聚合酶链反应和改良抗酸染色诊断L型结核杆菌感染
聚合酶链反应和改良抗酸染色诊断L型结核杆菌感染
邹菊贤 刘茂贤 齐为民 郭天程 金发光
摘 要: 目的 探讨L型抗酸菌的IK染色和PCR检测的临床应用价值. 方法 采用IK染色和PCR技术，对结核病患者(35例)、非特异性淋巴结炎患者(30例)和正常胎儿(10例)的石蜡切片进行对比研究. 结果 两种方法(PCR和IK染色)对上述3组75例的检测阳性率分别为80%,83%；67%,60%及0%. 结论 PCR技术及IK染色，检测抗酸菌L型的阳性率及灵敏度均较高.
关键词:结核病；诊断；PCR；L-型
0 引言
结核菌在抗生素、抗体、补体和溶菌酶等体内外因素的作用下，其细胞壁可部分或完全性缺陷形成L型菌,其感染性淋巴结炎通常失去原菌感染引起的典型病变特征，仅表现为非特异性淋巴结炎的病理改变[1]. 为此，我们对75例(其中结核病患者35例，非特异性淋巴结炎30例，正常胎儿10例)切片以改良抗酸染色(intensifed kinyoun ,IK)[1]和PCR扩增分别进行了检测，以探讨其诊断价值.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 实验组标本：65例，其中结核病患者35例(包括：肺、淋巴、腰椎、肾和其他结核病患者)，非特异性淋巴结炎患者30例. 正常对照组10例，均为正常胎儿. 以上75例的石蜡切片，为1990/1994年空军南京医院、解放军451医院和本院病理科取材后制备.
1.2 方法
1.2.1 IK改良抗酸染色 DNA提取：石蜡切片(厚4～5 μm)各5张于Eppendorf管内分别做IK改良抗酸染色与PCR. 每一蜡块切完后，为避免交叉污染，均用二甲苯擦洗刀和镊子. 改良抗酸染色法：所用的石蜡切片经脱蜡、水洗后、置石碳酸品红液中(临用前加吐温80℃ 0.1 mL)浸泡24 h. 水洗后用5 mL.L-1盐酸乙醇退色、水洗. 1 g.L-1美蓝液复染30 s，水洗、脱水、透明、中性树胶封片. 结果判断：抗酸菌呈短杆状、亮红色或紫红色，而L型呈多形性：有原生小体(直径约为0.05～0.5 μm),圆球体(直径1 μm左右)，巨形体(直径1.5～50 μm)及长丝体(长短差异较大)等. 结果报告可为阳性或阴性；PCR结核菌DNA的提取按文献[2]的方法略加改进. 取装有石蜡切片的Ependorf管，加入二甲苯脱蜡30 min，以16 000 g高速离心5 min,弃上清，沉淀加入适量无水乙醇，翻转混匀，同上离心；加入丙酮3滴，50℃水溶敞盖蒸发干燥，加入消化酶缓冲液，55℃ 3 h，短时离心，97℃ 8～10 min灭活，除沉淀，离心，取上清-20℃保存备用. 正常对照组织切片同上处理提取备用.
, 百拇医药
1.2.2 结核患者DNA检测分析 取提取之模板DNA 3 μL加入25 μL反应混合Eppendorf管(单人单管)中(由全军基因诊断技术研究所提供)，Thermolyne Co,Amplitron Ⅱ仪上进行PCR扩增，即94℃ 30 s，55℃ 50 s，72℃ 40 s，循环38次，72℃延伸5 min. 扩增的靶DNA是结核分枝杆菌群特异的MPB64蛋白编码基因片段[3]，其引物序列为5′-GCTCTCGGGAGTCTAGGC CA-3′和5′-TCCGCTGCCAGTCGTCTTCC-3′, 240 bp (nts460～700)，(由上海复旦大学遗传研究所合成并提供)；消化酶缓冲液，试剂盒等(由本校全军基因诊断技术研究所提供). 取10 μL扩增液，常规20 g.L-1琼脂糖凝胶(含EB 0.5 mg.L-1),电压60 V，1×TAE缓冲液中电泳15 min，置反射透射紫外灯下观察结果，扩增片段若在240 bp处出现橙黄色带者即为阳性. 阳性对照(标准人型结核杆菌DNA)和阴性对照为试剂混合反应液(不含模板，含3 μL无菌双蒸馏水)与标本模板同样条件下扩增.
, 百拇医药
2 结果
2.1 IK改良抗酸染色结果 结核病患者35例中，检出杆菌型抗酸菌2例，L型2例，其中有2例同时检出了杆菌型和L型. 非特异性淋巴结炎患者组30例中，检出L型抗酸菌20例.
2.2 PCR检测结果 结核病患者35例中，阳性29例；30例非特异性淋巴结炎患者中，PCR阳性18例. 正常胎儿组织10例IK染色与PCR检测均为阴性. 两组实验间用两种方法检出的阳性率无显著性差异(P>0.05,Tab 1,Fig 1).
表 1 IK染色和PCR检测结核杆菌感染结果
Tab 1 Detection results of IK staining and PCR checkout
for tubercle bacillus infection (n,%)
, 百拇医药
Group
n
IK staining
PCR
Bacillus
L-form
Tuberclosis
35
2(6)
28 (80)
29 (83)
Non-specific
, 百拇医药
Lymphadentitis
30
0(0)
20 (67)
18 (60)
Normal
10
0(0)
0 ( 0)
0 ( 0)
图 1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
Fig 1 Agarose gel electrophoresis of PCR product
, 百拇医药
1:The standard thing of DNA molecular weight;
2,3:Tuberculosis groups;4,5:Lymphnoditis;
6:Positive contrast(standard man model tubercle bacill DNA);
7:Negative contrast.
对其中的20例组织标本(结核病组10例,8例阳性;非特异性淋巴结炎组10例,9例阳性),以上述两种方法重复检测,两次结果基本一致(结核病组10例,8例阳性;非特异性淋巴结炎组10例,9例阳性).
3 讨论
3.1 IK染色检测临床意义 本结果表明，IK染色对病理证实的结核病和非特异性淋巴结炎组织中抗酸菌L型的敏感性和特异性分别为80%(28/35)和67%(20/30),总检出率为73%(48/65). L型抗酸菌主要分布于巨噬细胞内，其细胞体积明显增大，胞质内含有大小不等的圆球体、长丝体或巨形体等，且常集聚成堆，亦可散在性分布. 有研究发现，在慢性病性灶内结核杆菌以L型为主[1]，淋巴结炎患者组30例中，L型抗酸菌的检出率高达67%，说明这种方法有助于提高结核病的病原学诊断率，并有利于结核病与其他肉芽肿性疾病的鉴别.
, 百拇医药
3.2 PCR的临床检测意义 对经病理证实的结核病患者(35例)，非特异性淋巴结炎患者(30例)，用PCR检测的敏感性和特异性分别为83%(29/35)和60%(18/30)，总检出率为72%(47/65). 若以IK染色结果作为判断L型抗酸菌的标准，PCR技术诊断L型抗酸菌的敏感性高达98%(47/48). 因此，对病理改变不典型的结核病患者(如非特异性淋巴结炎患者组)，应用PCR技术，可从半数以上的组织中检出了结核杆菌DNA(绝大多数为抗酸菌L型). 该组患者临床上多怀疑为淋巴结核而进行活组织检查，但病理诊断却为非特异性淋巴结炎. 若不进行PCR检测常被误诊. 提示，及对病理不典型的结核患者的组织标本，均应同时进行PCR检测，以减少漏诊.
作者简介:邹菊贤(1953-)，女(汉族)，陕西省咸阳市人. 主管技师，已发表论文14篇，参编专著1部. Tel.(029)3514246(H)
邹菊贤(第四军医大学唐都医院检验科， 陕西 西安 710038)
, http://www.100md.com
刘茂贤(第四军医大学唐都医院检验科， 陕西 西安 710038)
齐为民(第四军医大学唐都医院检验科， 陕西 西安 710038)
郭天程(解放军451医院)
金发光(第四军医大学唐都医院检验科， 陕西 西安 710038)
参考文献:
[1] 张世馥，姚 敏，洪先知et al. 抗酸菌L型感染病理和临床误诊的研究[J]. 中华结核和呼吸杂志，1994；17(3)：159-161.
[2] 林万明. PCR技术操作和应用指南[M]. 北京:人民军医出版社，1993：37-38.
[3] Manjunath N, Shanker P, Rajan L et al. Evalution of a polymerase chain reaction for the diagnosis of tuberculosis[J]. Tubercle, 1991;72(1):21-27., 百拇医药
邹菊贤 刘茂贤 齐为民 郭天程 金发光
摘 要: 目的 探讨L型抗酸菌的IK染色和PCR检测的临床应用价值. 方法 采用IK染色和PCR技术，对结核病患者(35例)、非特异性淋巴结炎患者(30例)和正常胎儿(10例)的石蜡切片进行对比研究. 结果 两种方法(PCR和IK染色)对上述3组75例的检测阳性率分别为80%,83%；67%,60%及0%. 结论 PCR技术及IK染色，检测抗酸菌L型的阳性率及灵敏度均较高.
关键词:结核病；诊断；PCR；L-型
0 引言
结核菌在抗生素、抗体、补体和溶菌酶等体内外因素的作用下，其细胞壁可部分或完全性缺陷形成L型菌,其感染性淋巴结炎通常失去原菌感染引起的典型病变特征，仅表现为非特异性淋巴结炎的病理改变[1]. 为此，我们对75例(其中结核病患者35例，非特异性淋巴结炎30例，正常胎儿10例)切片以改良抗酸染色(intensifed kinyoun ,IK)[1]和PCR扩增分别进行了检测，以探讨其诊断价值.
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1 材料和方法
1.1 材料 实验组标本：65例，其中结核病患者35例(包括：肺、淋巴、腰椎、肾和其他结核病患者)，非特异性淋巴结炎患者30例. 正常对照组10例，均为正常胎儿. 以上75例的石蜡切片，为1990/1994年空军南京医院、解放军451医院和本院病理科取材后制备.
1.2 方法
1.2.1 IK改良抗酸染色 DNA提取：石蜡切片(厚4～5 μm)各5张于Eppendorf管内分别做IK改良抗酸染色与PCR. 每一蜡块切完后，为避免交叉污染，均用二甲苯擦洗刀和镊子. 改良抗酸染色法：所用的石蜡切片经脱蜡、水洗后、置石碳酸品红液中(临用前加吐温80℃ 0.1 mL)浸泡24 h. 水洗后用5 mL.L-1盐酸乙醇退色、水洗. 1 g.L-1美蓝液复染30 s，水洗、脱水、透明、中性树胶封片. 结果判断：抗酸菌呈短杆状、亮红色或紫红色，而L型呈多形性：有原生小体(直径约为0.05～0.5 μm),圆球体(直径1 μm左右)，巨形体(直径1.5～50 μm)及长丝体(长短差异较大)等. 结果报告可为阳性或阴性；PCR结核菌DNA的提取按文献[2]的方法略加改进. 取装有石蜡切片的Ependorf管，加入二甲苯脱蜡30 min，以16 000 g高速离心5 min,弃上清，沉淀加入适量无水乙醇，翻转混匀，同上离心；加入丙酮3滴，50℃水溶敞盖蒸发干燥，加入消化酶缓冲液，55℃ 3 h，短时离心，97℃ 8～10 min灭活，除沉淀，离心，取上清-20℃保存备用. 正常对照组织切片同上处理提取备用.
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1.2.2 结核患者DNA检测分析 取提取之模板DNA 3 μL加入25 μL反应混合Eppendorf管(单人单管)中(由全军基因诊断技术研究所提供)，Thermolyne Co,Amplitron Ⅱ仪上进行PCR扩增，即94℃ 30 s，55℃ 50 s，72℃ 40 s，循环38次，72℃延伸5 min. 扩增的靶DNA是结核分枝杆菌群特异的MPB64蛋白编码基因片段[3]，其引物序列为5′-GCTCTCGGGAGTCTAGGC CA-3′和5′-TCCGCTGCCAGTCGTCTTCC-3′, 240 bp (nts460～700)，(由上海复旦大学遗传研究所合成并提供)；消化酶缓冲液，试剂盒等(由本校全军基因诊断技术研究所提供). 取10 μL扩增液，常规20 g.L-1琼脂糖凝胶(含EB 0.5 mg.L-1),电压60 V，1×TAE缓冲液中电泳15 min，置反射透射紫外灯下观察结果，扩增片段若在240 bp处出现橙黄色带者即为阳性. 阳性对照(标准人型结核杆菌DNA)和阴性对照为试剂混合反应液(不含模板，含3 μL无菌双蒸馏水)与标本模板同样条件下扩增.
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2 结果
2.1 IK改良抗酸染色结果 结核病患者35例中，检出杆菌型抗酸菌2例，L型2例，其中有2例同时检出了杆菌型和L型. 非特异性淋巴结炎患者组30例中，检出L型抗酸菌20例.
2.2 PCR检测结果 结核病患者35例中，阳性29例；30例非特异性淋巴结炎患者中，PCR阳性18例. 正常胎儿组织10例IK染色与PCR检测均为阴性. 两组实验间用两种方法检出的阳性率无显著性差异(P>0.05,Tab 1,Fig 1).
表 1 IK染色和PCR检测结核杆菌感染结果
Tab 1 Detection results of IK staining and PCR checkout
for tubercle bacillus infection (n,%)
, 百拇医药
Group
n
IK staining
PCR
Bacillus
L-form
Tuberclosis
35
2(6)
28 (80)
29 (83)
Non-specific
, 百拇医药
Lymphadentitis
30
0(0)
20 (67)
18 (60)
Normal
10
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0 ( 0)
图 1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
Fig 1 Agarose gel electrophoresis of PCR product
, 百拇医药
1:The standard thing of DNA molecular weight;
2,3:Tuberculosis groups;4,5:Lymphnoditis;
6:Positive contrast(standard man model tubercle bacill DNA);
7:Negative contrast.
对其中的20例组织标本(结核病组10例,8例阳性;非特异性淋巴结炎组10例,9例阳性),以上述两种方法重复检测,两次结果基本一致(结核病组10例,8例阳性;非特异性淋巴结炎组10例,9例阳性).
3 讨论
3.1 IK染色检测临床意义 本结果表明，IK染色对病理证实的结核病和非特异性淋巴结炎组织中抗酸菌L型的敏感性和特异性分别为80%(28/35)和67%(20/30),总检出率为73%(48/65). L型抗酸菌主要分布于巨噬细胞内，其细胞体积明显增大，胞质内含有大小不等的圆球体、长丝体或巨形体等，且常集聚成堆，亦可散在性分布. 有研究发现，在慢性病性灶内结核杆菌以L型为主[1]，淋巴结炎患者组30例中，L型抗酸菌的检出率高达67%，说明这种方法有助于提高结核病的病原学诊断率，并有利于结核病与其他肉芽肿性疾病的鉴别.
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3.2 PCR的临床检测意义 对经病理证实的结核病患者(35例)，非特异性淋巴结炎患者(30例)，用PCR检测的敏感性和特异性分别为83%(29/35)和60%(18/30)，总检出率为72%(47/65). 若以IK染色结果作为判断L型抗酸菌的标准，PCR技术诊断L型抗酸菌的敏感性高达98%(47/48). 因此，对病理改变不典型的结核病患者(如非特异性淋巴结炎患者组)，应用PCR技术，可从半数以上的组织中检出了结核杆菌DNA(绝大多数为抗酸菌L型). 该组患者临床上多怀疑为淋巴结核而进行活组织检查，但病理诊断却为非特异性淋巴结炎. 若不进行PCR检测常被误诊. 提示，及对病理不典型的结核患者的组织标本，均应同时进行PCR检测，以减少漏诊.
作者简介:邹菊贤(1953-)，女(汉族)，陕西省咸阳市人. 主管技师，已发表论文14篇，参编专著1部. Tel.(029)3514246(H)
邹菊贤(第四军医大学唐都医院检验科， 陕西 西安 710038)
, http://www.100md.com
刘茂贤(第四军医大学唐都医院检验科， 陕西 西安 710038)
齐为民(第四军医大学唐都医院检验科， 陕西 西安 710038)
郭天程(解放军451医院)
金发光(第四军医大学唐都医院检验科， 陕西 西安 710038)
参考文献:
[1] 张世馥，姚 敏，洪先知et al. 抗酸菌L型感染病理和临床误诊的研究[J]. 中华结核和呼吸杂志，1994；17(3)：159-161.
[2] 林万明. PCR技术操作和应用指南[M]. 北京:人民军医出版社，1993：37-38.
[3] Manjunath N, Shanker P, Rajan L et al. Evalution of a polymerase chain reaction for the diagnosis of tuberculosis[J]. Tubercle, 1991;72(1):21-27., 百拇医药