甜菜碱促进高GC含量p16基因的PCR扩增
白雪源 孟令英 崔红 李劲松 翟俊辉 车凤翔
关键词；甜菜碱；高GC含量；p16基因 PCR GC含量高的DNA序列在基因组中广泛存在，它们特别容易形成二级结构干扰PCR扩增，难以得到所需目的基因。为解决此问题，采取了各种措施如增加变性及退火温度；用NaOH进行DNA模板变性；加入DMSO、甘油、甲酰胺等溶剂破坏碱基配对；加入dGTP类似物以降低熔解温度Tm等。但上述办法只对部分GC丰富DNA的扩增有效，许多情况下完全无效。近年研究发现甜菜碱能克服这个困难[1-3]，我们参考国外报道在PCR中加入甜菜碱，结果成功地扩增出用标准PCR扩增失败的高GC含量的p16全长cDNA序列。
1 材料与方法
用淋巴细胞分层液从正常人外周血中分离出单个核细胞，再按异硫氰酸胍一步法提取总RNA并逆转录成cDNA进行PCR扩增。p16 cDNA扩增引物分别为5′-TAGAATTCCAT-GGAGGCGGCGGCGGGGAG-3′和5′-GTAAGCTTTCCCG-AGGTTTCTCAGAG-3′。反应条件：95℃ 20 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 70 s，共30个循环。为打开DNA二级结构，在标准PCR反应液中分别添加PCR促进剂如10%甘油、5%～10%甲酰胺、5%～10%DMSO和1～3 mol/L甜菜碱，再按上述条件扩增。
, 百拇医药
2 结果
由于用标准PCR对p16基因扩增失败，我们对扩增条件进行了各种优化处理，但效果均不理想。随后在标准PCR液中分别添加了甘油、甲酰胺、DMSO及甜菜碱。结果只有加入甜菜碱才能成功地扩增出520 bp的p16基因(图1)，序列测定证明与Genbank库一致；而加入其它有机物对扩增无促进作用；还观察到只有甜菜碱的浓度达到2.5 mol/L时才能发挥作用。
图1 有机添加剂对p16 cDNA扩增的影响 1：无添加剂；2：10%甘油；3：10%甲酰胺；4：10%DMSO；5：2.5 mol/L甜菜碱；M：100bp DNA Marker
3 讨论
在PCR扩增中经常遇到GC含量高的DNA模板，用标准PCR很难(甚至不可能)扩出这些基因。我们在扩增GC含量为71%的肿瘤抑制基因p16时，也遇到这个难题，尽管对反应条件进行了各种优化，但最终仍不成功。Papp等[3]在用PCR扩增GC含量84%的脆性X区三核苷酸重复序列时，发现加入甜菜碱可促进这些重复序列的扩增。考虑到p16的GC含量也较高，我们在PCR中加入了不同浓度甜菜碱，结果很容易地扩增出该基因及其他高GC含量基因，证明甜菜碱确能促进高GC基因的扩增。它的作用机理是降低双螺旋DNA的稳定性，使二级结构易于打开。因此，在cDNA文库和跳跃文库构建分析、代表性差别显示分析、各种基因的PCR扩增以及各种临床疾病的PCR诊断等方面具有广泛的应用价值。
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基金项目：“九五”军队指令性项目(9608002)
作者单位：白雪源(100853北京，解放军总医院 解放军肾脏病研究中心和重点实验室)
孟令英(军事医学科学院微生物流行病研究所)
崔红(军事医学科学院微生物流行病研究所)
李劲松(军事医学科学院微生物流行病研究所)
翟俊辉(军事医学科学院微生物流行病研究所)
车凤翔(军事医学科学院微生物流行病研究所)
通信作者：白雪源(E-mail:Baixy@U S A.net)
参考文献
, 百拇医药
[1]Weissensteiner T, Lanchbury JS. Strategy for controlling preferential amplification and avoiding false negatives in PCR typing. Biotechniques, 1996,21∶1102.
[2]Henke W, Herdel K, Jung K, et al.Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences. Nucleic Acids Res,1997,25∶3957.
[3]Papp AC, Snyder PJ, Sedra M, et al.Strategies for amplification of trinucleotide repeats:optimization of fragile X and androgen receptor PCR. Mol Diagn,1996,1(1)∶59., 百拇医药
关键词；甜菜碱；高GC含量；p16基因 PCR GC含量高的DNA序列在基因组中广泛存在，它们特别容易形成二级结构干扰PCR扩增，难以得到所需目的基因。为解决此问题，采取了各种措施如增加变性及退火温度；用NaOH进行DNA模板变性；加入DMSO、甘油、甲酰胺等溶剂破坏碱基配对；加入dGTP类似物以降低熔解温度Tm等。但上述办法只对部分GC丰富DNA的扩增有效，许多情况下完全无效。近年研究发现甜菜碱能克服这个困难[1-3]，我们参考国外报道在PCR中加入甜菜碱，结果成功地扩增出用标准PCR扩增失败的高GC含量的p16全长cDNA序列。
1 材料与方法
用淋巴细胞分层液从正常人外周血中分离出单个核细胞，再按异硫氰酸胍一步法提取总RNA并逆转录成cDNA进行PCR扩增。p16 cDNA扩增引物分别为5′-TAGAATTCCAT-GGAGGCGGCGGCGGGGAG-3′和5′-GTAAGCTTTCCCG-AGGTTTCTCAGAG-3′。反应条件：95℃ 20 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 70 s，共30个循环。为打开DNA二级结构，在标准PCR反应液中分别添加PCR促进剂如10%甘油、5%～10%甲酰胺、5%～10%DMSO和1～3 mol/L甜菜碱，再按上述条件扩增。
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2 结果
由于用标准PCR对p16基因扩增失败，我们对扩增条件进行了各种优化处理，但效果均不理想。随后在标准PCR液中分别添加了甘油、甲酰胺、DMSO及甜菜碱。结果只有加入甜菜碱才能成功地扩增出520 bp的p16基因(图1)，序列测定证明与Genbank库一致；而加入其它有机物对扩增无促进作用；还观察到只有甜菜碱的浓度达到2.5 mol/L时才能发挥作用。
图1 有机添加剂对p16 cDNA扩增的影响 1：无添加剂；2：10%甘油；3：10%甲酰胺；4：10%DMSO；5：2.5 mol/L甜菜碱；M：100bp DNA Marker
3 讨论
在PCR扩增中经常遇到GC含量高的DNA模板，用标准PCR很难(甚至不可能)扩出这些基因。我们在扩增GC含量为71%的肿瘤抑制基因p16时，也遇到这个难题，尽管对反应条件进行了各种优化，但最终仍不成功。Papp等[3]在用PCR扩增GC含量84%的脆性X区三核苷酸重复序列时，发现加入甜菜碱可促进这些重复序列的扩增。考虑到p16的GC含量也较高，我们在PCR中加入了不同浓度甜菜碱，结果很容易地扩增出该基因及其他高GC含量基因，证明甜菜碱确能促进高GC基因的扩增。它的作用机理是降低双螺旋DNA的稳定性，使二级结构易于打开。因此，在cDNA文库和跳跃文库构建分析、代表性差别显示分析、各种基因的PCR扩增以及各种临床疾病的PCR诊断等方面具有广泛的应用价值。
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基金项目：“九五”军队指令性项目(9608002)
作者单位：白雪源(100853北京，解放军总医院 解放军肾脏病研究中心和重点实验室)
孟令英(军事医学科学院微生物流行病研究所)
崔红(军事医学科学院微生物流行病研究所)
李劲松(军事医学科学院微生物流行病研究所)
翟俊辉(军事医学科学院微生物流行病研究所)
车凤翔(军事医学科学院微生物流行病研究所)
通信作者：白雪源(E-mail:Baixy@U S A.net)
参考文献
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[1]Weissensteiner T, Lanchbury JS. Strategy for controlling preferential amplification and avoiding false negatives in PCR typing. Biotechniques, 1996,21∶1102.
[2]Henke W, Herdel K, Jung K, et al.Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences. Nucleic Acids Res,1997,25∶3957.
[3]Papp AC, Snyder PJ, Sedra M, et al.Strategies for amplification of trinucleotide repeats:optimization of fragile X and androgen receptor PCR. Mol Diagn,1996,1(1)∶59., 百拇医药