猪囊尾蚴抗原DNA疫苗诱导的免疫保护效应
猪囊尾蚴抗原DNA疫苗诱导的免疫保护效应
吴丹 郭瀛军 林懿 孙树汉
摘 要 目的：观察猪囊尾蚴保护性抗原cC1 DNA疫苗诱导的小鼠免疫应答，及对仔猪的免疫保护作用。 方法：将全长cC1 cDNA插入真核表达质粒载体pcDNA3，构建了重组质粒p3-cC1，肌注小鼠，ELISA检测小鼠血清抗cC1抗体IgG及IgG2a水平，并进行仔猪的免疫保护实验。 结果：免疫小鼠第3周出现特异性IgG应答，第8周IgG水平达到最高；小鼠血清的IgG2a检测显示，第2周IgG2a 应答即为阳性，且长时间保持较高应答水平。用该疫苗免疫仔猪使其获得了73%的保护率。 结论：猪囊尾蚴保护性抗原cC1 DNA疫苗能有效诱导仔猪的免疫保护效应。
, http://www.100md.com
关键词：猪囊尾蚴；DNA；疫苗；免疫保护
猪带绦虫囊虫病是重要的人、畜共患病之一，它不仅严重危害人类的健康，每年还给养猪业带来巨大的经济损失。开发一种能诱导机体产生抗感染保护性免疫的有效疫苗是防治这一寄生虫疾病的关键。孙树汉等[1]以囊虫病患者、病猪血清为探针从猪囊尾蚴cDNA文库中筛选出一具有高度特异性和敏感性的人、猪共通抗原cC1。初步实验证实该抗原不仅可作为囊虫病诊断用特异性抗原，而且具有一定免疫保护作用。随着DNA免疫技术的兴起，为开发新型疫苗提供了新的思路。DNA疫苗制备简单，成本低廉，保存方便，代表着新型疫苗的发展方向。本研究以猪囊尾蚴保护性抗原cC1 cDNA为目的基因构建DNA疫苗，观察接种小鼠的体液及细胞免疫应答状况，并在此基础上进行了仔猪的免疫保护性实验。
1 材料和方法
1.1 质粒、菌种、细胞株和动物 质粒pcDNA3购自Invitrogen公司，质粒pUC-cC1由本室孙树汉等构建[1]，包含全长cC1 cDNA。大肠杆菌DH10B和COS-7细胞均为本室保存。雄性昆明种小鼠4～6周龄，购自本校实验动物中心。5～10 d龄仔猪由河南省新郑市养猪厂提供。
, http://www.100md.com
1.2 酶类及主要生化试剂 限制性内切酶、T4连接酶以及HRP-羊抗小鼠IgG购自华美公司；TMB为华舜公司产品；羊抗小鼠IgG2a，HRP-羊抗小鼠IgG2a购于晶美公司；抗原蛋白GST-cC1由本室陈蕊雯提供[2]。
1.3 DNA疫苗的构建及体外表达 质粒pUC-cC1经EcoRⅠ酶切后产生一个1 350 bp的小片段，其中包含有cC1 cDNA全序列，将其插入经同样单酶切的真核表达质粒pcDNA3中，并通过酶切鉴定片段插入方向，筛选出构建正确的重组质粒p3-cC1。碱裂解法大量制备重组质粒p3-cC1以及对照质粒pcDNA3，以PEG8000沉淀纯化后分别溶于PBS和TE中，测D(260)/D(280)，并调整质量浓度至1 μg/μl。分别取质粒p3-cC1和pcDNA3 各40 μg电穿孔法转染COS-7细胞，细胞浓度为1.0×107 个/ml，电穿孔参数为900 μF，250 V，转染后于72 h收集细胞，以细胞裂解液为包被抗原，囊虫病病猪血清为特异性抗体行间接ELISA检测[3]。
, http://www.100md.com
1.4 DNA疫苗免疫 雄性昆明种小鼠20只，随机分为2组，每组10只。每只小鼠双侧胫骨前肌分别注射25%葡萄糖50 μl，20 min后在原注射处注射质粒p3-cC1 50 μl；另一组注射同剂量的25%葡萄糖和质粒pcDNA3作阴性对照。全部小鼠均在第1和第3周各注射1次。
1.5 小鼠血清抗cC1 IgG和IgG2a检测 全部小鼠分别于第2，4，6，8，10周断尾取血，血清样品行双抗夹心ELISA法分别检测抗cC1 IgG和IgG2a，具体方法见文献[3]。
1.6 DNA疫苗诱导的免疫保护 仔猪20头随机均分为2组，实验组于颈部肌肉预注射25%葡萄糖1 ml，20 min后在原注射处注射质粒p3-cC1 1 ml/头，2周后加强免疫1次，加强免疫1周后，经口喂入2×104个感染性囊虫虫卵/头仔猪，虫卵攻击90 d，解剖猪体计算保护率，公式为：
, http://www.100md.com
相对保护率(%)=[(对照组囊虫均数-实验组囊虫均数)/对照组囊虫均数]×100%。
2 结 果
2.1 阳性重组子的筛选及鉴定 小量抽提转化子，分别做EcoRⅠ和HindⅢ单酶切，酶切产物行1.0%琼脂糖凝胶电泳：可见经EcoRⅠ酶切后出现一约1.3 kb的小片段；在cC1 cDNA 0.42 kb处有一HindⅢ酶切位点，转化子经HindⅢ单酶切后确实出现一约0.4 kb的小片段(图1)，说明在该转化子中抗原cC1 cDNA为正向插入，该质粒为阳性重组子p3-cC1。间接ELISA结果显示：质粒p3-cC1转染细胞裂解液中有抗原cC1的表达。
2.2 小鼠血清抗cC1 IgG水平 免疫小鼠血清抗cC1 IgG检测结果显示：第3周实验组小鼠出现特异性抗体应答，第8周抗体水平达到最高，实验组抗体水平明显高于对照组(P<0.01)(图2)。
, 百拇医药
2.3 小鼠血清IgG2a水平 免疫小鼠血清IgG2a检测结果显示：第2周小鼠血清IgG2a 应答即为阳性，第4周应答水平达高峰，对照组也显示出较高的应答水平(图3)。实验组与对照组无显著性差异(P>0.05)。
图 1 重组质粒p3-cC1的酶切鉴定
Fig 1 Digestive identification of
recombinant plasmid p3-cC1
1: Plasmid p3-cC1 / HindⅢ; 2: λDNA / EcoRⅠ+HindⅢ;
, 百拇医药
3: Plasmid p3-cC1 / EcoRⅠ
图 2 小鼠血清抗cC1 IgG水平
Fig 2 Serum anti-cC1 IgG level in mice
○: pcDNA3; ●: p3-cC1； n=10； P<0.01 vs pcDNA3
图 3 小鼠血清IgG2a水平
, 百拇医药
Fig 3 Serum IgG2a level in mice
○: pcDNA3; ●: p3-cC1; n=10
2.4 DNA疫苗诱导的免疫保护率 参照《肉品卫生检验试行规定》的标准进行肉检，肉检部位上40 cm2 未发现或仅发现钙化囊等无活性幼虫3个以下者，即按感染未成功计算。实验组相对保护率为73%。
3 讨 论
猪带绦虫囊尾蚴抗原成分复杂，由于长期暴露于宿主的免疫防御系统中，已使其产生了多种躲避宿主免疫攻击的逃避机制，因此，宿主的有效抗虫免疫有赖于特异以及非特异的体液与细胞免疫的协同作用。DNA疫苗是继减毒灭活疫苗、亚单位疫苗后又一崭新的疫苗技术，其兼顾了重组亚单位疫苗的安全性和减毒灭活疫苗诱导全面应答的高效力[4]。
, http://www.100md.com
从小鼠免疫接种后，机体抗体应答结果显示：从第3周开始，特异性抗体的检测即为阳性，且抗体水平持续升高至第8周。在细胞免疫检测中，我们选择检测血清IgG2a。血清IgG2a和IgG2b的合成可反映出机体脾细胞(Th1)应答水平。实验结果显示，第2周血清IgG2a 应答即为阳性，且长时间保持较高应答水平，同时发现注射空载体pcDNA3小鼠血清中IgG2a水平也较高。同样，在一项DNA疫苗免疫肥头绦虫感染小鼠的实验中，研究人员发现注射pcDNA3载体的对照组小鼠也获得了34%的免疫保护率[5]。这是由于在pcDNA3质粒DNA骨架的氨卞抗性基因中，有两个5′-AACGTT-3′序列。该序列具免疫刺激作用，可作用于T细胞、B细胞、NK细胞等免疫效应细胞，并促进IL-6，IL-12，IL-18等多种细胞因子的分泌[6]，具有较强的诱导Th1细胞免疫功能。
仔猪的免疫保护实验结果显示，该疫苗可有效诱导猪体的免疫保护效应，这说明以囊尾蚴保护性抗原制备DNA疫苗将为抗囊虫病疫苗的研究开辟一条新的有效的途径。为进一步提高实验猪的免疫保护效率，我们拟利用某些细胞因子的免疫增强作用加强cC1 DNA疫苗诱导的机体免疫应答[7]，以期获得更好的免疫保护效果。
, 百拇医药
【基金项目】国家863计划资助项目(101-06-0504)
【作者简介】吴丹(1972～)，女(汉族)，硕士，助教
【作者单位】吴丹(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室，上海 200433)
郭瀛军(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室，上海 200433)
林懿(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室，上海 200433)
孙树汉(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室，上海 200433)
参考文献
[1] 孙树汉, 王俊霞, 陈蕊雯,等. 囊虫病诊断用抗原编码cDNA的分子克隆[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志,1997,15(1):15-20.
, 百拇医药
[2] 陈蕊雯, 林 懿, 孙树汉. 猪囊尾蚴抗原cC1在大肠杆菌中的克隆及高效表达[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2000,18(1):37-39.
[3] 彭秀玲, 彭汉英, 谢 毅, 等 编著. 基因工程实验技术[M].第2版. 长沙: 湖南科学技术出版社, 1997.252-256.
[4] Lee DJ, Corr M, Carson DA. Control of immune responses by gene immunization[J]. Ann Med, 1998, 30(5):460-468.
[5] Rosas G, Cruz-Revilla C, Fragoso G, et al. Taenia crassiceps cysticercosis: humoral immune response and protection elicited by DNA immunization[J]. J Parasitol,1998,84(3):516-523.
[6] Roman M, Martin-Orozco E, Goodman JS, et al. Immunostimulatary DNA sequences function as T-helper-1-promoting adjuvants[J]. Nat Med, 1997,3(8): 849-854.
[7] 吴 丹, 郭瀛军, 孙树汉. 猪囊尾蚴抗原与猪白细胞介素-4基因融合DNA疫苗载体的构建[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志,1999,17(3):172-174., http://www.100md.com
吴丹 郭瀛军 林懿 孙树汉
摘 要 目的：观察猪囊尾蚴保护性抗原cC1 DNA疫苗诱导的小鼠免疫应答，及对仔猪的免疫保护作用。 方法：将全长cC1 cDNA插入真核表达质粒载体pcDNA3，构建了重组质粒p3-cC1，肌注小鼠，ELISA检测小鼠血清抗cC1抗体IgG及IgG2a水平，并进行仔猪的免疫保护实验。 结果：免疫小鼠第3周出现特异性IgG应答，第8周IgG水平达到最高；小鼠血清的IgG2a检测显示，第2周IgG2a 应答即为阳性，且长时间保持较高应答水平。用该疫苗免疫仔猪使其获得了73%的保护率。 结论：猪囊尾蚴保护性抗原cC1 DNA疫苗能有效诱导仔猪的免疫保护效应。
, http://www.100md.com
关键词：猪囊尾蚴；DNA；疫苗；免疫保护
猪带绦虫囊虫病是重要的人、畜共患病之一，它不仅严重危害人类的健康，每年还给养猪业带来巨大的经济损失。开发一种能诱导机体产生抗感染保护性免疫的有效疫苗是防治这一寄生虫疾病的关键。孙树汉等[1]以囊虫病患者、病猪血清为探针从猪囊尾蚴cDNA文库中筛选出一具有高度特异性和敏感性的人、猪共通抗原cC1。初步实验证实该抗原不仅可作为囊虫病诊断用特异性抗原，而且具有一定免疫保护作用。随着DNA免疫技术的兴起，为开发新型疫苗提供了新的思路。DNA疫苗制备简单，成本低廉，保存方便，代表着新型疫苗的发展方向。本研究以猪囊尾蚴保护性抗原cC1 cDNA为目的基因构建DNA疫苗，观察接种小鼠的体液及细胞免疫应答状况，并在此基础上进行了仔猪的免疫保护性实验。
1 材料和方法
1.1 质粒、菌种、细胞株和动物 质粒pcDNA3购自Invitrogen公司，质粒pUC-cC1由本室孙树汉等构建[1]，包含全长cC1 cDNA。大肠杆菌DH10B和COS-7细胞均为本室保存。雄性昆明种小鼠4～6周龄，购自本校实验动物中心。5～10 d龄仔猪由河南省新郑市养猪厂提供。
, http://www.100md.com
1.2 酶类及主要生化试剂 限制性内切酶、T4连接酶以及HRP-羊抗小鼠IgG购自华美公司；TMB为华舜公司产品；羊抗小鼠IgG2a，HRP-羊抗小鼠IgG2a购于晶美公司；抗原蛋白GST-cC1由本室陈蕊雯提供[2]。
1.3 DNA疫苗的构建及体外表达 质粒pUC-cC1经EcoRⅠ酶切后产生一个1 350 bp的小片段，其中包含有cC1 cDNA全序列，将其插入经同样单酶切的真核表达质粒pcDNA3中，并通过酶切鉴定片段插入方向，筛选出构建正确的重组质粒p3-cC1。碱裂解法大量制备重组质粒p3-cC1以及对照质粒pcDNA3，以PEG8000沉淀纯化后分别溶于PBS和TE中，测D(260)/D(280)，并调整质量浓度至1 μg/μl。分别取质粒p3-cC1和pcDNA3 各40 μg电穿孔法转染COS-7细胞，细胞浓度为1.0×107 个/ml，电穿孔参数为900 μF，250 V，转染后于72 h收集细胞，以细胞裂解液为包被抗原，囊虫病病猪血清为特异性抗体行间接ELISA检测[3]。
, http://www.100md.com
1.4 DNA疫苗免疫 雄性昆明种小鼠20只，随机分为2组，每组10只。每只小鼠双侧胫骨前肌分别注射25%葡萄糖50 μl，20 min后在原注射处注射质粒p3-cC1 50 μl；另一组注射同剂量的25%葡萄糖和质粒pcDNA3作阴性对照。全部小鼠均在第1和第3周各注射1次。
1.5 小鼠血清抗cC1 IgG和IgG2a检测 全部小鼠分别于第2，4，6，8，10周断尾取血，血清样品行双抗夹心ELISA法分别检测抗cC1 IgG和IgG2a，具体方法见文献[3]。
1.6 DNA疫苗诱导的免疫保护 仔猪20头随机均分为2组，实验组于颈部肌肉预注射25%葡萄糖1 ml，20 min后在原注射处注射质粒p3-cC1 1 ml/头，2周后加强免疫1次，加强免疫1周后，经口喂入2×104个感染性囊虫虫卵/头仔猪，虫卵攻击90 d，解剖猪体计算保护率，公式为：
, http://www.100md.com
相对保护率(%)=[(对照组囊虫均数-实验组囊虫均数)/对照组囊虫均数]×100%。
2 结 果
2.1 阳性重组子的筛选及鉴定 小量抽提转化子，分别做EcoRⅠ和HindⅢ单酶切，酶切产物行1.0%琼脂糖凝胶电泳：可见经EcoRⅠ酶切后出现一约1.3 kb的小片段；在cC1 cDNA 0.42 kb处有一HindⅢ酶切位点，转化子经HindⅢ单酶切后确实出现一约0.4 kb的小片段(图1)，说明在该转化子中抗原cC1 cDNA为正向插入，该质粒为阳性重组子p3-cC1。间接ELISA结果显示：质粒p3-cC1转染细胞裂解液中有抗原cC1的表达。
2.2 小鼠血清抗cC1 IgG水平 免疫小鼠血清抗cC1 IgG检测结果显示：第3周实验组小鼠出现特异性抗体应答，第8周抗体水平达到最高，实验组抗体水平明显高于对照组(P<0.01)(图2)。
, 百拇医药
2.3 小鼠血清IgG2a水平 免疫小鼠血清IgG2a检测结果显示：第2周小鼠血清IgG2a 应答即为阳性，第4周应答水平达高峰，对照组也显示出较高的应答水平(图3)。实验组与对照组无显著性差异(P>0.05)。
图 1 重组质粒p3-cC1的酶切鉴定
Fig 1 Digestive identification of
recombinant plasmid p3-cC1
1: Plasmid p3-cC1 / HindⅢ; 2: λDNA / EcoRⅠ+HindⅢ;
, 百拇医药
3: Plasmid p3-cC1 / EcoRⅠ
图 2 小鼠血清抗cC1 IgG水平
Fig 2 Serum anti-cC1 IgG level in mice
○: pcDNA3; ●: p3-cC1； n=10； P<0.01 vs pcDNA3
图 3 小鼠血清IgG2a水平
, 百拇医药
Fig 3 Serum IgG2a level in mice
○: pcDNA3; ●: p3-cC1; n=10
2.4 DNA疫苗诱导的免疫保护率 参照《肉品卫生检验试行规定》的标准进行肉检，肉检部位上40 cm2 未发现或仅发现钙化囊等无活性幼虫3个以下者，即按感染未成功计算。实验组相对保护率为73%。
3 讨 论
猪带绦虫囊尾蚴抗原成分复杂，由于长期暴露于宿主的免疫防御系统中，已使其产生了多种躲避宿主免疫攻击的逃避机制，因此，宿主的有效抗虫免疫有赖于特异以及非特异的体液与细胞免疫的协同作用。DNA疫苗是继减毒灭活疫苗、亚单位疫苗后又一崭新的疫苗技术，其兼顾了重组亚单位疫苗的安全性和减毒灭活疫苗诱导全面应答的高效力[4]。
, http://www.100md.com
从小鼠免疫接种后，机体抗体应答结果显示：从第3周开始，特异性抗体的检测即为阳性，且抗体水平持续升高至第8周。在细胞免疫检测中，我们选择检测血清IgG2a。血清IgG2a和IgG2b的合成可反映出机体脾细胞(Th1)应答水平。实验结果显示，第2周血清IgG2a 应答即为阳性，且长时间保持较高应答水平，同时发现注射空载体pcDNA3小鼠血清中IgG2a水平也较高。同样，在一项DNA疫苗免疫肥头绦虫感染小鼠的实验中，研究人员发现注射pcDNA3载体的对照组小鼠也获得了34%的免疫保护率[5]。这是由于在pcDNA3质粒DNA骨架的氨卞抗性基因中，有两个5′-AACGTT-3′序列。该序列具免疫刺激作用，可作用于T细胞、B细胞、NK细胞等免疫效应细胞，并促进IL-6，IL-12，IL-18等多种细胞因子的分泌[6]，具有较强的诱导Th1细胞免疫功能。
仔猪的免疫保护实验结果显示，该疫苗可有效诱导猪体的免疫保护效应，这说明以囊尾蚴保护性抗原制备DNA疫苗将为抗囊虫病疫苗的研究开辟一条新的有效的途径。为进一步提高实验猪的免疫保护效率，我们拟利用某些细胞因子的免疫增强作用加强cC1 DNA疫苗诱导的机体免疫应答[7]，以期获得更好的免疫保护效果。
, 百拇医药
【基金项目】国家863计划资助项目(101-06-0504)
【作者简介】吴丹(1972～)，女(汉族)，硕士，助教
【作者单位】吴丹(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室，上海 200433)
郭瀛军(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室，上海 200433)
林懿(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室，上海 200433)
孙树汉(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室，上海 200433)
参考文献
[1] 孙树汉, 王俊霞, 陈蕊雯,等. 囊虫病诊断用抗原编码cDNA的分子克隆[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志,1997,15(1):15-20.
, 百拇医药
[2] 陈蕊雯, 林 懿, 孙树汉. 猪囊尾蚴抗原cC1在大肠杆菌中的克隆及高效表达[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2000,18(1):37-39.
[3] 彭秀玲, 彭汉英, 谢 毅, 等 编著. 基因工程实验技术[M].第2版. 长沙: 湖南科学技术出版社, 1997.252-256.
[4] Lee DJ, Corr M, Carson DA. Control of immune responses by gene immunization[J]. Ann Med, 1998, 30(5):460-468.
[5] Rosas G, Cruz-Revilla C, Fragoso G, et al. Taenia crassiceps cysticercosis: humoral immune response and protection elicited by DNA immunization[J]. J Parasitol,1998,84(3):516-523.
[6] Roman M, Martin-Orozco E, Goodman JS, et al. Immunostimulatary DNA sequences function as T-helper-1-promoting adjuvants[J]. Nat Med, 1997,3(8): 849-854.
[7] 吴 丹, 郭瀛军, 孙树汉. 猪囊尾蚴抗原与猪白细胞介素-4基因融合DNA疫苗载体的构建[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志,1999,17(3):172-174., http://www.100md.com