神经肽Y Y1受体样免疫反应物质在大鼠冠状血管中的分布
神经肽Y Y1受体样免疫反应物质在大鼠冠状血管中的分布
鲍岚 林英华 张旭
摘 要：目的 对大鼠冠状血管中神经肽Y(NPY)的Y1受体样免疫反应物质(-LI)进行定位. 方法 用免疫组织化学方法在光镜和电镜水平进行观察. 结果 大鼠心脏内大的冠状动脉未见Y1受体免疫反应的(-Ir)标记，小动脉和微动脉的多数平滑肌细胞则含Y1受体-LI. 小动脉和微动脉平滑肌细胞的Y1受体-LI在血管外膜侧、内皮细胞侧和两个平滑肌细胞相邻侧的细胞膜上均有散在的Y1受体-LI和Y1受体-Ir小泡，一些毛细血管的内皮细胞呈Y1受体-LI. 结论 NPY对冠状血流的调节主要作用于小动脉和微动脉的平滑肌细胞，有些毛细血管的内皮细胞可能也参与NPY对血流的调节.
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关键词：受体；神经肽；冠状血管；超微结构；大鼠
0 引言
冠状血管周围有神经肽Y (NPY)免疫反应(Ir)神经纤维分布，在人[1]和大鼠[2]等的冠状动脉观察到NPY有较强的收缩作用，且冠状动脉的末稍支远较其心外膜支敏感，冠状动脉内注射NPY仅引起心外膜支很小的血管直径造影变化，但明显地增加血管阻力，NPY对冠状血管收缩作用主要位于小动脉[3]，且直接作用于血管平滑肌[4].
通过放射自显影配基结合方法观察到心脏有NPY的Y1受体的结合点[5]，用分子原位杂交方法也观察到人体心脏中有表达Y1受体的mRNA[6]. 但由于已往的检测方法对组织定位的精确性不够，无法在细胞水平精确地确定受体的位置. 1994年张旭等[7]首次制备成功了抗Y1受体C末端肽片段的抗体，并在此基础上得到纯化的抗血清. 我们用这种抗Y1受体抗体，在光镜和电镜水平上，用免疫组织化学方法研究了Y1受体在大鼠冠状血管中的分布.
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1 材料和方法
1.1 免疫组织化学方法 10只SD大鼠(200～250 g)(本校实验动物中心提供)，戊巴比妥钠麻醉(50 mg.kg-1, ip)，经心脏灌注37℃生理盐水50 mL和37℃ 40 g.L-1多聚甲醛固定液50 mL(用磷酸缓冲液配制)，再灌注4℃同样固定液250 mL，取心脏，放入4℃同样固定液后固定1.5 h，200 g.L-1蔗糖浸泡24 h以上，用冰冻切片机(Leica, 德国)切20 μm的心脏矢状和冠状切片. 根据免疫组织化学方法进行组织处理，将切片放入抗Y1受体C末端肽片段的纯化的兔抗血清(1∶8000)[7]中，用生物素标记的羊抗兔血清(1∶200)和Vector ABC盒(Vector 实验室，美国) 孵育，用二甲基联苯胺和硫酸镍胺加强法显色，干燥，透明，DPX封片. 在显微镜下观察标本，Leica图像处理系统(Leica, 德国)取像.
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1.2 包埋前免疫电镜组织化学方法 4只SD大鼠，麻醉同上，经心脏灌注37℃生理盐水50 mL和37℃含0.5 mL.L-1戊二醛和40 g.L-1多聚甲醛磷酸缓冲液50 mL，再灌注4℃同样固定液250 mL，取心脏，放入4℃同样固定液后固定2 h，切50～100 μm振动切片. 在200 g.L-1蔗糖磷酸缓冲液中浸泡3 h后，在液氮中冻融3次将切片放入抗Y1受体C末端肽片段的兔抗血清(1∶8000)[7]中，用生物素标记的羊抗兔血清(1∶200)和Vector ABC盒(Vector实验室，美国)孵育，进行常规DAB反应，产物呈棕色. 在10 g.L-1锇酸中处理30 min，经梯度乙醇和环氧丙烷脱水后，在Epon812中浸润，做平板包埋，聚合后在光镜下定位，取材，在LKB Ⅲ超薄切片机上做超薄切片，在JEOL-100SX电子显微镜下观察，拍照.
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1.3 免疫组织化学对照实验 将用以制备抗体的合成Y1受体片段1 μmol.L-1 [7]与Y1受体抗血清混合，放置20 h后，做免疫组织化学结合吸收试验，以鉴定血清的特异性.
1.4 免疫组织化学标记强度测定 用Leica-Q570C型图像处理系统测定大鼠心脏矢状切片中动脉Y1受体免疫反应阳性强度，同时测定血管横断面经血管中心的长内径和短内径，根据血管的长内径和短内径换算出血管的直径，将血管依大小进行分组，每一血管组测6～7血管断面. 所给的Y1受体-Ir强度百分比为该血管断面Y1受体-Ir灰度水平与同一张切片中测定的大冠状动脉(280～300 μm)灰度水平的百分比值减去100%.
1.5 原位杂交 Y1受体寡核苷酸探针序列为Y1受体cDNA的第546～586核酸的反向互补序列，用α-35S-αATP (New England Nuclear, 波士顿，美国)、脱氧核酸末端转移酶(Amersham, 英国)、10 mmol.L-1 CoCl2、1 nmol.L-1二硫苏糖醇(LKB, Bromma, Sweden)、300 Tris和1.4 mol.L-1二甲胂酸钾(pH 7.2)反应体系标记探针的3端. 被标记的探针经Nensorb-20柱(New England Nuclear, 波士顿，美国)纯化后，加入10 mmol.L-1二硫苏糖醇，得到标记比活性为(17～67)×103 Bq.ng-1寡合核苷酸.
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SD大鼠2只，麻醉同上，断头，快速取出大鼠心脏，在干冰上快速冷冻，用冰冻切片机切厚为14 μm的切片，贴于原位杂交专用的载玻片上(Fisher, Pittsburg, PA, USA). 切片经干燥后，在42℃的湿盒内用含0.5～1 ng标记探针杂交液孵育16～18 h，杂交液每100 μL 包括下列物质：500 g.L-1甲酰胺(GT Baker Chemicals, Deventer, Netherlands); 4×SSC(1×SSC=0.15 mol.L-1 NaCl和0.0015 mol.L-1枸橼酸钠)；1×Denhardt溶液(0.2 g.L-1 each of polyvinylpyrrolidone, 牛血清白蛋白和聚蔗糖)；10 g.L-1 sarcosyl (N-十二烷基肌胺酸, Sigma, St. Louis, MO, USA); 0.02 mol.L-1磷酸缓冲液(pH 7.0)；100 g.L-1右旋糖苷硫酸盐(Pharmacia, Uppsala, Sweden); 500 mg.L-1剪切和加热变性的鲑鱼睾丸DNA (Sigma); 200 mmol.L-1二硫苏糖醇. 杂交后在55℃的1×SSC(4×15 min)和蒸馏水中清洗，600 mL.L-1和900 mL.L-1乙醇中脱水，凉干. 片子浸入用蒸馏水1∶1稀释的NTB2核迹乳剂(Kodak, Rochester, NY, USA)中，然后在-20℃的暗室内放4～6 wk，显影和定影，在显微镜暗视野下观察，拍照.
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1.6 原位杂交对照实验 用未经35S标记的探针和35S标记探针100∶1混合作为杂交液孵育切片，其余步骤同上. 得到阴性对照实验结果.
2 结果
2.1 不同管径的冠状动脉中Y1受体分布 大鼠大的冠状动脉分支(直径>280 μm)未检测到Y1受体-LI (Fig 1). 而小动脉和微动脉有许多平滑肌细胞含高水平的Y1受体-LI (Fig 2，3)，Y1受体-Ir血管平滑肌细胞呈单层，围绕血管长轴分布，Y1受体-LI主要集中于细胞膜附近，可见少量Y1受体阴性平滑肌细胞不规则地出现在Y1受体阳性平滑肌细胞之间(Fig 3，4). Y1受体-Ir标记强度随动脉直径的减小而增加(Fig 5)，强度最高为直径10～30 μm的微动脉(Fig 2). 心房与心室血管Y1受体-Ir分布无明显差异.
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图1 心脏大冠状动脉未见Y1受体-Ir标记
Fig 1 Y1-R-LI was not detected in the cross section of the large coronary artery (the largest inner diameter=485 μm, the shortest inner diameter=171 μm). *The lumen of the blood vessel, Bar=40 μm
图2 心室微动脉横断面有丰富的Y1受体-Ir标记
Fig 2 High Y1-R-LIs (arrowhead) were detected in the cross section of the ventricle arteriole *The lumen of the blood vessel. Bar=30 μm
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图3 含丰富的Y1受体-Ir微动脉，Y1受体-Ir阳性平滑肌细胞和Y1受体阴性平滑肌细胞相间出现
Fig 3 Distribution of Y1-R-LI in an arteriole. Y1-R-positive SMC (one arrowhead) were interspersed with Y1-R-negative SMCs (two arrowheads). Bar=30 μm
图4 70 μm切片中Y1受体-Ir微动脉，Y1受体阳性平滑肌细胞与Y1受体阴性平滑肌细胞相间出现
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Fig 4 Y1-R-Ir arteriole of 70 μm section. Y1-R-positive SMC (one arrowhead) were interspersed with Y1-R-negative ones (two arrowheads). Bar=30 μm
图5 大鼠冠状动脉直径与Y1受体-LI强度的直方图
Fig 5 Histogram plotting of the intensity of Y1-R-LI against the diameter in coronary arteries of rats
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2.2 超微结构定位 因Y1受体-LI沉着于血管平滑肌细胞内，所以Y1受体阳性的平滑肌细胞较阴性细胞有较高的电子密度，Y1受体-LI主要分布在近胞膜处的胞质内，在近胞膜处形成有间断的较强的标记. 然而，更强的Y1受体-Ir标记集中在胞膜附近胞质内的小泡上，Y1受体-Ir标记主要位于小泡膜上，有时也分布在小泡基质中，这些Y1受体-Ir结构有位于胞质朝向血管周围侧，也有朝向内皮侧和两个平滑肌细胞相邻侧(Fig 6).
图6 微动脉Y1受体-Ir 平滑肌细胞的电镜图
Fig 6 Electron micrograph of Y1-R-Ir SMC of an arteriole. The arrowheads indicate the sites positive for Y1-R-Ir. * The lumen of the blood vessel. E-the endothelial cell. Bar=1 μm
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一些毛细血管的内皮细胞被Y1受体-Ir标记，Y1受体-Ir内皮细胞较阴性细胞有较高的电子密度，在胞质内有大量的Y1受体-LI (Fig 7)，其中在细胞膜下有较多小泡呈Y1受体-LI， 较强的Y1受体-Ir标记有位于胞质朝向血管腔面，也有朝向血管平滑肌细胞面(Fig 7). 凡具有平滑肌的血管的内皮细胞均为Y1受体阴性.
图7 毛细血管Y1受体-Ir内皮细胞的电镜图
Fig 7 Electron micrograph of Y1-R-Ir endothelial cell of capillary blood vessel. The arrowheads indicate the Y1-R-LI. * The lumen of the blood vessel. E-the endothelial cell. Bar=5 μm
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2.3 对照 用合成的Y1受体蛋白片段(1 μmol.L-1)与1∶8000抗Y1受体的抗血清混合20 h后，做免疫组织化学标记，未见有以上描述的阳性结构.
2.4 原位杂交方法结果 在大鼠冠状小动脉和微动脉上的Y1受体mRNA标记信号明显高于周围组织中的背底信号，但杂交信号均匀地沿血管分布，无明显与平滑肌细胞相关的间隔分布(Fig 8，9). 大冠状动脉无Y1受体mRNA信号. Fig 10为阴性对照.
图8 心室壁小动脉的横切面中Y1受体原位杂交暗视野照片
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Fig 8 Dark-field picture in situ hybridization for Y1-R in the cross section of small arteries of the ventricle wall. The arrowheads indicate the Y1-R mRNA positive vessels. Bar=200 μm
图9 心室壁小动脉的纵切面中Y1受体原位杂交暗视野照片
Fig 9 Dark-field picture in situ hybridization for Y1-R in the vertical section of small arteries of the ventricle wall. The arrowheads indicate the Y1-R mRNA positive vessels. Bar=200 μm
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图10 心室壁小和微动脉的纵切面中Y1受体阴性对照原位杂交暗视野照片
Fig 10 Dark-field picture in situ hybridization for Y1-R mRNA negative control in the vertical section of small arteries and arterioles of the ventricle wall
3 讨论
NPY受体与心脏冠状动脉的血流调节有关[8]. 我们提供了Y1受体存在于心脏冠状动脉平滑肌细胞和毛细血管内皮细胞的直接形态学证据. 冠状动脉的高水平的Y1受体-LI主要存在于小和微动脉的平滑肌细胞，这与NPY对冠状动脉的血流调节主要是对冠状动脉的心脏壁内动脉支调节为主的研究结果一致[9].
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心脏中冠状动脉周围有高水平的NPY-Ir神经纤维，在心脏的小动脉和微动脉尤为丰富[10]. 我们的免疫组织化学方法显示了小动脉和微小动脉的平滑肌细胞有丰富的Y1受体-LI，且有Y1受体这些小动脉和微动脉可能介导NPY对心脏且有Y1受体的mRNA，血流调节的主要作用，作用于这些NPY受体的NPY来源于其周围丰富的NPY-Ir神经纤维，也不排除血源性的NPY.
在冠状血管中，较高水平的Y1受体-LI分布在平滑肌细胞膜上、膜下的胞质和小泡中，且在平滑肌细胞近血管周围侧有Y1受体-LI分布，此结果与文献报道的血管周围的交感神经纤维释放的NPY可作用于血管平滑肌相吻合[11]. Y1受体-LI在平滑肌细胞膜上和膜下的小泡中，提示这些区域在受体的生命周期中承担着重要作用，可能是受体与配基结合，并进行内吞和再循环的区域. 特别是平滑肌细胞朝向内皮细胞侧的胞膜上和胞质内的小泡也有较多的Y1受体-LI，提示血液来源的NPY也可作用于平滑肌细胞. 事实上，Prieto等[9]证实从大鼠冠状动脉灌注入NPY可引起血管收缩反应.
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在本研究中我们还首次发现了有些毛细血管的内皮细胞有Y1受体-LI，与平滑肌细胞一样，内皮细胞在细胞膜和小泡中有间断的Y1受体-LI分布，这似乎提示着NPY对血管产生作用时，内皮细胞和平滑肌细胞间有某种协同作用，在小动脉和微动脉中NPY主要作用在平滑肌细胞上的Y1受体，而在微血管中NPY作用于一些内皮细胞上的Y1受体. 已有研究发现[9]，在大鼠心外膜下冠状血管分配动脉中，去除内皮可增强NPY对血管的收缩作用，表明NPY可能使内皮细胞释放血管舒张因子，部分拮抗NPY对平滑肌的收缩作用，但在小动脉，内皮的存在并不减弱NPY的血管收缩作用，大鼠肠系膜动脉也有类似的结果报道[12]. 但目前尚不完全清楚在这些血管，NPY是否特异性地刺激内皮细胞释放一些因子，如前列环素和内皮依赖性舒张因子等，对平滑肌细胞产生作用. 此外，内皮细胞释放的因子也可调节平滑肌细胞的生长[13]. 对内皮细胞产生作用的NPY来源于血液，也可来源于冠状血管周围的神经纤维释放后，通过组织间液扩散. 此外，Loesch等[14]发现长时间处于应激状态可诱导内皮细胞表达NPY，提示内皮细胞上的Y1受体也可能为自身受体. 最后需要指出的是当NPY对平滑肌细胞产生作用时，平滑肌细胞也可释放，对内皮细胞的生长起调节作用的物质[13]，但NPY对血管平滑肌细胞和内皮细胞的营养作用可能还经其他的NPY受体介导[15].
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39600065)
作者简介：鲍 岚(1964-)， 女(汉族)， 浙江省绍兴市人. 副教授, 博士. Tel. (029)3374809 Email. baolan@iris.shlc.ac.cn
鲍岚(第四军医大学：航空航天医学系航空生理学教研室，陕西 西安 710033)
林英华(第四军医大学：全军神经科学研究所，陕西 西安 710033)
张旭(第四军医大学：全军神经科学研究所，陕西 西安 710033)
参考文献
[1]Tseng CJ, Robertson D, Light T et al. Neuropeptide Y is a vasoconstrictor of human coronary arteries [J]. Am J Med Sci, 1988; 296(1):11-16.
, 百拇医药
[2]Zukowska-Grojec Z, Marks ES, Haass M. Neuropeptide Y is a potent vasocontrictor and cardiodepressant in rat [J]. Am J Physiol, 1987; 253(5Pt2): H1234-H1239.
[3]Cclarke JG, Davies GJ, Kerwin R et al. Coronary artery infusion of neuropeptide Y in patients with angina pectoris [J]. Lancet, 1987; 1(8541): 1057-1059.
[4]Rudehill A, Sollevi A, Franco-Cereceda A et al. Neuropeptide Y (NPY) and the pig heart: Release and coronary vasocontrictor effects [J]. Peptides, 1986; 7(5):821-826.
, 百拇医药
[5]Wahlestedt C, Regunathan S, Reis DJ. Identification of cultured selectively expressing Y1-, Y2- or Y3-type receptors for neuropeptide Y/peptide YY [J]. Life Sci, 1992; 50(4): PL7-PL12.
[6]Wharton J, Gordon L, Byrne J et al. Expression of the human neuropeptide tyrosine Y1 receptor [J]. Proc Nalt Acad Sci USA, 1993; 90(2): 687-691.
[7]Zhang X, Bao L, Xu ZQ et al. Localization of neuropeptide Y Y1 receptors in the rat nervous system with special reference to somatic receptors on small dorsal root ganglion neurons [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91(24):11738-11742.
, 百拇医药
[8]McDermott BJ, Millar BC, Piper HM. Cardiovascular effects of neuropeptide Y: Receptor interactions and cellular mechanisms [J]. Cardiovasc Res, 1993; 27(6): 893-905.
[9]Prieto D, Benedito S, Simonsen U et al. Regional heterogeneity in the contractile and potentiating effects of neuropeptide Y in rat isolated coronary arteries: Modulatory action of endothelium [J]. Br J Pharmacol, 1991; 102(3):754-758.
[10]Gulbenkian S, Edvinsson L, Saetrum Opgaard O et al. Peptide-containing nerve fibres in guinea-pig coronary arteries: Immunohistochemistry, ultrastructure and vasomotility [J]. J Auton Nerv Syst, 1990; 31(2):153-167.
, 百拇医药
[11]Edvinsson L, Emson P, McCulloch J et al. Neuropeptide Y: Immunocytochemical localization and effect upon feline pial arteries in vitro and in situ [J]. Acta Physiol Scand, 1984; 122(2): 155-163.
[12]Andriantsitohaina R, Stoclet JC, Bukoski RD. Role of endothelium on the effects of neuropeptide-Y in mesenteric resistance arteries of spontaneously hypertensive and Wistar-Kyoto nortensive rats [J]. J Pharmacol Exp Ther, 1991; 257(1): 276-281.
, 百拇医药
[13]Schwartz SM, Liaw L. Growth control and morphogenesis in the development and pathology of arteries [J]. J Cardiovasc Pharmacol, 1993; 21(Suppl 1): s31-s49.
[14]Loesch A, Maynard KI, Burnstock G. Calcitonin gene-related peptide and neuropeptide Y-like immunoreactivity in endothelial cells after long-term stimulation of perivascular nerves [J]. Neuroscience, 1992; 48(3): 723-726.
[15]Erlinge D, Brunkwall J, Edvinsson L. Neuropeptide Y stimulates proliferation of human vascular smooth muscle cells: Cooperation with noradrenaline and ATP [J]. Regul Pept, 1994; 50(3): 259-265., 百拇医药(神经肽Y Y1受体样免疫反应物质在大鼠冠状血管中的分布)
鲍岚 林英华 张旭
摘 要：目的 对大鼠冠状血管中神经肽Y(NPY)的Y1受体样免疫反应物质(-LI)进行定位. 方法 用免疫组织化学方法在光镜和电镜水平进行观察. 结果 大鼠心脏内大的冠状动脉未见Y1受体免疫反应的(-Ir)标记，小动脉和微动脉的多数平滑肌细胞则含Y1受体-LI. 小动脉和微动脉平滑肌细胞的Y1受体-LI在血管外膜侧、内皮细胞侧和两个平滑肌细胞相邻侧的细胞膜上均有散在的Y1受体-LI和Y1受体-Ir小泡，一些毛细血管的内皮细胞呈Y1受体-LI. 结论 NPY对冠状血流的调节主要作用于小动脉和微动脉的平滑肌细胞，有些毛细血管的内皮细胞可能也参与NPY对血流的调节.
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关键词：受体；神经肽；冠状血管；超微结构；大鼠
0 引言
冠状血管周围有神经肽Y (NPY)免疫反应(Ir)神经纤维分布，在人[1]和大鼠[2]等的冠状动脉观察到NPY有较强的收缩作用，且冠状动脉的末稍支远较其心外膜支敏感，冠状动脉内注射NPY仅引起心外膜支很小的血管直径造影变化，但明显地增加血管阻力，NPY对冠状血管收缩作用主要位于小动脉[3]，且直接作用于血管平滑肌[4].
通过放射自显影配基结合方法观察到心脏有NPY的Y1受体的结合点[5]，用分子原位杂交方法也观察到人体心脏中有表达Y1受体的mRNA[6]. 但由于已往的检测方法对组织定位的精确性不够，无法在细胞水平精确地确定受体的位置. 1994年张旭等[7]首次制备成功了抗Y1受体C末端肽片段的抗体，并在此基础上得到纯化的抗血清. 我们用这种抗Y1受体抗体，在光镜和电镜水平上，用免疫组织化学方法研究了Y1受体在大鼠冠状血管中的分布.
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1 材料和方法
1.1 免疫组织化学方法 10只SD大鼠(200～250 g)(本校实验动物中心提供)，戊巴比妥钠麻醉(50 mg.kg-1, ip)，经心脏灌注37℃生理盐水50 mL和37℃ 40 g.L-1多聚甲醛固定液50 mL(用磷酸缓冲液配制)，再灌注4℃同样固定液250 mL，取心脏，放入4℃同样固定液后固定1.5 h，200 g.L-1蔗糖浸泡24 h以上，用冰冻切片机(Leica, 德国)切20 μm的心脏矢状和冠状切片. 根据免疫组织化学方法进行组织处理，将切片放入抗Y1受体C末端肽片段的纯化的兔抗血清(1∶8000)[7]中，用生物素标记的羊抗兔血清(1∶200)和Vector ABC盒(Vector 实验室，美国) 孵育，用二甲基联苯胺和硫酸镍胺加强法显色，干燥，透明，DPX封片. 在显微镜下观察标本，Leica图像处理系统(Leica, 德国)取像.
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1.2 包埋前免疫电镜组织化学方法 4只SD大鼠，麻醉同上，经心脏灌注37℃生理盐水50 mL和37℃含0.5 mL.L-1戊二醛和40 g.L-1多聚甲醛磷酸缓冲液50 mL，再灌注4℃同样固定液250 mL，取心脏，放入4℃同样固定液后固定2 h，切50～100 μm振动切片. 在200 g.L-1蔗糖磷酸缓冲液中浸泡3 h后，在液氮中冻融3次将切片放入抗Y1受体C末端肽片段的兔抗血清(1∶8000)[7]中，用生物素标记的羊抗兔血清(1∶200)和Vector ABC盒(Vector实验室，美国)孵育，进行常规DAB反应，产物呈棕色. 在10 g.L-1锇酸中处理30 min，经梯度乙醇和环氧丙烷脱水后，在Epon812中浸润，做平板包埋，聚合后在光镜下定位，取材，在LKB Ⅲ超薄切片机上做超薄切片，在JEOL-100SX电子显微镜下观察，拍照.
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1.3 免疫组织化学对照实验 将用以制备抗体的合成Y1受体片段1 μmol.L-1 [7]与Y1受体抗血清混合，放置20 h后，做免疫组织化学结合吸收试验，以鉴定血清的特异性.
1.4 免疫组织化学标记强度测定 用Leica-Q570C型图像处理系统测定大鼠心脏矢状切片中动脉Y1受体免疫反应阳性强度，同时测定血管横断面经血管中心的长内径和短内径，根据血管的长内径和短内径换算出血管的直径，将血管依大小进行分组，每一血管组测6～7血管断面. 所给的Y1受体-Ir强度百分比为该血管断面Y1受体-Ir灰度水平与同一张切片中测定的大冠状动脉(280～300 μm)灰度水平的百分比值减去100%.
1.5 原位杂交 Y1受体寡核苷酸探针序列为Y1受体cDNA的第546～586核酸的反向互补序列，用α-35S-αATP (New England Nuclear, 波士顿，美国)、脱氧核酸末端转移酶(Amersham, 英国)、10 mmol.L-1 CoCl2、1 nmol.L-1二硫苏糖醇(LKB, Bromma, Sweden)、300 Tris和1.4 mol.L-1二甲胂酸钾(pH 7.2)反应体系标记探针的3端. 被标记的探针经Nensorb-20柱(New England Nuclear, 波士顿，美国)纯化后，加入10 mmol.L-1二硫苏糖醇，得到标记比活性为(17～67)×103 Bq.ng-1寡合核苷酸.
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SD大鼠2只，麻醉同上，断头，快速取出大鼠心脏，在干冰上快速冷冻，用冰冻切片机切厚为14 μm的切片，贴于原位杂交专用的载玻片上(Fisher, Pittsburg, PA, USA). 切片经干燥后，在42℃的湿盒内用含0.5～1 ng标记探针杂交液孵育16～18 h，杂交液每100 μL 包括下列物质：500 g.L-1甲酰胺(GT Baker Chemicals, Deventer, Netherlands); 4×SSC(1×SSC=0.15 mol.L-1 NaCl和0.0015 mol.L-1枸橼酸钠)；1×Denhardt溶液(0.2 g.L-1 each of polyvinylpyrrolidone, 牛血清白蛋白和聚蔗糖)；10 g.L-1 sarcosyl (N-十二烷基肌胺酸, Sigma, St. Louis, MO, USA); 0.02 mol.L-1磷酸缓冲液(pH 7.0)；100 g.L-1右旋糖苷硫酸盐(Pharmacia, Uppsala, Sweden); 500 mg.L-1剪切和加热变性的鲑鱼睾丸DNA (Sigma); 200 mmol.L-1二硫苏糖醇. 杂交后在55℃的1×SSC(4×15 min)和蒸馏水中清洗，600 mL.L-1和900 mL.L-1乙醇中脱水，凉干. 片子浸入用蒸馏水1∶1稀释的NTB2核迹乳剂(Kodak, Rochester, NY, USA)中，然后在-20℃的暗室内放4～6 wk，显影和定影，在显微镜暗视野下观察，拍照.
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1.6 原位杂交对照实验 用未经35S标记的探针和35S标记探针100∶1混合作为杂交液孵育切片，其余步骤同上. 得到阴性对照实验结果.
2 结果
2.1 不同管径的冠状动脉中Y1受体分布 大鼠大的冠状动脉分支(直径>280 μm)未检测到Y1受体-LI (Fig 1). 而小动脉和微动脉有许多平滑肌细胞含高水平的Y1受体-LI (Fig 2，3)，Y1受体-Ir血管平滑肌细胞呈单层，围绕血管长轴分布，Y1受体-LI主要集中于细胞膜附近，可见少量Y1受体阴性平滑肌细胞不规则地出现在Y1受体阳性平滑肌细胞之间(Fig 3，4). Y1受体-Ir标记强度随动脉直径的减小而增加(Fig 5)，强度最高为直径10～30 μm的微动脉(Fig 2). 心房与心室血管Y1受体-Ir分布无明显差异.
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图1 心脏大冠状动脉未见Y1受体-Ir标记
Fig 1 Y1-R-LI was not detected in the cross section of the large coronary artery (the largest inner diameter=485 μm, the shortest inner diameter=171 μm). *The lumen of the blood vessel, Bar=40 μm
图2 心室微动脉横断面有丰富的Y1受体-Ir标记
Fig 2 High Y1-R-LIs (arrowhead) were detected in the cross section of the ventricle arteriole *The lumen of the blood vessel. Bar=30 μm
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图3 含丰富的Y1受体-Ir微动脉，Y1受体-Ir阳性平滑肌细胞和Y1受体阴性平滑肌细胞相间出现
Fig 3 Distribution of Y1-R-LI in an arteriole. Y1-R-positive SMC (one arrowhead) were interspersed with Y1-R-negative SMCs (two arrowheads). Bar=30 μm
图4 70 μm切片中Y1受体-Ir微动脉，Y1受体阳性平滑肌细胞与Y1受体阴性平滑肌细胞相间出现
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Fig 4 Y1-R-Ir arteriole of 70 μm section. Y1-R-positive SMC (one arrowhead) were interspersed with Y1-R-negative ones (two arrowheads). Bar=30 μm
图5 大鼠冠状动脉直径与Y1受体-LI强度的直方图
Fig 5 Histogram plotting of the intensity of Y1-R-LI against the diameter in coronary arteries of rats
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2.2 超微结构定位 因Y1受体-LI沉着于血管平滑肌细胞内，所以Y1受体阳性的平滑肌细胞较阴性细胞有较高的电子密度，Y1受体-LI主要分布在近胞膜处的胞质内，在近胞膜处形成有间断的较强的标记. 然而，更强的Y1受体-Ir标记集中在胞膜附近胞质内的小泡上，Y1受体-Ir标记主要位于小泡膜上，有时也分布在小泡基质中，这些Y1受体-Ir结构有位于胞质朝向血管周围侧，也有朝向内皮侧和两个平滑肌细胞相邻侧(Fig 6).
图6 微动脉Y1受体-Ir 平滑肌细胞的电镜图
Fig 6 Electron micrograph of Y1-R-Ir SMC of an arteriole. The arrowheads indicate the sites positive for Y1-R-Ir. * The lumen of the blood vessel. E-the endothelial cell. Bar=1 μm
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一些毛细血管的内皮细胞被Y1受体-Ir标记，Y1受体-Ir内皮细胞较阴性细胞有较高的电子密度，在胞质内有大量的Y1受体-LI (Fig 7)，其中在细胞膜下有较多小泡呈Y1受体-LI， 较强的Y1受体-Ir标记有位于胞质朝向血管腔面，也有朝向血管平滑肌细胞面(Fig 7). 凡具有平滑肌的血管的内皮细胞均为Y1受体阴性.
图7 毛细血管Y1受体-Ir内皮细胞的电镜图
Fig 7 Electron micrograph of Y1-R-Ir endothelial cell of capillary blood vessel. The arrowheads indicate the Y1-R-LI. * The lumen of the blood vessel. E-the endothelial cell. Bar=5 μm
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2.3 对照 用合成的Y1受体蛋白片段(1 μmol.L-1)与1∶8000抗Y1受体的抗血清混合20 h后，做免疫组织化学标记，未见有以上描述的阳性结构.
2.4 原位杂交方法结果 在大鼠冠状小动脉和微动脉上的Y1受体mRNA标记信号明显高于周围组织中的背底信号，但杂交信号均匀地沿血管分布，无明显与平滑肌细胞相关的间隔分布(Fig 8，9). 大冠状动脉无Y1受体mRNA信号. Fig 10为阴性对照.
图8 心室壁小动脉的横切面中Y1受体原位杂交暗视野照片
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Fig 8 Dark-field picture in situ hybridization for Y1-R in the cross section of small arteries of the ventricle wall. The arrowheads indicate the Y1-R mRNA positive vessels. Bar=200 μm
图9 心室壁小动脉的纵切面中Y1受体原位杂交暗视野照片
Fig 9 Dark-field picture in situ hybridization for Y1-R in the vertical section of small arteries of the ventricle wall. The arrowheads indicate the Y1-R mRNA positive vessels. Bar=200 μm
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图10 心室壁小和微动脉的纵切面中Y1受体阴性对照原位杂交暗视野照片
Fig 10 Dark-field picture in situ hybridization for Y1-R mRNA negative control in the vertical section of small arteries and arterioles of the ventricle wall
3 讨论
NPY受体与心脏冠状动脉的血流调节有关[8]. 我们提供了Y1受体存在于心脏冠状动脉平滑肌细胞和毛细血管内皮细胞的直接形态学证据. 冠状动脉的高水平的Y1受体-LI主要存在于小和微动脉的平滑肌细胞，这与NPY对冠状动脉的血流调节主要是对冠状动脉的心脏壁内动脉支调节为主的研究结果一致[9].
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心脏中冠状动脉周围有高水平的NPY-Ir神经纤维，在心脏的小动脉和微动脉尤为丰富[10]. 我们的免疫组织化学方法显示了小动脉和微小动脉的平滑肌细胞有丰富的Y1受体-LI，且有Y1受体这些小动脉和微动脉可能介导NPY对心脏且有Y1受体的mRNA，血流调节的主要作用，作用于这些NPY受体的NPY来源于其周围丰富的NPY-Ir神经纤维，也不排除血源性的NPY.
在冠状血管中，较高水平的Y1受体-LI分布在平滑肌细胞膜上、膜下的胞质和小泡中，且在平滑肌细胞近血管周围侧有Y1受体-LI分布，此结果与文献报道的血管周围的交感神经纤维释放的NPY可作用于血管平滑肌相吻合[11]. Y1受体-LI在平滑肌细胞膜上和膜下的小泡中，提示这些区域在受体的生命周期中承担着重要作用，可能是受体与配基结合，并进行内吞和再循环的区域. 特别是平滑肌细胞朝向内皮细胞侧的胞膜上和胞质内的小泡也有较多的Y1受体-LI，提示血液来源的NPY也可作用于平滑肌细胞. 事实上，Prieto等[9]证实从大鼠冠状动脉灌注入NPY可引起血管收缩反应.
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在本研究中我们还首次发现了有些毛细血管的内皮细胞有Y1受体-LI，与平滑肌细胞一样，内皮细胞在细胞膜和小泡中有间断的Y1受体-LI分布，这似乎提示着NPY对血管产生作用时，内皮细胞和平滑肌细胞间有某种协同作用，在小动脉和微动脉中NPY主要作用在平滑肌细胞上的Y1受体，而在微血管中NPY作用于一些内皮细胞上的Y1受体. 已有研究发现[9]，在大鼠心外膜下冠状血管分配动脉中，去除内皮可增强NPY对血管的收缩作用，表明NPY可能使内皮细胞释放血管舒张因子，部分拮抗NPY对平滑肌的收缩作用，但在小动脉，内皮的存在并不减弱NPY的血管收缩作用，大鼠肠系膜动脉也有类似的结果报道[12]. 但目前尚不完全清楚在这些血管，NPY是否特异性地刺激内皮细胞释放一些因子，如前列环素和内皮依赖性舒张因子等，对平滑肌细胞产生作用. 此外，内皮细胞释放的因子也可调节平滑肌细胞的生长[13]. 对内皮细胞产生作用的NPY来源于血液，也可来源于冠状血管周围的神经纤维释放后，通过组织间液扩散. 此外，Loesch等[14]发现长时间处于应激状态可诱导内皮细胞表达NPY，提示内皮细胞上的Y1受体也可能为自身受体. 最后需要指出的是当NPY对平滑肌细胞产生作用时，平滑肌细胞也可释放，对内皮细胞的生长起调节作用的物质[13]，但NPY对血管平滑肌细胞和内皮细胞的营养作用可能还经其他的NPY受体介导[15].
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39600065)
作者简介：鲍 岚(1964-)， 女(汉族)， 浙江省绍兴市人. 副教授, 博士. Tel. (029)3374809 Email. baolan@iris.shlc.ac.cn
鲍岚(第四军医大学：航空航天医学系航空生理学教研室，陕西 西安 710033)
林英华(第四军医大学：全军神经科学研究所，陕西 西安 710033)
张旭(第四军医大学：全军神经科学研究所，陕西 西安 710033)
参考文献
[1]Tseng CJ, Robertson D, Light T et al. Neuropeptide Y is a vasoconstrictor of human coronary arteries [J]. Am J Med Sci, 1988; 296(1):11-16.
, 百拇医药
[2]Zukowska-Grojec Z, Marks ES, Haass M. Neuropeptide Y is a potent vasocontrictor and cardiodepressant in rat [J]. Am J Physiol, 1987; 253(5Pt2): H1234-H1239.
[3]Cclarke JG, Davies GJ, Kerwin R et al. Coronary artery infusion of neuropeptide Y in patients with angina pectoris [J]. Lancet, 1987; 1(8541): 1057-1059.
[4]Rudehill A, Sollevi A, Franco-Cereceda A et al. Neuropeptide Y (NPY) and the pig heart: Release and coronary vasocontrictor effects [J]. Peptides, 1986; 7(5):821-826.
, 百拇医药
[5]Wahlestedt C, Regunathan S, Reis DJ. Identification of cultured selectively expressing Y1-, Y2- or Y3-type receptors for neuropeptide Y/peptide YY [J]. Life Sci, 1992; 50(4): PL7-PL12.
[6]Wharton J, Gordon L, Byrne J et al. Expression of the human neuropeptide tyrosine Y1 receptor [J]. Proc Nalt Acad Sci USA, 1993; 90(2): 687-691.
[7]Zhang X, Bao L, Xu ZQ et al. Localization of neuropeptide Y Y1 receptors in the rat nervous system with special reference to somatic receptors on small dorsal root ganglion neurons [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91(24):11738-11742.
, 百拇医药
[8]McDermott BJ, Millar BC, Piper HM. Cardiovascular effects of neuropeptide Y: Receptor interactions and cellular mechanisms [J]. Cardiovasc Res, 1993; 27(6): 893-905.
[9]Prieto D, Benedito S, Simonsen U et al. Regional heterogeneity in the contractile and potentiating effects of neuropeptide Y in rat isolated coronary arteries: Modulatory action of endothelium [J]. Br J Pharmacol, 1991; 102(3):754-758.
[10]Gulbenkian S, Edvinsson L, Saetrum Opgaard O et al. Peptide-containing nerve fibres in guinea-pig coronary arteries: Immunohistochemistry, ultrastructure and vasomotility [J]. J Auton Nerv Syst, 1990; 31(2):153-167.
, 百拇医药
[11]Edvinsson L, Emson P, McCulloch J et al. Neuropeptide Y: Immunocytochemical localization and effect upon feline pial arteries in vitro and in situ [J]. Acta Physiol Scand, 1984; 122(2): 155-163.
[12]Andriantsitohaina R, Stoclet JC, Bukoski RD. Role of endothelium on the effects of neuropeptide-Y in mesenteric resistance arteries of spontaneously hypertensive and Wistar-Kyoto nortensive rats [J]. J Pharmacol Exp Ther, 1991; 257(1): 276-281.
, 百拇医药
[13]Schwartz SM, Liaw L. Growth control and morphogenesis in the development and pathology of arteries [J]. J Cardiovasc Pharmacol, 1993; 21(Suppl 1): s31-s49.
[14]Loesch A, Maynard KI, Burnstock G. Calcitonin gene-related peptide and neuropeptide Y-like immunoreactivity in endothelial cells after long-term stimulation of perivascular nerves [J]. Neuroscience, 1992; 48(3): 723-726.
[15]Erlinge D, Brunkwall J, Edvinsson L. Neuropeptide Y stimulates proliferation of human vascular smooth muscle cells: Cooperation with noradrenaline and ATP [J]. Regul Pept, 1994; 50(3): 259-265., 百拇医药(神经肽Y Y1受体样免疫反应物质在大鼠冠状血管中的分布)