, Beaty Hn. Complication of transtracheal aspiration[J]. New Engl J Med, 1972; 286: 304.
2，李影林. 临床微生物学及检验[M]. 北京: 人民卫生出版社, 1995. 663～667.
3，世界卫生组织. 临床细菌学基础实验室程序[M]. 北京: 人民卫生出版社, 1997. 35～36.
4，中华医院感染管理学会. 医院感染诊断标准[M]. 1997. 9.
5，Pirtle HM, Monroe PW, Samllay TK, et al. Diagnosis and therapeutic Value of serial quantitative culture of fresh sputum in bacteria pneumonia[J]. Am Rev Respi Dis, 1969, 100: 831.
6，王枢群, 张邦燮. 医院感染学[M]. 重庆: 科学技术文献出版社重庆分社, 1990. 337～339.
7，Tetsuya M, Mitsuo K, Kazuhiro T, et al. Detection of antibody-coated bacteria in expectorated sputum for diagnosis of lower respiratory infections[J]. Microbiol Immunol, 1994, 38(4): 287., 百拇医药