猪囊尾蚴副肌球蛋白核酸疫苗的免疫保护性研究
猪囊尾蚴副肌球蛋白核酸疫苗的免疫保护性研究
王庆敏 陈蕊雯 郭瀛军 孙树汉
摘 要 目的：研究猪囊尾蚴副肌球蛋白(AgB)核酸疫苗诱发的免疫应答。方法：将pcDNA3-AgB核酸疫苗肌注4～6周龄的昆明种小鼠，从2周后开始用ELISA方法检测小鼠体内IgG和IgG2a的水平。另外将该核酸疫苗注射C57BL/6小鼠，体外培养小鼠脾细胞，用刀豆蛋白A(ConA)和特异性抗原刺激，ELISA试剂盒检测细胞因子IL-2和IL-4的水平,并观察脾淋巴细胞增殖反应。另外,将该核酸疫苗肌注瘦型仔猪,进行攻击实验，计算相对保护率。结果：注射疫苗后的第3周起，IgG即为阳性，持续升高至第8周；从第2周起，小鼠血清IgG2a为阳性，第4周达到高峰。细胞因子检测表明，IL-2水平远远高于空载体对照组，而IL-4含量却与空载体对照组无显著差异；实验组刺激指数明显高于空载体对照组。副肌球蛋白核酸疫苗对仔猪的相对保护率为80%。结论：猪囊尾蚴副肌球蛋白核酸疫苗在小鼠动物实验中引发了以Th1型免疫应答占优势的全面免疫应答。pcDNA3-AgB核酸疫苗对仔猪具有较好的免疫保护性。
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关键词：猪囊尾蚴；副肌球蛋白；核酸类；疫苗；Th1免疫应答
核酸疫苗是20世纪90年代开始研究的一种免疫接种技术[1],它兼有亚单位疫苗的安全性和减毒灭活疫苗引发全面免疫应答等优点。目前，在动物实验中，已证实它有预防病毒、细菌、寄生虫感染,预防肿瘤等疾病的作用，而且它还有治疗的作用。猪囊虫病是世界上最重要的人畜共患病之一，传统的疫苗是利用虫体的粗提抗原制造的，但它存在一定的弊端。国内已有用核酸疫苗防治猪囊虫病研究的报道[2]。猪囊尾蚴副肌球蛋白(又名抗原B，AgB) 是扁形门寄生虫的一种保守性较强的抗原，它参与补体的调节反应[3]，也是有希望的疫苗候选抗原之一。有文献报道，虫体天然副肌球蛋白和重组蛋白部分片段均可在动物模型中产生很好的保护作用；另外将含有副肌球蛋白部分片段编码区的重组质粒接种BALB/c小鼠，在小鼠体内检测到了高水平的IgG[4],这表明该蛋白具有良好的免疫原性和免疫保护性。世界卫生组织已经将副肌球蛋白指定为疫苗候选抗原。我们在国内首次研究了猪囊尾蚴副肌球蛋白核酸疫苗的免疫保护性。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 质粒和菌种 核酸疫苗pcDNA3-AgB、重组蛋白由本室构建、表达[5，6]。
1.1.2 接种动物 雄性4～6周龄昆明种小鼠和C57BL/6小鼠，购自本校实验动物中心。仔猪由河南省新郑市养猪厂提供。
1.1.3 主要试剂 质粒制备试剂,TMB,BSA购自华舜生物公司；HRP-羊抗小鼠IgG购于华美生物工程公司；HRP-羊抗小鼠IgG2a及HRP-羊抗猪IgG购于晶美公司； 囊虫病病猪血清、囊尾蚴虫卵由河南省郑州市防疫站提供；IL-2，IL-4检测试剂盒购自凌雁科技公司。COS-7细胞由本室保存， ConA购于华舜生物公司。
1.2 方法
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1.2.1 核酸疫苗pcDNA3-AgB重组质粒的制备和纯化 质粒的制备和纯化具体步骤参照《分子克隆实验指南》[6]。
1.2.2 pcDNA3-AgB在COS-7细胞中的短暂表达及检测 利用电穿孔法将pcDNA3， pcDNA-AgB转染COS-7细胞，质粒DNA的量为40 μg，电压为250 V，电容为960 μF，详细方法参照《分子克隆实验指南》。72 h收获上清和细胞裂解液，用病猪血清、HRP-羊抗猪IgG检测表达情况。
1.2.3 小鼠的免疫接种 雄性昆明种小鼠20只，C57BL/6小鼠共12只，随机分为2组。一组肌注pcDNA3-AgB，另一组注射pcDNA3作为空载体对照。于小鼠胫骨前肌注射25%蔗糖100 μl，20 min后在原处注射核酸疫苗100 μl (1 μg/μl)，隔1周加强免疫1次。昆明种小鼠加强1次，C57BL/6小鼠加强2次。
, 百拇医药 1.2.4 小鼠血清抗体IgG，IgG2a的检测 免疫的昆明种小鼠于末次免疫后第2,3,4,6,8,10周断尾取血，血液离心，获得的血清1∶50稀释，用ELISA方法检测IgG,IgG2a的水平。
1.2.5 细胞因子的检测及脾细胞增殖反应 C57BL/6小鼠在末次免疫1周后拉颈处死，分离脾细胞，方法见《现代免疫学实验技术》[7]。脾细胞浓度为8×105个/ml，加入ConA使最终质量浓度为10 μg/ml，观察整体的免疫应答情况。将细胞置37℃ ，5% CO2温箱中培养48 h，收获上清测IL-2含量，72 h收获上清测IL-4含量。检测方法按试剂盒说明进行。另外，将脾细胞用终质量浓度为3 μg/ml虫体副肌球蛋白刺激,同时用10 μg/ml ConA刺激作为阳性对照。用MTT法计算刺激指数。
1.2.6 仔猪的免疫接种及攻击 10 d龄小猪共20头，随机分为2组，实验组接种pcDNA3-AgB，对照组接种pcDNA3。先于仔猪颈部肌肉注射25%的蔗糖1 ml，20 min后在原位注射核酸疫苗1 mg,两周后同样加强免疫2次。加强免疫1周后，经口喂入2×104个感染性虫卵/仔猪，虫卵攻击后90 d，剖检每一头仔猪并计算相对保护率。相对保护率公式如下：
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相对保护率(%)= [(对照组囊虫均数-实验组囊虫均数)/对照组囊虫均数]×100%
2 结 果
2.1 pcDNA3-AgB在 COS-7细胞中的表达 上清和细胞裂解液中均有该蛋白的表达，说明AgB为分泌性蛋白，这与文献报道一致[8]。 蛋白表达效价为1∶8,而pcDNA3转染的COS-7细胞未检测到蛋白表达。
2.2 核酸疫苗pcDNA3-AgB免疫小鼠后血清IgG，IgG2a水平 实验组免疫小鼠从末次免疫第3周起，特异性IgG为阳性，[D(450)值≥阴性对照D(450)值的2.1倍为阳性]并持续升高至第8周；从第2周起，小鼠血清中可检测到IgG2a，第4周达到高峰，空载体对照组IgG2a水平较高，IgG水平较低(图1，2)。
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图 1 pcDNA3-AgB核酸疫苗免疫
昆明种小鼠后血清中的IgG水平
Fig 1 IgG variable curve of Kunming strain
mice serum immunized with pcDNA3-AgB
n=10, P< 0.01 vs pcDNA3 group;
○： pcDNA3; ●： pcDNA3-AgB
, 百拇医药 图 2 pcDNA3-AgB核酸疫苗免疫昆明种
小鼠后血清中的IgG2a水平
Fig 2 IgG2a variable curve of Kunming strain
mice serum immunized with pcDNA3-AgB
n=10, P<0.05 vs pcDNA3 group;
○： pcDNA3; ●： pcDNA3-AgB
2.3 细胞因子IL-2，IL-4的检测结果 经用试剂盒测定，C57BL/6小鼠经pcDNA3-AgB 免疫后，IL-2的水平远远高于空载体对照组水平(P<0.01)，IL-4实验组水平与空载体对照组水平无显著差异(图3)。
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图 3 pcDNA3-AgB免疫C57 BL/6小鼠脾
细胞释放的细胞因子水平
Fig 3 Measurement of cytokines released from splenocytes
harvested from pcDNA3-AgB immunized C57 BL/6 mice
n=6, P<0.01 vs control group;
□： Control group; ■： Experimental group
2.4 脾细胞增殖反应 空载体对照组刺激指数为0.95±0.06,实验组刺激指数为2.15±0.11， 阳性对照ConA刺激指数为 3.05，表明实验组刺激指数明显高于空载体对照组(P<0.01)。
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2.5 相对保护率 仔猪经pcDNA3-AgB 免疫后的相对保护率为80%。
3 讨 论
猪囊虫病在我国广泛流行，该病不仅严重地危害人类的健康，也给养猪业带来了巨大的经济损失。为此，该病的防治一直是我国政府高度重视的课题。采用免疫接种技术来控制该病的流行被认为是最有效和简便易行的手段。核酸疫苗可在注射部位表达并进行有效的抗原提呈，从而激发机体全面的免疫应答。本研究将猪囊尾蚴副肌球蛋白核酸疫苗先在体外细胞中进行了表达,然后将其肌肉接种小鼠，在小鼠体内检测到了高水平的IgG，IgG2a和IL-2，说明该核酸疫苗可以诱导较强的体液免疫应答，而IgG2a，IL-2的水平精确地反映了脾细胞1型(Th1)免疫应答，它们是机体在接受MHCⅠ抗原提呈的过程中，辅助CTL启动细胞免疫的重要成分。IL-4反映Th2免疫应答。虽然本实验中检测到了一定量的IL-4水平，但其诱生量并不高，说明肌注核酸疫苗所诱发的免疫应答主要倾向于Th1型应答，这与文献报道一致[9]。空载体对照也产生了较高水平的IgG2a和一定水平的IgG，这可能是因为pcDNA3载体中存在免疫激活序列，即两个氨苄抗性基因5′-AACGTT-3′序列。免疫激活序列是以CpG为基元的6碱基DNA序列，其中5′端为两个嘌呤、3′端为两个嘧啶时效应最强。免疫激活序列可刺激B细胞活化和抗体的产生，并可刺激淋巴细胞分泌IL-12，IFN-γ和IL-6，其中IL-12和IFN-γ可以促进依赖于Th1的细胞免疫应答；而IL-6则可以进一步促进B细胞活化和抗体的分泌，但以促进细胞免疫为主[10]。副肌球蛋白核酸疫苗之所以刺激小鼠产生以Th1为主的免疫应答，除了上面CpG的原因外，还有可能是因为DNA疫苗免疫时没有同时接种传统的蛋白佐剂,因而大大降低了注射部位的炎症反应,这样可能便利了肌肉组织中一些特殊的抗原提呈细胞参与Th1型免疫应答。
, 百拇医药
Th细胞在引发细胞免疫和体液免疫中起着非常重要的作用。本实验中，用特异性抗原副肌球蛋白在体外刺激核酸疫苗免疫过的小鼠Th细胞，发现副肌球蛋白核酸疫苗组刺激指数明显高于空载体组刺激指数，说明Th细胞在体外能被该虫体蛋白特异性刺激增殖。在细胞因子的检测中，我们用ConA作为刺激因子，检测IL-2和IL-4的水平来反映淋巴细胞群在非特异性抗原刺激后的活化反应。实验结果表明，核酸疫苗免疫过的小鼠免疫系统处于高度活化的状态。
仔猪动物实验中,副肌球蛋白核酸疫苗对仔猪的相对保护率为80%,这表明该核酸疫苗具有较好的免疫保护性。本研究结果对进一步研究猪囊虫病的预防奠定了基础。
【基金项目】国家863计划资助项目(101-06-0504)
【作者简介】王庆敏(1973～)，女(汉族)，硕士生
【作者单位】王庆敏(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室，上海 200433)
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陈蕊雯(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室，上海 200433)
郭瀛军(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室，上海 200433)
孙树汉(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室，上海 200433)
参考文献
[1] Wolff JA, Malone RW, Williams P, et al. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo[J]. Science, 1990,247(4949 pt 1):1465-1468.
[2] 吴 丹，郭瀛军，孙树汉.猪囊尾蚴抗原与猪白细胞介素-4基因融合DNA疫苗载体的构建[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1999，17(3)：172-174.
, http://www.100md.com
[3] Landa A, Laclette JP, Nicholson-Weller A, et al. cDNA cloning and recombinant expression of collagen-binding and complement inhibitor activity of taenia solium paramyosin(AgB)[J]. Mol Biochem Parasitol，1993，60(2):343-348.
[4] Yang W, Waine GJ, McManus PD. Antibodies to Schistosoma japonicum (Asian blood fluke) paramyosin induced by nucleic acid vaccination[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1995，212(3):1029-1039.
[5] 王庆敏，戴建新，张平武等.猪囊尾蚴副肌球蛋白编码区的克隆[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2000,18(2)(in press).
, 百拇医药
[6] 萨姆布鲁克J, 弗里奇EF, 曼尼阿蒂斯T, 著. 金冬雁，黎孟枫 译. 分子克隆实验指南[M].第2版.北京：科学出版社，1992.15-30.
[7] 杨道锋，朱慧芬，李卓娅.细胞因子及其受体的检测.见：沈关心，周汝麟 主编.《现代免疫学实验技术》[M].湖北：湖北科学技术出版社，1998.258-265.
[8] Laclette JP， Merchant MT， Willms K. Histological and ultrastructrural localization of antigen B in the metacestode of taenia solium[J]. J Parasit, 1987,73(1):121-129.
[9] Raz E, Tighe H, Sato Y, et al. Preferential induction of a Th1 immune response and inhibition of specific IgE antibody formation by plasmid DNA immunization[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93(10):5141-5145.
[10] Klinman DM, Yamschikov G, Ishugatsubo Y. Contribution of CpG motifs to the immunogenicity DNA vaccines[J]. J Immunol,1997,158(8):3635-3639., 百拇医药
王庆敏 陈蕊雯 郭瀛军 孙树汉
摘 要 目的：研究猪囊尾蚴副肌球蛋白(AgB)核酸疫苗诱发的免疫应答。方法：将pcDNA3-AgB核酸疫苗肌注4～6周龄的昆明种小鼠，从2周后开始用ELISA方法检测小鼠体内IgG和IgG2a的水平。另外将该核酸疫苗注射C57BL/6小鼠，体外培养小鼠脾细胞，用刀豆蛋白A(ConA)和特异性抗原刺激，ELISA试剂盒检测细胞因子IL-2和IL-4的水平,并观察脾淋巴细胞增殖反应。另外,将该核酸疫苗肌注瘦型仔猪,进行攻击实验，计算相对保护率。结果：注射疫苗后的第3周起，IgG即为阳性，持续升高至第8周；从第2周起，小鼠血清IgG2a为阳性，第4周达到高峰。细胞因子检测表明，IL-2水平远远高于空载体对照组，而IL-4含量却与空载体对照组无显著差异；实验组刺激指数明显高于空载体对照组。副肌球蛋白核酸疫苗对仔猪的相对保护率为80%。结论：猪囊尾蚴副肌球蛋白核酸疫苗在小鼠动物实验中引发了以Th1型免疫应答占优势的全面免疫应答。pcDNA3-AgB核酸疫苗对仔猪具有较好的免疫保护性。
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关键词：猪囊尾蚴；副肌球蛋白；核酸类；疫苗；Th1免疫应答
核酸疫苗是20世纪90年代开始研究的一种免疫接种技术[1],它兼有亚单位疫苗的安全性和减毒灭活疫苗引发全面免疫应答等优点。目前，在动物实验中，已证实它有预防病毒、细菌、寄生虫感染,预防肿瘤等疾病的作用，而且它还有治疗的作用。猪囊虫病是世界上最重要的人畜共患病之一，传统的疫苗是利用虫体的粗提抗原制造的，但它存在一定的弊端。国内已有用核酸疫苗防治猪囊虫病研究的报道[2]。猪囊尾蚴副肌球蛋白(又名抗原B，AgB) 是扁形门寄生虫的一种保守性较强的抗原，它参与补体的调节反应[3]，也是有希望的疫苗候选抗原之一。有文献报道，虫体天然副肌球蛋白和重组蛋白部分片段均可在动物模型中产生很好的保护作用；另外将含有副肌球蛋白部分片段编码区的重组质粒接种BALB/c小鼠，在小鼠体内检测到了高水平的IgG[4],这表明该蛋白具有良好的免疫原性和免疫保护性。世界卫生组织已经将副肌球蛋白指定为疫苗候选抗原。我们在国内首次研究了猪囊尾蚴副肌球蛋白核酸疫苗的免疫保护性。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 质粒和菌种 核酸疫苗pcDNA3-AgB、重组蛋白由本室构建、表达[5，6]。
1.1.2 接种动物 雄性4～6周龄昆明种小鼠和C57BL/6小鼠，购自本校实验动物中心。仔猪由河南省新郑市养猪厂提供。
1.1.3 主要试剂 质粒制备试剂,TMB,BSA购自华舜生物公司；HRP-羊抗小鼠IgG购于华美生物工程公司；HRP-羊抗小鼠IgG2a及HRP-羊抗猪IgG购于晶美公司； 囊虫病病猪血清、囊尾蚴虫卵由河南省郑州市防疫站提供；IL-2，IL-4检测试剂盒购自凌雁科技公司。COS-7细胞由本室保存， ConA购于华舜生物公司。
1.2 方法
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1.2.1 核酸疫苗pcDNA3-AgB重组质粒的制备和纯化 质粒的制备和纯化具体步骤参照《分子克隆实验指南》[6]。
1.2.2 pcDNA3-AgB在COS-7细胞中的短暂表达及检测 利用电穿孔法将pcDNA3， pcDNA-AgB转染COS-7细胞，质粒DNA的量为40 μg，电压为250 V，电容为960 μF，详细方法参照《分子克隆实验指南》。72 h收获上清和细胞裂解液，用病猪血清、HRP-羊抗猪IgG检测表达情况。
1.2.3 小鼠的免疫接种 雄性昆明种小鼠20只，C57BL/6小鼠共12只，随机分为2组。一组肌注pcDNA3-AgB，另一组注射pcDNA3作为空载体对照。于小鼠胫骨前肌注射25%蔗糖100 μl，20 min后在原处注射核酸疫苗100 μl (1 μg/μl)，隔1周加强免疫1次。昆明种小鼠加强1次，C57BL/6小鼠加强2次。
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1.2.5 细胞因子的检测及脾细胞增殖反应 C57BL/6小鼠在末次免疫1周后拉颈处死，分离脾细胞，方法见《现代免疫学实验技术》[7]。脾细胞浓度为8×105个/ml，加入ConA使最终质量浓度为10 μg/ml，观察整体的免疫应答情况。将细胞置37℃ ，5% CO2温箱中培养48 h，收获上清测IL-2含量，72 h收获上清测IL-4含量。检测方法按试剂盒说明进行。另外，将脾细胞用终质量浓度为3 μg/ml虫体副肌球蛋白刺激,同时用10 μg/ml ConA刺激作为阳性对照。用MTT法计算刺激指数。
1.2.6 仔猪的免疫接种及攻击 10 d龄小猪共20头，随机分为2组，实验组接种pcDNA3-AgB，对照组接种pcDNA3。先于仔猪颈部肌肉注射25%的蔗糖1 ml，20 min后在原位注射核酸疫苗1 mg,两周后同样加强免疫2次。加强免疫1周后，经口喂入2×104个感染性虫卵/仔猪，虫卵攻击后90 d，剖检每一头仔猪并计算相对保护率。相对保护率公式如下：
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相对保护率(%)= [(对照组囊虫均数-实验组囊虫均数)/对照组囊虫均数]×100%
2 结 果
2.1 pcDNA3-AgB在 COS-7细胞中的表达 上清和细胞裂解液中均有该蛋白的表达，说明AgB为分泌性蛋白，这与文献报道一致[8]。 蛋白表达效价为1∶8,而pcDNA3转染的COS-7细胞未检测到蛋白表达。
2.2 核酸疫苗pcDNA3-AgB免疫小鼠后血清IgG，IgG2a水平 实验组免疫小鼠从末次免疫第3周起，特异性IgG为阳性，[D(450)值≥阴性对照D(450)值的2.1倍为阳性]并持续升高至第8周；从第2周起，小鼠血清中可检测到IgG2a，第4周达到高峰，空载体对照组IgG2a水平较高，IgG水平较低(图1，2)。
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图 1 pcDNA3-AgB核酸疫苗免疫
昆明种小鼠后血清中的IgG水平
Fig 1 IgG variable curve of Kunming strain
mice serum immunized with pcDNA3-AgB
n=10, P< 0.01 vs pcDNA3 group;
○： pcDNA3; ●： pcDNA3-AgB
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小鼠后血清中的IgG2a水平
Fig 2 IgG2a variable curve of Kunming strain
mice serum immunized with pcDNA3-AgB
n=10, P<0.05 vs pcDNA3 group;
○： pcDNA3; ●： pcDNA3-AgB
2.3 细胞因子IL-2，IL-4的检测结果 经用试剂盒测定，C57BL/6小鼠经pcDNA3-AgB 免疫后，IL-2的水平远远高于空载体对照组水平(P<0.01)，IL-4实验组水平与空载体对照组水平无显著差异(图3)。
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图 3 pcDNA3-AgB免疫C57 BL/6小鼠脾
细胞释放的细胞因子水平
Fig 3 Measurement of cytokines released from splenocytes
harvested from pcDNA3-AgB immunized C57 BL/6 mice
n=6, P<0.01 vs control group;
□： Control group; ■： Experimental group
2.4 脾细胞增殖反应 空载体对照组刺激指数为0.95±0.06,实验组刺激指数为2.15±0.11， 阳性对照ConA刺激指数为 3.05，表明实验组刺激指数明显高于空载体对照组(P<0.01)。
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2.5 相对保护率 仔猪经pcDNA3-AgB 免疫后的相对保护率为80%。
3 讨 论
猪囊虫病在我国广泛流行，该病不仅严重地危害人类的健康，也给养猪业带来了巨大的经济损失。为此，该病的防治一直是我国政府高度重视的课题。采用免疫接种技术来控制该病的流行被认为是最有效和简便易行的手段。核酸疫苗可在注射部位表达并进行有效的抗原提呈，从而激发机体全面的免疫应答。本研究将猪囊尾蚴副肌球蛋白核酸疫苗先在体外细胞中进行了表达,然后将其肌肉接种小鼠，在小鼠体内检测到了高水平的IgG，IgG2a和IL-2，说明该核酸疫苗可以诱导较强的体液免疫应答，而IgG2a，IL-2的水平精确地反映了脾细胞1型(Th1)免疫应答，它们是机体在接受MHCⅠ抗原提呈的过程中，辅助CTL启动细胞免疫的重要成分。IL-4反映Th2免疫应答。虽然本实验中检测到了一定量的IL-4水平，但其诱生量并不高，说明肌注核酸疫苗所诱发的免疫应答主要倾向于Th1型应答，这与文献报道一致[9]。空载体对照也产生了较高水平的IgG2a和一定水平的IgG，这可能是因为pcDNA3载体中存在免疫激活序列，即两个氨苄抗性基因5′-AACGTT-3′序列。免疫激活序列是以CpG为基元的6碱基DNA序列，其中5′端为两个嘌呤、3′端为两个嘧啶时效应最强。免疫激活序列可刺激B细胞活化和抗体的产生，并可刺激淋巴细胞分泌IL-12，IFN-γ和IL-6，其中IL-12和IFN-γ可以促进依赖于Th1的细胞免疫应答；而IL-6则可以进一步促进B细胞活化和抗体的分泌，但以促进细胞免疫为主[10]。副肌球蛋白核酸疫苗之所以刺激小鼠产生以Th1为主的免疫应答，除了上面CpG的原因外，还有可能是因为DNA疫苗免疫时没有同时接种传统的蛋白佐剂,因而大大降低了注射部位的炎症反应,这样可能便利了肌肉组织中一些特殊的抗原提呈细胞参与Th1型免疫应答。
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Th细胞在引发细胞免疫和体液免疫中起着非常重要的作用。本实验中，用特异性抗原副肌球蛋白在体外刺激核酸疫苗免疫过的小鼠Th细胞，发现副肌球蛋白核酸疫苗组刺激指数明显高于空载体组刺激指数，说明Th细胞在体外能被该虫体蛋白特异性刺激增殖。在细胞因子的检测中，我们用ConA作为刺激因子，检测IL-2和IL-4的水平来反映淋巴细胞群在非特异性抗原刺激后的活化反应。实验结果表明，核酸疫苗免疫过的小鼠免疫系统处于高度活化的状态。
仔猪动物实验中,副肌球蛋白核酸疫苗对仔猪的相对保护率为80%,这表明该核酸疫苗具有较好的免疫保护性。本研究结果对进一步研究猪囊虫病的预防奠定了基础。
【基金项目】国家863计划资助项目(101-06-0504)
【作者简介】王庆敏(1973～)，女(汉族)，硕士生
【作者单位】王庆敏(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室，上海 200433)
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陈蕊雯(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室，上海 200433)
郭瀛军(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室，上海 200433)
孙树汉(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室，上海 200433)
参考文献
[1] Wolff JA, Malone RW, Williams P, et al. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo[J]. Science, 1990,247(4949 pt 1):1465-1468.
[2] 吴 丹，郭瀛军，孙树汉.猪囊尾蚴抗原与猪白细胞介素-4基因融合DNA疫苗载体的构建[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1999，17(3)：172-174.
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[3] Landa A, Laclette JP, Nicholson-Weller A, et al. cDNA cloning and recombinant expression of collagen-binding and complement inhibitor activity of taenia solium paramyosin(AgB)[J]. Mol Biochem Parasitol，1993，60(2):343-348.
[4] Yang W, Waine GJ, McManus PD. Antibodies to Schistosoma japonicum (Asian blood fluke) paramyosin induced by nucleic acid vaccination[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1995，212(3):1029-1039.
[5] 王庆敏，戴建新，张平武等.猪囊尾蚴副肌球蛋白编码区的克隆[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2000,18(2)(in press).
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[6] 萨姆布鲁克J, 弗里奇EF, 曼尼阿蒂斯T, 著. 金冬雁，黎孟枫 译. 分子克隆实验指南[M].第2版.北京：科学出版社，1992.15-30.
[7] 杨道锋，朱慧芬，李卓娅.细胞因子及其受体的检测.见：沈关心，周汝麟 主编.《现代免疫学实验技术》[M].湖北：湖北科学技术出版社，1998.258-265.
[8] Laclette JP， Merchant MT， Willms K. Histological and ultrastructrural localization of antigen B in the metacestode of taenia solium[J]. J Parasit, 1987,73(1):121-129.
[9] Raz E, Tighe H, Sato Y, et al. Preferential induction of a Th1 immune response and inhibition of specific IgE antibody formation by plasmid DNA immunization[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93(10):5141-5145.
[10] Klinman DM, Yamschikov G, Ishugatsubo Y. Contribution of CpG motifs to the immunogenicity DNA vaccines[J]. J Immunol,1997,158(8):3635-3639., 百拇医药