新城疫病毒HN基因真核表达质粒的构建及其抗肿瘤作用的初步研究
新城疫病毒HN基因真核表达质粒的构建及其抗肿瘤作用的初步研究
魏林 戴建新 孙树汉
摘 要 目的：构建新城疫病毒(NDV)血凝素神经氨酸酶(HN)基因真核表达质粒，并初步探索其在抗肿瘤治疗中的机制及应用价值。 方法：用RT-PCR从NDV中克隆HN cDNA，并构建HN的真核表达载体，转染COS-7细胞表达。注射至小鼠B16黑素瘤模型，检测其抗肿瘤作用。 结果：成功地克隆了NDV HN cDNA，所构建的pcDNA3-HN有良好的表达，动物实验显示，pcDNA3-HN有增强荷瘤小鼠CTL，NK杀伤活性的作用。 结论：NDV HN的真核表达质粒具有增强荷瘤小鼠抗肿瘤CTL，NK 细胞反应的作用。
关键词：新城疫病毒；血凝素类，病毒；神经氨酸酶；抗肿瘤作用
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新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)具有诱导IFN，TNF，IL-2等多种细胞因子的作用[1，2]，将NDV或其包膜表面糖蛋白血凝素神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase， HN)转入或修饰肿瘤细胞(NDV-modified autologous tumor-cell vaccine, ATV-NDV)，经动物实验及临床应用均证明可以增强肿瘤特异性CD8+ T 淋巴细胞(CTL)，CD4+ T辅助淋巴细胞的活性[3～5]。本实验通过RT-PCR获取了NDV的HN基因,并构建了HN的真核表达质粒pcDNA3-HN。通过动物实验，初步探讨了肌注HN表达质粒所诱发的抗肿瘤免疫机制。
1 材料和方法
1.1 材料 新城疫病毒Lasota株、大肠杆菌DH5α均为本室保存。B16黑素瘤细胞、YAC-1细胞、COS-7 细胞，购自中科院细胞所。质粒 pGEM-T载体，反转录酶、LDH非放射性细胞毒检测试剂盒，购自Promage公司。 pcDNA3为本室保存。C57小鼠，雄性，6～8周龄，购自第二军医大学实验动物中心。限制性内切酶及T4 DNA连接酶均为Boeheringer公司产品。Taq DNA聚合酶为PE公司产品。胶回收试剂盒购自华舜公司。其他试剂均为分析纯。寡核苷酸引物系中科院植物生理研究所合成，引物序列为：P1 5′-GGATCCATGGACCGCGCCGTTAGCCAAG-3′。P25′-TCTAGACTAGCCAGACCTGCCTTCTCTA-3′。
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1.2 方法
1.2.1 病毒RNA的提取及RT-PCR合成HN cDNA 取血凝效价为1∶2 400的NDV鸡胚尿囊培养液0.5 ml，加入RNA抽提缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0, 100 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA , 0.5% SDS, 用前加入1 mg/ml蛋白酶K)0.5 ml， 37℃作用1 h，酚∶氯仿∶异戊醇=25∶ 24∶ 1抽提，无水乙醇沉淀RNA。 采用一步法进行反转录及扩增HN cDNA。37℃ 1 h反转录、94℃ 5 min预变性后，进入循环反应，条件为94℃ 1 min，52℃ 1 min，72℃ 2 min，35个循环。
1.2.2 HN cDNA的克隆及测序 回收大量扩增的长度为1.7 kb的PCR产物，与pGEM-T easy载体连接，酶切鉴定克隆方向，选取正向插入克隆，以SP6，T7及自行合成的两个序列为引物，测定HN cDNA全长序列。
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1.2.3 HN 真核表达载体pcDNA3-HN的构建及在COS-7细胞中的表达 pGEM-HN质粒经BamH Ⅰ，Xba Ⅰ双酶切后插入真核表达载体pcDNA3中同样的酶切位点，转化大肠杆菌DH5α，筛选克隆后酶切鉴定。用电穿孔的方法将pcDNA3-HN转入COS-7细胞(穿孔条件电容为960 μF，电压为250 V)，pcDNA3-HN 40 μg，COS-7细胞密度为1×107/ml。培养12 h后换液1次，48，72 h收取上清。同时设阴性对照，质粒为空载体pcDNA3，穿孔条件与上相同。血凝试验及血凝抑制试验检测表达产物及表达量。
1.2.4 动物实验及分组 将C57小鼠随机分为4 组，每组10 只。1组：荷瘤前后3 d各注射pcDNA3-HN 1次。2组：荷瘤后3,7 d各注射pcDNA3-HN 1次。3组：荷瘤后3,7 d各注射pcDNA3空载体1次。4组：未荷瘤正常小鼠。注射质粒方法：在小鼠左腿外侧肌肉预先注射25%高渗蔗糖，10 min后在相同部位注射100 μg 质粒。荷瘤方法：胰酶消化对数生长期B16细胞, 调节浓度为1×106个/ml, 每只小鼠背部皮下注射0.2 ml。
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1.2.5 小鼠脾淋巴细胞杀伤活性的检测 用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测各组的NK细胞、CTL细胞活性。小鼠荷瘤20 d处死，每组5只，取脾脏，分离脾单个核细胞，制备细胞悬液(1×107个/ml)。 将细胞分为两组，其一以YAC-1细胞为靶细胞，检测NK细胞活性。其二，首先以丝裂霉素C处理(50 μg/ml )的B16细胞及ConA(5 μg/ml )诱导，72 h后再以对数生长期B16细胞为靶细胞检测CTL活性。效靶细胞比例(E/T)均为50∶1，100∶1，效靶细胞共同孵育37℃ 5% CO2 4 h，取上清，按试剂盒说明加入LDH作用底物，30 min后终止反应，490 nm处读取D值，计算NK细胞，CTL细胞杀伤活性，计算公式如下：
杀伤活性(%)=[(实验孔D值-自然释放孔D值)/(最大释放孔D值-自然释放孔D值)]×100%
1.2.6 统计学处理 采用配对资料t检验。
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2 结 果
2.1 NDV HN基因的获取及pcDNA3-HN的构建 本实验以表达NDV HN蛋白为目的，故所设计的PCR引物包括了翻译起始密码及终止密码，并在5′-端分别引入BamH Ⅰ，Xba Ⅰ酶切位点，以抽提的病毒RNA为模板，进行RT-PCR，获得了大小为1.7 kb 的PCR产物(图1)。将其克隆至测序载体pGEM-T easy，自动测序仪测序，其序列与GeneBank上登录的一致。用BamH Ⅰ，Xba Ⅰ酶切pGEM-HN，回收1.7 kb片段，与pcDNA3载体上的相同酶切位点定向连接，经酶切鉴定，获得HN基因的真核表达重组质粒pcDNA3-HN(图2)。
图 1 RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳
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1： λDNA Hind Ⅲ/EcoRⅠ marker; 2： RT-PCR products;
3： Purification of RT-PCR products
图 2 pcDNA3-HN的酶切鉴定
Fig 2 Enzyme digestion of pcDNA3-HN
1: λDNA Hind Ⅲ/EcoRⅠ marker； 2,4： pcDNA3-HN;
3,5： Enzyme digestion of pcDNA3-HN
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2.2 pcDNA3-HN转染COS-7细胞、血凝试验检测表达情况 收集电穿孔转入质粒后48，72 h细胞培养上清，血凝试验检测,效价分别为1∶8及1∶32，用NDV多克隆抗体可以抑制此凝集反应，而转染pcDNA3对照细胞上清，血凝试验效价为0，表明pcDNA3-HN可表达其所编码的蛋白。
2.3 pcDNA3-HN对荷瘤小鼠皮下肿瘤生长的影响 小鼠荷瘤后约7 d，第3组小鼠皮下均可触及大小为100～300 mm2的结节，1组及2组只有个别小鼠可触及，用游标卡尺隔日测量瘤体大小显示：1组、2组小鼠肿瘤生长明显慢于3组(P<0.05，图3)
图 3 pcDNA3-HN治疗后荷瘤小鼠皮下肿瘤生长曲线
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Fig 3 Growth curve of subcutaneous tumor in tumor
bearing mice after therapy with pcDNA3-NH
○: Only tumor-bearing control;
□: Tumor-bearing after pcDNA3-NH injected;
△: Tumor-bearing meanwhile pcDNA3-HN injected
2.4 小鼠脾细胞NK及CTL活性 与正常小鼠(4组)相比，荷瘤后未治疗小鼠(3组)NK活性明显下降，而注射pcDNA3-HN组NK活性有不同程度的升高，尤其第1组，NK活性达到与正常小鼠相近的水平(图4)。统计学处理，1组与2，3组相比具有显著性差异(P< 0.01)。CTL活性也以1组升高明显(P<0.01)，2组与3组间未见明显差异，4组CTL活性几乎为零(图5)。
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图 4 NK细胞活性
Fig 4 NK cell activity
□： E/T=50∶1； ■： E/T=100∶1
E/T： effector/target; P<0.01 vs group 2 and 3
图 5 CTL细胞活性
Fig 5 CTL cell activity
□： E/T=50∶1； ■： E/T=100∶1
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E/T: Effector/target; P<0.01 vs group 3
3 讨 论
NDV是一种禽类单链RNA病毒，其RNA长度为15 kb，有 6个编码基因(3′-NP-P-M-F-HN-L-5′)。HN基因编码一相对分子质量为7.4×104的糖蛋白，表达在病毒包膜上,具有凝集红细胞及神经氨酸酶的活性,是NDV与宿主细胞表面的受体结合,继而进入细胞的关键因素,也是NDV的主要免疫成分。NDV对人体无感染性及毒副作用，七八十年代曾作为干扰素诱生剂被广泛应用[6]。近20年来，NDV的抗肿瘤作用屡见报道，首先是与卡介苗、短小棒状杆菌作为非特异免疫增强剂应用于动物实验及临床治疗[7]。Bohle等[4]用非溶瘤性NDV病毒株感染肿瘤细胞，获得了在肿瘤细胞膜上表达NDV HN抗原的瘤苗(NDV修饰瘤苗 ATV-NDV)，经动物实验表明，ATV-NDV成瘤性降低、瘤体局部细胞因子增加，尤其是参与肿瘤特异性CTL反应的IFNs增加，能有效地阻止肿瘤的微转移[8]。1997年，Schirrmacher等[9]报道，能诱导CTL反应的ATV-NDV仅要求肿瘤细胞表面有HN抗原表达或修饰，而与整个病毒对肿瘤细胞的感染无关，并且获得的CTL特异性只针对肿瘤细胞，由此引出了对ATV-NDV抗肿瘤作用机制的新的思考，推测NDV的HN蛋白表达于肿瘤细胞表面，可作为一种新的粘附分子，增进淋巴细胞与肿瘤细胞之间的接触反应。
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为了进一步探明NDV HN在增强特异性抗原诱导CTL反应中的作用机制， 本实验构建了表达NDV HN蛋白的真核表达重组质粒，通过转染COS-7细胞、血凝试验等手段，证明该质粒能良好地表达，并具有与鸡红细胞发生凝集的生物学特性。将该质粒应用于C57荷瘤小鼠，表明它有一定程度的抑制肿瘤生长的作用。检测荷瘤小鼠脾细胞的NK 及CTL活性，结果表明pcDNA3-HN具有增强荷瘤小鼠非特异及特异性抗肿瘤细胞免疫的作用，特别是1组作用尤为明显，这可能与疫苗种类及疫苗接种时间有关，核酸免疫不同于蛋白免疫，重组质粒进入体内后有一个表达产物的过程，小鼠荷瘤后大约3～7 d会触发机体的免疫反应(虽然肿瘤的免疫原性很低)，此时，预先注射 pcDNA3-HN 的小鼠体内已产生了HN蛋白，对小鼠的抗肿瘤免疫反应起到了有力的支持和加强作用。至于在何时注射pcDNA3-HN，NK活性及CTL活性能得到最大的提高，这是今后的工作中需要解决的问题。2组小鼠虽然也注射了pcDNA3-HN，但在荷瘤后3 d及7 d，此时小鼠的免疫应答能力已因荷瘤而明显减弱，因此无论NK活性，还是CTL活性与注射空载体均无明显差异。至于2组肿瘤生长明显慢于3组，这提示除了NK及CTL以外，尚有其他因素参与肿瘤核酸免疫。重组pcDNA3-HN是通过诱导细胞因子产生，进而强化细胞免疫，还是通过可能存在的粘附分子样作用特异地结合在肿瘤细胞表面，增强肿瘤细胞与淋巴细胞的接触反应？抑或两者兼而有之？这是我们进一步的研究中所要探讨的问题。
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致谢 本研究得到顾世成先生的资助。
【基金项目】国家863计划资助项目(101-06-0504)
【作者简介】魏林(1961～)，女(汉族)，博士生，副教授
【作者单位】魏林(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室，上海 200433)
戴建新(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室，上海 200433)
孙树汉(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室，上海 200433)
参考文献
[1] von Hoegen P, Zawatzky R, Schirrmacher V. Modification of tumor cells by a low dose of Newcastle disease virus. Ⅲ. Potentiation of tumor-specific cytolytic T cell activity via induction of interferon α/β [J]. Cell Immunol, 1990,126(1):80-90.
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[2] Schirrmacher V, Haas C, Bonifer R, et al. Human tumor cell modification by virus infection: an efficient and safe way to produce cancer vaccine with pleiotropic immune stimulatory properties when using Newcastle disease virus[J]. Gene Ther, 1999,6(1):63-73.
[3] Ockert D, Schirrmacher V, Beck N, et al. Newcastle disease virus-infected intact autologous tumor cell vaccine for adjuvant active specific immunotherapy of resected colorectal carcinoma[J]. Clin Cancer Res, 1996,2(1):21-28.
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[4] Bohle W, Schlag P, Liebrich W, et al. Postoperative active specific immunization in colorectal cancer patients with virus-modified autologous tumor-cell vaccine[J]. Cancer,1990,66(7):1517-1523.
[5] Mobus V, Horm S, Stock M, et al. Tumor cell vaccination for gynecological tumors[J]. Hybridoma, 1993,12(5):543-547.
[6] Fleischmann WR Jr, Kleyn KM, Baron S. Potentiation of antitumor effect of virus-induced interferon by mouse immune interferon preparations[J]. J Natl Cancer Inst, 1980, 65(5):963-966.
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[7] Csatary LK, Eckhardt S, Bukosza I, et al. Attenuated veterinary virus vaccine for the treatment of cancer[J]. Cancer Detect Prev, 1993,17(6):619-627.
[8] Plaksin D, Porgador A, Vadai E, et al. Effective antimetastatic melanoma vaccination with tumor cells transfected with MHC genes and/or infected with Newcastle disease virus (NDV)[J]. Int J Cancer, 1994,59(6):796-801.
[9] Schirrmacher V, Haas C, Bonifer R, et al. Virus potentiation of tumor vaccine T-cell stimulatory capacity requires cell surface binding but not infection[J]. Clin Cancer Res, 1997,3(7):1135-1148., 百拇医药
魏林 戴建新 孙树汉
摘 要 目的：构建新城疫病毒(NDV)血凝素神经氨酸酶(HN)基因真核表达质粒，并初步探索其在抗肿瘤治疗中的机制及应用价值。 方法：用RT-PCR从NDV中克隆HN cDNA，并构建HN的真核表达载体，转染COS-7细胞表达。注射至小鼠B16黑素瘤模型，检测其抗肿瘤作用。 结果：成功地克隆了NDV HN cDNA，所构建的pcDNA3-HN有良好的表达，动物实验显示，pcDNA3-HN有增强荷瘤小鼠CTL，NK杀伤活性的作用。 结论：NDV HN的真核表达质粒具有增强荷瘤小鼠抗肿瘤CTL，NK 细胞反应的作用。
关键词：新城疫病毒；血凝素类，病毒；神经氨酸酶；抗肿瘤作用
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新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)具有诱导IFN，TNF，IL-2等多种细胞因子的作用[1，2]，将NDV或其包膜表面糖蛋白血凝素神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase， HN)转入或修饰肿瘤细胞(NDV-modified autologous tumor-cell vaccine, ATV-NDV)，经动物实验及临床应用均证明可以增强肿瘤特异性CD8+ T 淋巴细胞(CTL)，CD4+ T辅助淋巴细胞的活性[3～5]。本实验通过RT-PCR获取了NDV的HN基因,并构建了HN的真核表达质粒pcDNA3-HN。通过动物实验，初步探讨了肌注HN表达质粒所诱发的抗肿瘤免疫机制。
1 材料和方法
1.1 材料 新城疫病毒Lasota株、大肠杆菌DH5α均为本室保存。B16黑素瘤细胞、YAC-1细胞、COS-7 细胞，购自中科院细胞所。质粒 pGEM-T载体，反转录酶、LDH非放射性细胞毒检测试剂盒，购自Promage公司。 pcDNA3为本室保存。C57小鼠，雄性，6～8周龄，购自第二军医大学实验动物中心。限制性内切酶及T4 DNA连接酶均为Boeheringer公司产品。Taq DNA聚合酶为PE公司产品。胶回收试剂盒购自华舜公司。其他试剂均为分析纯。寡核苷酸引物系中科院植物生理研究所合成，引物序列为：P1 5′-GGATCCATGGACCGCGCCGTTAGCCAAG-3′。P25′-TCTAGACTAGCCAGACCTGCCTTCTCTA-3′。
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1.2 方法
1.2.1 病毒RNA的提取及RT-PCR合成HN cDNA 取血凝效价为1∶2 400的NDV鸡胚尿囊培养液0.5 ml，加入RNA抽提缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0, 100 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA , 0.5% SDS, 用前加入1 mg/ml蛋白酶K)0.5 ml， 37℃作用1 h，酚∶氯仿∶异戊醇=25∶ 24∶ 1抽提，无水乙醇沉淀RNA。 采用一步法进行反转录及扩增HN cDNA。37℃ 1 h反转录、94℃ 5 min预变性后，进入循环反应，条件为94℃ 1 min，52℃ 1 min，72℃ 2 min，35个循环。
1.2.2 HN cDNA的克隆及测序 回收大量扩增的长度为1.7 kb的PCR产物，与pGEM-T easy载体连接，酶切鉴定克隆方向，选取正向插入克隆，以SP6，T7及自行合成的两个序列为引物，测定HN cDNA全长序列。
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1.2.3 HN 真核表达载体pcDNA3-HN的构建及在COS-7细胞中的表达 pGEM-HN质粒经BamH Ⅰ，Xba Ⅰ双酶切后插入真核表达载体pcDNA3中同样的酶切位点，转化大肠杆菌DH5α，筛选克隆后酶切鉴定。用电穿孔的方法将pcDNA3-HN转入COS-7细胞(穿孔条件电容为960 μF，电压为250 V)，pcDNA3-HN 40 μg，COS-7细胞密度为1×107/ml。培养12 h后换液1次，48，72 h收取上清。同时设阴性对照，质粒为空载体pcDNA3，穿孔条件与上相同。血凝试验及血凝抑制试验检测表达产物及表达量。
1.2.4 动物实验及分组 将C57小鼠随机分为4 组，每组10 只。1组：荷瘤前后3 d各注射pcDNA3-HN 1次。2组：荷瘤后3,7 d各注射pcDNA3-HN 1次。3组：荷瘤后3,7 d各注射pcDNA3空载体1次。4组：未荷瘤正常小鼠。注射质粒方法：在小鼠左腿外侧肌肉预先注射25%高渗蔗糖，10 min后在相同部位注射100 μg 质粒。荷瘤方法：胰酶消化对数生长期B16细胞, 调节浓度为1×106个/ml, 每只小鼠背部皮下注射0.2 ml。
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1.2.5 小鼠脾淋巴细胞杀伤活性的检测 用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测各组的NK细胞、CTL细胞活性。小鼠荷瘤20 d处死，每组5只，取脾脏，分离脾单个核细胞，制备细胞悬液(1×107个/ml)。 将细胞分为两组，其一以YAC-1细胞为靶细胞，检测NK细胞活性。其二，首先以丝裂霉素C处理(50 μg/ml )的B16细胞及ConA(5 μg/ml )诱导，72 h后再以对数生长期B16细胞为靶细胞检测CTL活性。效靶细胞比例(E/T)均为50∶1，100∶1，效靶细胞共同孵育37℃ 5% CO2 4 h，取上清，按试剂盒说明加入LDH作用底物，30 min后终止反应，490 nm处读取D值，计算NK细胞，CTL细胞杀伤活性，计算公式如下：
杀伤活性(%)=[(实验孔D值-自然释放孔D值)/(最大释放孔D值-自然释放孔D值)]×100%
1.2.6 统计学处理 采用配对资料t检验。
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2 结 果
2.1 NDV HN基因的获取及pcDNA3-HN的构建 本实验以表达NDV HN蛋白为目的，故所设计的PCR引物包括了翻译起始密码及终止密码，并在5′-端分别引入BamH Ⅰ，Xba Ⅰ酶切位点，以抽提的病毒RNA为模板，进行RT-PCR，获得了大小为1.7 kb 的PCR产物(图1)。将其克隆至测序载体pGEM-T easy，自动测序仪测序，其序列与GeneBank上登录的一致。用BamH Ⅰ，Xba Ⅰ酶切pGEM-HN，回收1.7 kb片段，与pcDNA3载体上的相同酶切位点定向连接，经酶切鉴定，获得HN基因的真核表达重组质粒pcDNA3-HN(图2)。
图 1 RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳
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1： λDNA Hind Ⅲ/EcoRⅠ marker; 2： RT-PCR products;
3： Purification of RT-PCR products
图 2 pcDNA3-HN的酶切鉴定
Fig 2 Enzyme digestion of pcDNA3-HN
1: λDNA Hind Ⅲ/EcoRⅠ marker； 2,4： pcDNA3-HN;
3,5： Enzyme digestion of pcDNA3-HN
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2.2 pcDNA3-HN转染COS-7细胞、血凝试验检测表达情况 收集电穿孔转入质粒后48，72 h细胞培养上清，血凝试验检测,效价分别为1∶8及1∶32，用NDV多克隆抗体可以抑制此凝集反应，而转染pcDNA3对照细胞上清，血凝试验效价为0，表明pcDNA3-HN可表达其所编码的蛋白。
2.3 pcDNA3-HN对荷瘤小鼠皮下肿瘤生长的影响 小鼠荷瘤后约7 d，第3组小鼠皮下均可触及大小为100～300 mm2的结节，1组及2组只有个别小鼠可触及，用游标卡尺隔日测量瘤体大小显示：1组、2组小鼠肿瘤生长明显慢于3组(P<0.05，图3)
图 3 pcDNA3-HN治疗后荷瘤小鼠皮下肿瘤生长曲线
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Fig 3 Growth curve of subcutaneous tumor in tumor
bearing mice after therapy with pcDNA3-NH
○: Only tumor-bearing control;
□: Tumor-bearing after pcDNA3-NH injected;
△: Tumor-bearing meanwhile pcDNA3-HN injected
2.4 小鼠脾细胞NK及CTL活性 与正常小鼠(4组)相比，荷瘤后未治疗小鼠(3组)NK活性明显下降，而注射pcDNA3-HN组NK活性有不同程度的升高，尤其第1组，NK活性达到与正常小鼠相近的水平(图4)。统计学处理，1组与2，3组相比具有显著性差异(P< 0.01)。CTL活性也以1组升高明显(P<0.01)，2组与3组间未见明显差异，4组CTL活性几乎为零(图5)。
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图 4 NK细胞活性
Fig 4 NK cell activity
□： E/T=50∶1； ■： E/T=100∶1
E/T： effector/target; P<0.01 vs group 2 and 3
图 5 CTL细胞活性
Fig 5 CTL cell activity
□： E/T=50∶1； ■： E/T=100∶1
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E/T: Effector/target; P<0.01 vs group 3
3 讨 论
NDV是一种禽类单链RNA病毒，其RNA长度为15 kb，有 6个编码基因(3′-NP-P-M-F-HN-L-5′)。HN基因编码一相对分子质量为7.4×104的糖蛋白，表达在病毒包膜上,具有凝集红细胞及神经氨酸酶的活性,是NDV与宿主细胞表面的受体结合,继而进入细胞的关键因素,也是NDV的主要免疫成分。NDV对人体无感染性及毒副作用，七八十年代曾作为干扰素诱生剂被广泛应用[6]。近20年来，NDV的抗肿瘤作用屡见报道，首先是与卡介苗、短小棒状杆菌作为非特异免疫增强剂应用于动物实验及临床治疗[7]。Bohle等[4]用非溶瘤性NDV病毒株感染肿瘤细胞，获得了在肿瘤细胞膜上表达NDV HN抗原的瘤苗(NDV修饰瘤苗 ATV-NDV)，经动物实验表明，ATV-NDV成瘤性降低、瘤体局部细胞因子增加，尤其是参与肿瘤特异性CTL反应的IFNs增加，能有效地阻止肿瘤的微转移[8]。1997年，Schirrmacher等[9]报道，能诱导CTL反应的ATV-NDV仅要求肿瘤细胞表面有HN抗原表达或修饰，而与整个病毒对肿瘤细胞的感染无关，并且获得的CTL特异性只针对肿瘤细胞，由此引出了对ATV-NDV抗肿瘤作用机制的新的思考，推测NDV的HN蛋白表达于肿瘤细胞表面，可作为一种新的粘附分子，增进淋巴细胞与肿瘤细胞之间的接触反应。
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为了进一步探明NDV HN在增强特异性抗原诱导CTL反应中的作用机制， 本实验构建了表达NDV HN蛋白的真核表达重组质粒，通过转染COS-7细胞、血凝试验等手段，证明该质粒能良好地表达，并具有与鸡红细胞发生凝集的生物学特性。将该质粒应用于C57荷瘤小鼠，表明它有一定程度的抑制肿瘤生长的作用。检测荷瘤小鼠脾细胞的NK 及CTL活性，结果表明pcDNA3-HN具有增强荷瘤小鼠非特异及特异性抗肿瘤细胞免疫的作用，特别是1组作用尤为明显，这可能与疫苗种类及疫苗接种时间有关，核酸免疫不同于蛋白免疫，重组质粒进入体内后有一个表达产物的过程，小鼠荷瘤后大约3～7 d会触发机体的免疫反应(虽然肿瘤的免疫原性很低)，此时，预先注射 pcDNA3-HN 的小鼠体内已产生了HN蛋白，对小鼠的抗肿瘤免疫反应起到了有力的支持和加强作用。至于在何时注射pcDNA3-HN，NK活性及CTL活性能得到最大的提高，这是今后的工作中需要解决的问题。2组小鼠虽然也注射了pcDNA3-HN，但在荷瘤后3 d及7 d，此时小鼠的免疫应答能力已因荷瘤而明显减弱，因此无论NK活性，还是CTL活性与注射空载体均无明显差异。至于2组肿瘤生长明显慢于3组，这提示除了NK及CTL以外，尚有其他因素参与肿瘤核酸免疫。重组pcDNA3-HN是通过诱导细胞因子产生，进而强化细胞免疫，还是通过可能存在的粘附分子样作用特异地结合在肿瘤细胞表面，增强肿瘤细胞与淋巴细胞的接触反应？抑或两者兼而有之？这是我们进一步的研究中所要探讨的问题。
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致谢 本研究得到顾世成先生的资助。
【基金项目】国家863计划资助项目(101-06-0504)
【作者简介】魏林(1961～)，女(汉族)，博士生，副教授
【作者单位】魏林(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室，上海 200433)
戴建新(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室，上海 200433)
孙树汉(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室，上海 200433)
参考文献
[1] von Hoegen P, Zawatzky R, Schirrmacher V. Modification of tumor cells by a low dose of Newcastle disease virus. Ⅲ. Potentiation of tumor-specific cytolytic T cell activity via induction of interferon α/β [J]. Cell Immunol, 1990,126(1):80-90.
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[2] Schirrmacher V, Haas C, Bonifer R, et al. Human tumor cell modification by virus infection: an efficient and safe way to produce cancer vaccine with pleiotropic immune stimulatory properties when using Newcastle disease virus[J]. Gene Ther, 1999,6(1):63-73.
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