医院感染葡萄球菌分离鉴定及耐药性分析
医院感染葡萄球菌分离鉴定及耐药性分析
曹月升 任玉玺 张立志 孙笑菊 刘朱梅
摘 要： 目的 了解葡萄球菌的致病性及药敏情况，为医院感染控制提供参考。方法 对从医院感染患者标本中分离出的118株葡萄球菌进行详细鉴定，并进行MRS检测、β-内酰胺酶试验、药敏试验MIC测定等，结合临床相关资料进行分析。 结果 在118株葡萄球菌中，共分离出10种，其中凝固酶阳性者占43.2%，凝固酶阴性者占56.8%；从总体上看，葡萄球菌的耐药性均比较强，特别是MRSA和MRCNS；不同菌种与疾病发生种类有明显的相关关系。 结论 葡萄球菌是造成医院感染的主要病原菌之一，合理使用抗生素对于有效治疗疾病和控制医院感染的发生至关重要。
关键词：医院感染；葡萄球菌；药敏试验
, 百拇医药
医院感染资料表明葡萄球菌所致医院感染病例颇多，临床治疗较为棘手[1，2]。为有效控制该菌所致医院感染的发生率，并为临床用药提供参考，我们将近两年来本院发生医院感染患者118例的标本中分离出来的118株葡萄球菌，进行了实验分析，现将情况报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源 菌株分离于1996年1月～1998年2月我院肿瘤科、内分泌科、外科、妇产科、小儿科等科室各类标本。其中呼吸道29株，感染伤口36株，血液4株，泌尿道31株，其他类18株，共118株。标准质控菌株ATCC25923，由天坛生物检定所提供。
1.1.2 主要试剂 各种生化反应管、培养基及抗生素纸片，分别购自上海医化所、天坛生物检定所。
, 百拇医药 1.1.3 抗生素 苯唑西林(苯唑青霉素)等12种抗生素多数为国产，少数为进口，均在有效期内。
1.2 方法
1.2.1 菌种鉴定 按常规方法将标本接种于5%脱纤维羊血培养基，于35℃培养过夜，挑取可疑菌落行革兰染色，确定为革兰阳性球菌，进行玻片法血浆凝固酶试验，经纯化培养后，菌株保存于琼脂斜面中。用前传代培养，按照Kloos等方法鉴定[3]。主要生理生化试验：发酵葡萄糖、试管法血浆凝固酶、DNA酶、硝酸盐还原、精氨酸双水解酶、鸟氨酸脱羧酶、β-半乳糖苷酶、尿素、蕈糖、甘露糖、甘露醇及新生霉素抗性。
1.2.2 MRS检测 采用3种方法对118株葡萄球菌进行MRS检测[4～6]。K-B法，苯唑西林耐药葡萄球菌试验，判断标准按最新规则及标准进行，取苯唑西林75/μg纸片在4%NaCl M-H琼脂平皿上进行，经24 h培养观察并记录结果，抑菌环直径≤10 mm为MRS；琼脂稀释MIC法；琼脂筛选法，6 μg/ml苯唑西林，4%NaCl M-H琼脂，按NCCLS标准。
, 百拇医药
1.2.3 β-内酰胺酶试验 采用酸测定法对上述葡萄球菌进行快速β-内酰胺酶测定。以大肠埃希菌ATCC35218、金葡菌ATCC25923为质控菌。
1.2.4 药物敏感试验琼脂稀释MIC法 分别对青霉素G等11种抗生素MIC测定，均按美国临床实验室标准委员会制定的最新规则及标准进行。
1.2.5 资料 分析与分离菌相关的病历资料。
2 结 果
2.1 细菌鉴定结果 经详细的生理生化试验，分离出金黄色葡萄球菌23株，占19.5%，中间型葡萄球菌28株，占23.7%，表皮葡萄球菌19株，占16%，溶血葡萄球菌15株，占12.7%，里昂葡萄球菌9株，占7.6%，人葡萄球菌7株，占5.9%，耳葡萄球菌7株，占5.9%，华纳葡萄球菌3株，占2.6%，其余为腐生和柯氏葡萄球菌7株，占5.9%，共10种。
, 百拇医药
2.2 MRS检测结果 3种表型方法检测葡萄球菌对苯唑青霉素耐药性测定结果见表1，从结果可看出琼脂筛选出MRS检出率要高于其他2种，MRSA 23株，MRCNS 34株，合计占48.3%。
2.3 β-内酰胺酶检测结果 118株葡萄球菌β-内酰胺酶产生率为51.1%，其中凝固酶阳性的葡萄球菌产酶率高，为72.6%。具体分布情况：MRSA 17株，MSSA 20株，MRCNS 13株，MSCNS 11株。
2.4 药敏检测及耐药率观察 按琼脂筛选法将118株葡萄球菌分成MRSA，MSSA，MRCNS，MSCNS采用琼脂稀释法分别测定了它们对青霉素等11种抗生素的MIC(表2)。
表1 3种方法MRS结果比较
菌 种
株 数
, 百拇医药
K-B法(mm)
琼脂稀释法(MIC mg/ml)
琼脂筛选法
≥13
11～12
≤10
≤2
≥4
24 h耐药
48 h耐药
凝固酶阳性葡萄球菌
51
30
, 百拇医药
1
20
30
21
23
28
凝固酶阴性葡萄球菌
67
36
2
29
37
30
34
, 百拇医药
33
表2 118株葡萄球菌对11种抗生素最小抑菌浓度及耐药率(%)
抗生素
MIC
(μg/ml)
MRSA
MSSA
MSCNS
MRCNS
株数
耐药率
株数
, 百拇医药 耐药率
株数
耐药率
株数
耐药率
青霉素
≥ 2.0
20
87.0
17
60.7
31
91.2
, http://www.100md.com 20
60.6
氨苄西林
≥ 2.0
19
82.6
16
57.1
29
85.3
18
54.5
红霉素
, 百拇医药
≥18.0
16
69.6
14
50.0
23
67.6
17
51.5
头孢唑林
≥32.0
17
73.9
, 百拇医药
9
32.1
20
58.8
15
45.5
阿米卡星
≥64.0
5
21.7
2
7.1
11
, 百拇医药
32.4
2
6.1
诺氟沙星
≥16.0
23
100.0
21
75.0
32
94.1
30
90.9
, 百拇医药
环丙沙星
≥ 4.0
21
91.3
18
64.2
31
91.2
23
69.7
复方新诺明
≥76.0
22
, http://www.100md.com
95.7
22
78.6
32
94.1
31
93.9
阿莫西林/克拉维酸
≥ 8.0
7
30.4
7
25.0
, 百拇医药
11
32.4
9
27.3
头孢哌酮/舒巴坦
≥50.0
3
13.0
2
7.1
7
20.6
4
, 百拇医药
12.1
去甲万古霉素
≤ 0.5
0
0.0
0
0.0
0
0.0
0
0.0
2.5 病历资料收集 根据标本来源，共收集118份完整的住院患者资料，其中外科39份，肿瘤科28份，糖尿病患者24份，妇产科12份，小儿科15份。外科病历系伤口、手术创面或引流感染，肿瘤患者大多为继发呼吸道或插入性感染，糖尿病患者多为继发泌尿系感染，妇产、小儿科多为化脓性或肺部感染。分析以上病历可看出MRS的分离率与患者住院时间及抗生素使用成正相关。
, http://www.100md.com
3 讨 论
3.1 葡萄球菌是医院感染的主要病原菌之一 我室分离的118株葡萄球菌均来自医院感染患者。其发生率约占我院医院感染患者的五分之一到四分之一。有资料表明，血浆凝固酶阳性的葡萄球菌(SA)，特别是其中耐苯唑西林(MRSA)者，与医院感染关系极为密切。MRSA在欧美造成顽固性医院感染，开始流行于60年代后期到70年代，耐药性逐年增加，目前遍及全球。血浆凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)属人体正常菌群，80年代后，随着介入性诊疗手段的广泛应用、免疫抑制剂的广泛使用及肿瘤、糖尿病等复杂的疾病基础，使其成为重要的机会致病菌，并出现多重耐药菌株[7，8]。耐苯唑西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)比例也逐年升高，均成为难以控制的医院感染菌。因此，做好葡萄球菌的监测与鉴定，对控制医院感染意义重大。
3.2 从菌株的致病性看合理使用抗生素至关重要 通过我们收集的118例病历资料看，金黄色及中间型葡萄球菌主要致伤口和术后感染；表皮葡萄球菌主要致泌尿系感染；溶血葡萄球菌主要致呼吸道感染；其它葡萄球菌呈均匀分布。这些来自医院感染患者的菌株，其耐药性较强。随着患者住院天数的增加，抵抗力的逐渐降低，病情亦日趋加重，从抗生素的用量不断加大、品种不断更新，随之使分离的菌株耐药性不断上升，使不少病例形成了抗生素广泛大量使用与耐药菌株的顽强递增这样一个恶性循环。由此看来，从对患者的治疗之初，就应根据致病菌株的特性，药敏试验，合理使用抗生素，切不可有丝毫的随意性。做好环境条件和各项操作的严格消毒亦很重要。
, 百拇医药
3.3 通过药敏试验和β-内酰胺酶检测为临床用药提供参考 本试验表明，MRSA(MRCNS)的耐药性明显高于MSSA(MSCNS)，表现为多重耐药，除对万古霉素完全敏感、对阿米卡星(丁胺卡那霉素)较敏感外，对其余抗生素均不理想，所以对其治疗抗生素选择范围相当狭窄。细菌学检测中，严格区分MRSA(MRCNS)与MSSA(MSCNS)对于指导临床用药，是非常必要的。
从MRSA与MSSA的产β-内酰胺酶的检测中，产酶率分别为73.9%和71.4%，二者相比无明显差异；同样，MRCNS与MSCNS的产酶率分别为38.2%和33.3%，亦无明显差异，说明β-内酰胺酶的产生与耐苯唑西林无关。对产酶的葡萄球菌给予酶抑制剂效果较好。
3.4 MRS方法学问题 通过K-B、琼脂稀释MIC法、琼脂筛选法3种方法结果比较看，琼脂筛选法的检出率高于其它两种方法，与国内报道相符。此种方法是目前国内公认的检测MRS的简便、快速、有效的一种方法。
, 百拇医药
曹月升(河北省人民医院， 河北 石家庄 050051)
任玉玺(河北省人民医院， 河北 石家庄 050051)
张立志(河北省人民医院， 河北 石家庄 050051)
孙笑菊(河北省人民医院， 河北 石家庄 050051)
刘朱梅(河北省人民医院， 河北 石家庄 050051)
参考文献
1，李胜利, 张婴元, 吴菊芳, 等. 葡萄球菌医院感染的调查研究[J]. 中华医院感染学杂志, 1998, 8(2): 65.
2，靳桂明, 张晓珍, 王颖群, 等. 金黄色葡萄球菌医院感染的临床和基因遗传聚类分析[J]. 中华医院感染学杂志, 1999, 9(3): 135.
, 百拇医药
3，Kloos WE, Lambe DW Jr. Staphylococcus. In: Albert B, ed. Manual of clinical microbiology[M]. 5th ed. Washington: American Society for Microbiology, 1991. 222.
4，叶应妩, 王毓三. 全国临床检验操作规程[M]. 南京: 东南大学出版社, 1991. 404～406.
5，李仲兴, 郑家齐, 李家宏. 诊断细菌学[M].香港: 黄河文化出版社, 1992. 176～178.
6，娄永新, 王金良. 实用临床细菌学检验与进展[M]. 天津: 天津科技翻译出版公司, 1993. 49～50.
7，向友华, 戴立人, 韩振生. 金黄色葡萄球菌对万古霉素的耐药性评述[J]. 中华医院感染学杂志, 1997, 7(1): 60.
8，刘华, 杨明清, 黄文芳. 成渝两地耐甲氧苯唑青霉素葡萄球菌分类及耐药性调查分析[J]. 中华医院感染学杂志, 1998, 8(1): 48., http://www.100md.com
曹月升 任玉玺 张立志 孙笑菊 刘朱梅
摘 要： 目的 了解葡萄球菌的致病性及药敏情况，为医院感染控制提供参考。方法 对从医院感染患者标本中分离出的118株葡萄球菌进行详细鉴定，并进行MRS检测、β-内酰胺酶试验、药敏试验MIC测定等，结合临床相关资料进行分析。 结果 在118株葡萄球菌中，共分离出10种，其中凝固酶阳性者占43.2%，凝固酶阴性者占56.8%；从总体上看，葡萄球菌的耐药性均比较强，特别是MRSA和MRCNS；不同菌种与疾病发生种类有明显的相关关系。 结论 葡萄球菌是造成医院感染的主要病原菌之一，合理使用抗生素对于有效治疗疾病和控制医院感染的发生至关重要。
关键词：医院感染；葡萄球菌；药敏试验
, 百拇医药
医院感染资料表明葡萄球菌所致医院感染病例颇多，临床治疗较为棘手[1，2]。为有效控制该菌所致医院感染的发生率，并为临床用药提供参考，我们将近两年来本院发生医院感染患者118例的标本中分离出来的118株葡萄球菌，进行了实验分析，现将情况报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源 菌株分离于1996年1月～1998年2月我院肿瘤科、内分泌科、外科、妇产科、小儿科等科室各类标本。其中呼吸道29株，感染伤口36株，血液4株，泌尿道31株，其他类18株，共118株。标准质控菌株ATCC25923，由天坛生物检定所提供。
1.1.2 主要试剂 各种生化反应管、培养基及抗生素纸片，分别购自上海医化所、天坛生物检定所。
, 百拇医药 1.1.3 抗生素 苯唑西林(苯唑青霉素)等12种抗生素多数为国产，少数为进口，均在有效期内。
1.2 方法
1.2.1 菌种鉴定 按常规方法将标本接种于5%脱纤维羊血培养基，于35℃培养过夜，挑取可疑菌落行革兰染色，确定为革兰阳性球菌，进行玻片法血浆凝固酶试验，经纯化培养后，菌株保存于琼脂斜面中。用前传代培养，按照Kloos等方法鉴定[3]。主要生理生化试验：发酵葡萄糖、试管法血浆凝固酶、DNA酶、硝酸盐还原、精氨酸双水解酶、鸟氨酸脱羧酶、β-半乳糖苷酶、尿素、蕈糖、甘露糖、甘露醇及新生霉素抗性。
1.2.2 MRS检测 采用3种方法对118株葡萄球菌进行MRS检测[4～6]。K-B法，苯唑西林耐药葡萄球菌试验，判断标准按最新规则及标准进行，取苯唑西林75/μg纸片在4%NaCl M-H琼脂平皿上进行，经24 h培养观察并记录结果，抑菌环直径≤10 mm为MRS；琼脂稀释MIC法；琼脂筛选法，6 μg/ml苯唑西林，4%NaCl M-H琼脂，按NCCLS标准。
, 百拇医药
1.2.3 β-内酰胺酶试验 采用酸测定法对上述葡萄球菌进行快速β-内酰胺酶测定。以大肠埃希菌ATCC35218、金葡菌ATCC25923为质控菌。
1.2.4 药物敏感试验琼脂稀释MIC法 分别对青霉素G等11种抗生素MIC测定，均按美国临床实验室标准委员会制定的最新规则及标准进行。
1.2.5 资料 分析与分离菌相关的病历资料。
2 结 果
2.1 细菌鉴定结果 经详细的生理生化试验，分离出金黄色葡萄球菌23株，占19.5%，中间型葡萄球菌28株，占23.7%，表皮葡萄球菌19株，占16%，溶血葡萄球菌15株，占12.7%，里昂葡萄球菌9株，占7.6%，人葡萄球菌7株，占5.9%，耳葡萄球菌7株，占5.9%，华纳葡萄球菌3株，占2.6%，其余为腐生和柯氏葡萄球菌7株，占5.9%，共10种。
, 百拇医药
2.2 MRS检测结果 3种表型方法检测葡萄球菌对苯唑青霉素耐药性测定结果见表1，从结果可看出琼脂筛选出MRS检出率要高于其他2种，MRSA 23株，MRCNS 34株，合计占48.3%。
2.3 β-内酰胺酶检测结果 118株葡萄球菌β-内酰胺酶产生率为51.1%，其中凝固酶阳性的葡萄球菌产酶率高，为72.6%。具体分布情况：MRSA 17株，MSSA 20株，MRCNS 13株，MSCNS 11株。
2.4 药敏检测及耐药率观察 按琼脂筛选法将118株葡萄球菌分成MRSA，MSSA，MRCNS，MSCNS采用琼脂稀释法分别测定了它们对青霉素等11种抗生素的MIC(表2)。
表1 3种方法MRS结果比较
菌 种
株 数
, 百拇医药
K-B法(mm)
琼脂稀释法(MIC mg/ml)
琼脂筛选法
≥13
11～12
≤10
≤2
≥4
24 h耐药
48 h耐药
凝固酶阳性葡萄球菌
51
30
, 百拇医药
1
20
30
21
23
28
凝固酶阴性葡萄球菌
67
36
2
29
37
30
34
, 百拇医药
33
表2 118株葡萄球菌对11种抗生素最小抑菌浓度及耐药率(%)
抗生素
MIC
(μg/ml)
MRSA
MSSA
MSCNS
MRCNS
株数
耐药率
株数
, 百拇医药 耐药率
株数
耐药率
株数
耐药率
青霉素
≥ 2.0
20
87.0
17
60.7
31
91.2
, http://www.100md.com 20
60.6
氨苄西林
≥ 2.0
19
82.6
16
57.1
29
85.3
18
54.5
红霉素
, 百拇医药
≥18.0
16
69.6
14
50.0
23
67.6
17
51.5
头孢唑林
≥32.0
17
73.9
, 百拇医药
9
32.1
20
58.8
15
45.5
阿米卡星
≥64.0
5
21.7
2
7.1
11
, 百拇医药
32.4
2
6.1
诺氟沙星
≥16.0
23
100.0
21
75.0
32
94.1
30
90.9
, 百拇医药
环丙沙星
≥ 4.0
21
91.3
18
64.2
31
91.2
23
69.7
复方新诺明
≥76.0
22
, http://www.100md.com
95.7
22
78.6
32
94.1
31
93.9
阿莫西林/克拉维酸
≥ 8.0
7
30.4
7
25.0
, 百拇医药
11
32.4
9
27.3
头孢哌酮/舒巴坦
≥50.0
3
13.0
2
7.1
7
20.6
4
, 百拇医药
12.1
去甲万古霉素
≤ 0.5
0
0.0
0
0.0
0
0.0
0
0.0
2.5 病历资料收集 根据标本来源，共收集118份完整的住院患者资料，其中外科39份，肿瘤科28份，糖尿病患者24份，妇产科12份，小儿科15份。外科病历系伤口、手术创面或引流感染，肿瘤患者大多为继发呼吸道或插入性感染，糖尿病患者多为继发泌尿系感染，妇产、小儿科多为化脓性或肺部感染。分析以上病历可看出MRS的分离率与患者住院时间及抗生素使用成正相关。
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3 讨 论
3.1 葡萄球菌是医院感染的主要病原菌之一 我室分离的118株葡萄球菌均来自医院感染患者。其发生率约占我院医院感染患者的五分之一到四分之一。有资料表明，血浆凝固酶阳性的葡萄球菌(SA)，特别是其中耐苯唑西林(MRSA)者，与医院感染关系极为密切。MRSA在欧美造成顽固性医院感染，开始流行于60年代后期到70年代，耐药性逐年增加，目前遍及全球。血浆凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)属人体正常菌群，80年代后，随着介入性诊疗手段的广泛应用、免疫抑制剂的广泛使用及肿瘤、糖尿病等复杂的疾病基础，使其成为重要的机会致病菌，并出现多重耐药菌株[7，8]。耐苯唑西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)比例也逐年升高，均成为难以控制的医院感染菌。因此，做好葡萄球菌的监测与鉴定，对控制医院感染意义重大。
3.2 从菌株的致病性看合理使用抗生素至关重要 通过我们收集的118例病历资料看，金黄色及中间型葡萄球菌主要致伤口和术后感染；表皮葡萄球菌主要致泌尿系感染；溶血葡萄球菌主要致呼吸道感染；其它葡萄球菌呈均匀分布。这些来自医院感染患者的菌株，其耐药性较强。随着患者住院天数的增加，抵抗力的逐渐降低，病情亦日趋加重，从抗生素的用量不断加大、品种不断更新，随之使分离的菌株耐药性不断上升，使不少病例形成了抗生素广泛大量使用与耐药菌株的顽强递增这样一个恶性循环。由此看来，从对患者的治疗之初，就应根据致病菌株的特性，药敏试验，合理使用抗生素，切不可有丝毫的随意性。做好环境条件和各项操作的严格消毒亦很重要。
, 百拇医药
3.3 通过药敏试验和β-内酰胺酶检测为临床用药提供参考 本试验表明，MRSA(MRCNS)的耐药性明显高于MSSA(MSCNS)，表现为多重耐药，除对万古霉素完全敏感、对阿米卡星(丁胺卡那霉素)较敏感外，对其余抗生素均不理想，所以对其治疗抗生素选择范围相当狭窄。细菌学检测中，严格区分MRSA(MRCNS)与MSSA(MSCNS)对于指导临床用药，是非常必要的。
从MRSA与MSSA的产β-内酰胺酶的检测中，产酶率分别为73.9%和71.4%，二者相比无明显差异；同样，MRCNS与MSCNS的产酶率分别为38.2%和33.3%，亦无明显差异，说明β-内酰胺酶的产生与耐苯唑西林无关。对产酶的葡萄球菌给予酶抑制剂效果较好。
3.4 MRS方法学问题 通过K-B、琼脂稀释MIC法、琼脂筛选法3种方法结果比较看，琼脂筛选法的检出率高于其它两种方法，与国内报道相符。此种方法是目前国内公认的检测MRS的简便、快速、有效的一种方法。
, 百拇医药
曹月升(河北省人民医院， 河北 石家庄 050051)
任玉玺(河北省人民医院， 河北 石家庄 050051)
张立志(河北省人民医院， 河北 石家庄 050051)
孙笑菊(河北省人民医院， 河北 石家庄 050051)
刘朱梅(河北省人民医院， 河北 石家庄 050051)
参考文献
1，李胜利, 张婴元, 吴菊芳, 等. 葡萄球菌医院感染的调查研究[J]. 中华医院感染学杂志, 1998, 8(2): 65.
2，靳桂明, 张晓珍, 王颖群, 等. 金黄色葡萄球菌医院感染的临床和基因遗传聚类分析[J]. 中华医院感染学杂志, 1999, 9(3): 135.
, 百拇医药
3，Kloos WE, Lambe DW Jr. Staphylococcus. In: Albert B, ed. Manual of clinical microbiology[M]. 5th ed. Washington: American Society for Microbiology, 1991. 222.
4，叶应妩, 王毓三. 全国临床检验操作规程[M]. 南京: 东南大学出版社, 1991. 404～406.
5，李仲兴, 郑家齐, 李家宏. 诊断细菌学[M].香港: 黄河文化出版社, 1992. 176～178.
6，娄永新, 王金良. 实用临床细菌学检验与进展[M]. 天津: 天津科技翻译出版公司, 1993. 49～50.
7，向友华, 戴立人, 韩振生. 金黄色葡萄球菌对万古霉素的耐药性评述[J]. 中华医院感染学杂志, 1997, 7(1): 60.
8，刘华, 杨明清, 黄文芳. 成渝两地耐甲氧苯唑青霉素葡萄球菌分类及耐药性调查分析[J]. 中华医院感染学杂志, 1998, 8(1): 48., http://www.100md.com