人精子与外周血淋巴细胞染色体着丝粒点的对比研究
蔡敏 厉广坤 童跃先 周利民 鄢采芹 曾维三
关键词：精子；外周血淋巴细胞；染色体着丝粒点 染色体着丝粒点(centromeric dots,Cd)结构研究从80年代初，Moroi等[1]发现硬皮病患者血清中存在自身抗着丝粒点抗体(ACA)，从而建立Cd结构的免疫荧光技术。目前国内外已有近30余篇有关Cd结构的研究报道[2-7]。然而，这部分研究均以体细胞为对象，尚未见正常男性精子染色体Cd结构的研究报道。我们对正常男性精子和外周血淋巴细胞染色体Cd结构进行分析和比较研究，探讨Cd结构变化在体细胞和生殖细胞是否一致，从而从一个侧面完善对着丝粒点的研究。
1 材料与方法
1.1 实验材料 人精子与外周血淋巴细胞取自15名近期无致畸因素接触史、已生育正常后代的健康男性，年龄25～55岁。鼠卵取自6～8周龄雌性金黄地鼠。
, http://www.100md.com
1.2 实验分组 15名正常男性按年龄大小分为3个组，每组5名。Ⅰ组：25～35岁；Ⅱ组：36～45岁；Ⅲ组：46～55岁。每名正常男性作精子和外周血染色体制备。
1.3 实验方法 人精子染色体制备按黄天华等[8]的方法制备。为了使卵泡浆变薄，染色体形态好并且较短，从而便于显示精子染色体Cd结构，我们对该方法作如下改进：(1)将低渗液改为0.6%的氯化钾；(2)在第Ⅰ固定完成时，用吸管加入少量的第Ⅱ固定液到第Ⅰ固定液底部；(3)第Ⅲ固定液冰醋酸的含量减少。外周血淋巴细胞染色体按常规方法制片。
外周血淋巴细胞染色体显示Cd结构方法，我们采用翁亚光等[4]改良的Cd-NOR同步银染技术制作Cd带标本。人精子染色体显示Cd结构方法，我们基本采用同步银染法，只是由于人精子染色体大多在卵泡浆内，往往用氨银、福尔马林处理时卵泡浆很快变黑，精子染色体很难识别，为了能清楚地分析精子染色体的Cd带，我们作了以下改进：(1)增加片子的老化时间，一般20～30天，最长的45天；(2)调整福尔马林和氨银混合液的比例，改为1∶1。尽管作了以上改进，但精子染色体Cd带的出现率仍低，约为10%～15%。
, 百拇医药
1.4 分析标准 外周血染色体Cd结构的观察指标，参照王应雄等[9]的标准。但在人精子染色体Cd结构统计中，我们定为：凡1套精子染色体中A、B组5条染色体全部显现Cd结构，就可作为分析用分裂相。
2 结果
2.1 外周血淋巴细胞染色体Cd结构分析 15名正常男性的外周血淋巴细胞染色体标本共计数324个Cd带分裂相，Cd消失的染色体39条，单Cd染色体100条，Cd-NOR融合的D、G组染色体132条(表1，2)。
2.2 人精子染色体Cd结构分析 15名正常男性的精子染色体标本共计数195个Cd带分裂相，Cd丢失的染色体44条，Cd-NOR融合的D、G组染色体84条，单Cd276条(表3，4)。
表1 正常男性外周血Cd分析(u检验)
, http://www.100md.com
组别
细胞数
Cd消失数/细胞
(±s)
单Cd数/细胞
(±s)
Cd-NOR融合/细胞
(±s)
Ⅰ
102
0.08±0.27
0.31±0.57
0.16±0.37
, 百拇医药
Ⅱ
116
0.09±0.29
0.27±0.53
0.28±0.57
Ⅲ
106
0.19±0.44*
0.35±0.60
0.77±0.83**
*表示与前组差异有显著性意义(P<0.05)；**表示与前组差异有极显著性意义(P<0.01) 表2 正常男性外周血单Cd分析(u检验)
, http://www.100md.com
组别
细胞数
单Cd
染色体总数
单Cd的染色体数目(%)
A
B
C
D
Ⅰ
102
32
10(31.25)
, http://www.100md.com
5(15.63)
13(40.62)
4(12.50)
Ⅱ
116
31
9(29.03)
5(16.13)
12(38.71)
5(16.13)
Ⅲ
106
, 百拇医药 37
12(32.43)
6(16.22)
15(40.54)
4(10.81)
组间无统计学意义 表3 正常男性精子染色体Cd分析(u检验)
组别
细胞数
Cd消失数/细胞
(±s)
单Cd数/细胞
(±s)
, 百拇医药
Cd-NOR融合/细胞
(±s)
Ⅰ
66
0.15±0.36
0.64±0.81
0.21±0.41
Ⅱ
66
0.18±0.39
1.20±1.21*
0.36±0.62
, 百拇医药
Ⅲ
63
0.33±0.49
2.46±1.95*
0.71±0.66*
*表示与前组差异有极显著性意义(P<0.01) 表4 正常男性精子染色体单Cd分析(u检验)
组别
细胞数
单Cd
染色体总数
单Cd的染色体数目(%)
, 百拇医药
A
B
C
其它
Ⅰ
66
42
8(19.05)
11(26.19)
16(38.09)
7(16.67)
Ⅱ
66
, 百拇医药
79**
19(24.05)**
19(24.05)*
34(43.04)*
7(8.86)
Ⅲ
63
155**
51(32.09)**
25(16.13)*
, 百拇医药
72(46.45)**
7(4.52)
*P<0.05 **P<0.01
2.3 正常男性精子与外周血淋巴细胞染色体Cd比较研究 正常男性各年龄组精子与外周血染色体间Cd丢失率、Cd-NOR融合频率均无明显差异，单Cd率精子较外周血有明显增高(表5，6)。
表5 正常男性精子与外周血染色体Cd分析(u检验)
组别
类型
细胞数
Cd消失数/细胞
, http://www.100md.com (±s)
单Cd数/细胞
(±s)
Cd-NOR融合/细胞
(±s)
Ⅰ
外周血
102
0.08±0.27
0.31±0.57
0.16±0.37
精子
66
, 百拇医药
0.15±0.36
0.64±0.81*
0.21±0.41
Ⅱ
外周血
116
0.09±0.29
0.27±0.53
0.28±0.57
精子
66
0.18±0.39
, http://www.100md.com
1.20±1.21*
0.36±0.62
Ⅲ
外周血
106
0.19±0.44
0.35±0.60
0.77±0.83
精子
63
0.33±0.49
2.46±1.95*
, 百拇医药
0.71±0.66
*P<0.01 表6 正常男性精子与外周血染色体单Cd分析(u检验)
组别
类型
细胞数
单Cd染
色体总数
单Cd的染色体数目(%)
A
B
C
Ⅰ
, http://www.100md.com
外周血
102
32
10(31.25)
5(15.63)
13(40.62)
精子
66
42*
8(19.05)
11(26.19)*
16(38.09)
, 百拇医药
Ⅱ
外周血
116
31
9(29.03)
5(16.13)
12(38.71)
精子
66
79*
19(24.05)*
19(24.05)*
, 百拇医药
34(34.04)
Ⅲ
外周血
106
37
12(32.43)
6(16.22)
15(40.54)
精子
63
155*
51(32.90)*
, 百拇医药
25(16.13)*
72(46.45)
*P<0.01
3 讨论
近年来，国内外对染色体Cd结构研究多局限在外周血淋巴细胞和绒毛细胞。国内为数不多的几份研究文献，仅见于王应雄等[2-4]研究报道。他们对正常人外周血、胚胎绒毛进行Cd研究；对流产夫妇、肺癌患者、21三体患者进行Cd研究。研究结果表明，正常人Cd结构的变化与年龄有关。这同国外的研究成果接近。国外Nakagome[10]对老年妇女(66～87岁)外周血细胞染色体Cd结构分析，发现老年妇女细胞染色体Cd消失频率显著升高，认为人随年龄增长，其细胞染色体Cd结构可能会出现退化现象，Cd结构的这种退化会影响到染色体的正常分离而导致非整倍体细胞产生，并推测人类生殖细胞中也会有类似的现象发生。
, http://www.100md.com
我们对正常男性不同年龄组中Cd丢失、单Cd、Cd-NOR融合进行了结构分析比较。发现外周血染色体Cd丢失的频率基本上和王应雄等报道的相似，45～55岁男性Cd功能活性开始出现下降。这与国外报道的老年妇女外周血Cd消失的结果也基本一致。
在我们的实验中，精子染色体Cd消失的频率Ⅰ、Ⅱ组较低，Ⅲ组明显增高，和外周血的结果相同。精子和外周血染色体Cd消失各年龄组间比较，没有明显的差异(表5)，这也和国外学者的结果一致。
在本实验中，外周血染色体单Cd出现的频率，各年龄组间无统计学差异，而精子染色体单Cd出现频率，在各年龄组均有极显著差异。精子染色体组的单Cd明显高于外周血染色体组的单Cd。王应雄等实验结果显示，单Cd对染色体的正常分离有影响，它可导致两个染色单体不分离或丢失，出现非整倍畸变。我们分析认为，精子染色体出现单Cd频率如此之高，可能与下列两个因素有关：(1)减数分裂中期Ⅰ时，纺锤体侵入核区，分散于核中的四分体开始向纺锤体中部移动。不同于有丝分裂的是，四分体上有4个着丝点，纺锤丝与着丝点相连，使两条同源染色体的着丝点朝向两极，最后二分为二。(2)精子染色体的着丝粒常出现着丝粒裂隙。在光学显微镜下可以看到大约40%～50%的精子单倍体都有1个或2个以上的染色体着丝粒区存在“裂隙”现象，曾经引起学者们的兴趣。Navarro等[11]应用电镜技术对单倍体中的着丝粒裂隙进行了研究。他们发现这些裂隙是由1条或者2条直径为80～250 nm，长度为333～2000 nm的染色线平行走向或相互交叉构成并与染色体的两条臂相连接。每条染色线含有1条、2条或3条直径为80 nm的纤丝。他们的研究证实了那些在光学显微镜下看来似乎在着丝粒“断开”的染色体的两条臂实际上是连续的。我们推测，正是由于前述两种原因造成精子染色体单Cd增高。在显微镜下分析精子染色体Cd结构时，我们常见到染色体的长臂、短臂之间有两根被深染的细丝连着，染色体的长、短臂靠近着丝粒区分别有两个被深染的小点，往往Cd消失时，同侧的长、短臂上的小点消失。单Cd却表现为长、短臂着丝区有一较粗的被深染的线连接染色体的长、短臂，而长、短臂着丝粒区的4个小黑点消失。
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在实验中我们发现，越长的染色体(A组、B组)出现单Cd的频率就越高。此现象的成因有待今后进一步探讨。
综上所述，我们通过对15名正常男性的精子和外周血淋巴细胞染色体Cd结构分析和比较研究认为：人精子染色体Cd结构的变化与年龄有关，随年龄的增加，各种变化的频率升高，其中变化最明显的是45～55岁以上的年龄组；而且精子染色体比外周血淋巴细胞的变化更明显。
基金项目：重庆市科委重点项目
作者单位：蔡敏(400020 重庆市计划生育科研所)
厉广坤(400020 重庆市计划生育科研所)
童跃先(400020 重庆市计划生育科研所)
周利民(400020 重庆市计划生育科研所)
, 百拇医药
鄢采芹(400020 重庆市计划生育科研所)
曾维三(400020 重庆市计划生育科研所)
参考文献
[1]Moroi Y, Pecbies C, Fritzter MJ, et al.Autoantibody to centromere(Kinetochore) in scleroderma sera. Proc Natl Acad Sci U S A, 1980,77∶1631-1672.
[2]王应雄，翁亚光，何俊琳，等.正常人胚胎绒毛细胞染色体着丝粒点(Cd)变异的研究.遗传，1995，17(2)∶1-3.
[3]王应雄，翁亚光，张湘蜀，等.非整倍体患者染色体Cd结构初步研究.中华医学遗传学杂志，1992，9∶146-149.
, http://www.100md.com
[4]翁亚光，王应雄，张湘蜀，等.正常人各年龄组染色体着丝粒点(Cd)研究.遗传，1995，17(3)∶3-6.
[5]Vig BK, Paweletz N. Kinetochores, centromeres, spindles and the induction of aneuploidy. Mutat Res,1988,201∶259-269.
[6]Cherry LM, Johnston DA. Size variation in Kinetochores of human chromosomes. Hum Genet, 1987,75∶155-158.
[7]翁亚光，王应雄，张湘蜀，等.人类染色体着丝粒点(Cd)带制备方法探讨.重庆医科大学学报，1990，15∶246.
[8]黄天华，高晓平，漆著，等.人精子染色体研究——一种稳定的人精子染色体制备技术.遗传与疾病，1987，4∶174-176.
, 百拇医药
[9]王应雄，翁亚光，张湘蜀，等.高育龄妇女染色体着丝粒点研究.遗传与疾病，1990，7∶169-171.
[10]Nakagome Y. The “Loss” of centromeres from chromosomes of agedwomen. Am J Med Genet,1984,36∶398-404.
[11]Navarro J, Martin RH. Study of human sperm chromosomes by sequential transmission and scanning electron microsscopy. Hum Reprod, 1987,2∶583-587., 百拇医药
关键词：精子；外周血淋巴细胞；染色体着丝粒点 染色体着丝粒点(centromeric dots,Cd)结构研究从80年代初，Moroi等[1]发现硬皮病患者血清中存在自身抗着丝粒点抗体(ACA)，从而建立Cd结构的免疫荧光技术。目前国内外已有近30余篇有关Cd结构的研究报道[2-7]。然而，这部分研究均以体细胞为对象，尚未见正常男性精子染色体Cd结构的研究报道。我们对正常男性精子和外周血淋巴细胞染色体Cd结构进行分析和比较研究，探讨Cd结构变化在体细胞和生殖细胞是否一致，从而从一个侧面完善对着丝粒点的研究。
1 材料与方法
1.1 实验材料 人精子与外周血淋巴细胞取自15名近期无致畸因素接触史、已生育正常后代的健康男性，年龄25～55岁。鼠卵取自6～8周龄雌性金黄地鼠。
, http://www.100md.com
1.2 实验分组 15名正常男性按年龄大小分为3个组，每组5名。Ⅰ组：25～35岁；Ⅱ组：36～45岁；Ⅲ组：46～55岁。每名正常男性作精子和外周血染色体制备。
1.3 实验方法 人精子染色体制备按黄天华等[8]的方法制备。为了使卵泡浆变薄，染色体形态好并且较短，从而便于显示精子染色体Cd结构，我们对该方法作如下改进：(1)将低渗液改为0.6%的氯化钾；(2)在第Ⅰ固定完成时，用吸管加入少量的第Ⅱ固定液到第Ⅰ固定液底部；(3)第Ⅲ固定液冰醋酸的含量减少。外周血淋巴细胞染色体按常规方法制片。
外周血淋巴细胞染色体显示Cd结构方法，我们采用翁亚光等[4]改良的Cd-NOR同步银染技术制作Cd带标本。人精子染色体显示Cd结构方法，我们基本采用同步银染法，只是由于人精子染色体大多在卵泡浆内，往往用氨银、福尔马林处理时卵泡浆很快变黑，精子染色体很难识别，为了能清楚地分析精子染色体的Cd带，我们作了以下改进：(1)增加片子的老化时间，一般20～30天，最长的45天；(2)调整福尔马林和氨银混合液的比例，改为1∶1。尽管作了以上改进，但精子染色体Cd带的出现率仍低，约为10%～15%。
, 百拇医药
1.4 分析标准 外周血染色体Cd结构的观察指标，参照王应雄等[9]的标准。但在人精子染色体Cd结构统计中，我们定为：凡1套精子染色体中A、B组5条染色体全部显现Cd结构，就可作为分析用分裂相。
2 结果
2.1 外周血淋巴细胞染色体Cd结构分析 15名正常男性的外周血淋巴细胞染色体标本共计数324个Cd带分裂相，Cd消失的染色体39条，单Cd染色体100条，Cd-NOR融合的D、G组染色体132条(表1，2)。
2.2 人精子染色体Cd结构分析 15名正常男性的精子染色体标本共计数195个Cd带分裂相，Cd丢失的染色体44条，Cd-NOR融合的D、G组染色体84条，单Cd276条(表3，4)。
表1 正常男性外周血Cd分析(u检验)
, http://www.100md.com
组别
细胞数
Cd消失数/细胞
(±s)
单Cd数/细胞
(±s)
Cd-NOR融合/细胞
(±s)
Ⅰ
102
0.08±0.27
0.31±0.57
0.16±0.37
, 百拇医药
Ⅱ
116
0.09±0.29
0.27±0.53
0.28±0.57
Ⅲ
106
0.19±0.44*
0.35±0.60
0.77±0.83**
*表示与前组差异有显著性意义(P<0.05)；**表示与前组差异有极显著性意义(P<0.01) 表2 正常男性外周血单Cd分析(u检验)
, http://www.100md.com
组别
细胞数
单Cd
染色体总数
单Cd的染色体数目(%)
A
B
C
D
Ⅰ
102
32
10(31.25)
, http://www.100md.com
5(15.63)
13(40.62)
4(12.50)
Ⅱ
116
31
9(29.03)
5(16.13)
12(38.71)
5(16.13)
Ⅲ
106
, 百拇医药 37
12(32.43)
6(16.22)
15(40.54)
4(10.81)
组间无统计学意义 表3 正常男性精子染色体Cd分析(u检验)
组别
细胞数
Cd消失数/细胞
(±s)
单Cd数/细胞
(±s)
, 百拇医药
Cd-NOR融合/细胞
(±s)
Ⅰ
66
0.15±0.36
0.64±0.81
0.21±0.41
Ⅱ
66
0.18±0.39
1.20±1.21*
0.36±0.62
, 百拇医药
Ⅲ
63
0.33±0.49
2.46±1.95*
0.71±0.66*
*表示与前组差异有极显著性意义(P<0.01) 表4 正常男性精子染色体单Cd分析(u检验)
组别
细胞数
单Cd
染色体总数
单Cd的染色体数目(%)
, 百拇医药
A
B
C
其它
Ⅰ
66
42
8(19.05)
11(26.19)
16(38.09)
7(16.67)
Ⅱ
66
, 百拇医药
79**
19(24.05)**
19(24.05)*
34(43.04)*
7(8.86)
Ⅲ
63
155**
51(32.09)**
25(16.13)*
, 百拇医药
72(46.45)**
7(4.52)
*P<0.05 **P<0.01
2.3 正常男性精子与外周血淋巴细胞染色体Cd比较研究 正常男性各年龄组精子与外周血染色体间Cd丢失率、Cd-NOR融合频率均无明显差异，单Cd率精子较外周血有明显增高(表5，6)。
表5 正常男性精子与外周血染色体Cd分析(u检验)
组别
类型
细胞数
Cd消失数/细胞
, http://www.100md.com (±s)
单Cd数/细胞
(±s)
Cd-NOR融合/细胞
(±s)
Ⅰ
外周血
102
0.08±0.27
0.31±0.57
0.16±0.37
精子
66
, 百拇医药
0.15±0.36
0.64±0.81*
0.21±0.41
Ⅱ
外周血
116
0.09±0.29
0.27±0.53
0.28±0.57
精子
66
0.18±0.39
, http://www.100md.com
1.20±1.21*
0.36±0.62
Ⅲ
外周血
106
0.19±0.44
0.35±0.60
0.77±0.83
精子
63
0.33±0.49
2.46±1.95*
, 百拇医药
0.71±0.66
*P<0.01 表6 正常男性精子与外周血染色体单Cd分析(u检验)
组别
类型
细胞数
单Cd染
色体总数
单Cd的染色体数目(%)
A
B
C
Ⅰ
, http://www.100md.com
外周血
102
32
10(31.25)
5(15.63)
13(40.62)
精子
66
42*
8(19.05)
11(26.19)*
16(38.09)
, 百拇医药
Ⅱ
外周血
116
31
9(29.03)
5(16.13)
12(38.71)
精子
66
79*
19(24.05)*
19(24.05)*
, 百拇医药
34(34.04)
Ⅲ
外周血
106
37
12(32.43)
6(16.22)
15(40.54)
精子
63
155*
51(32.90)*
, 百拇医药
25(16.13)*
72(46.45)
*P<0.01
3 讨论
近年来，国内外对染色体Cd结构研究多局限在外周血淋巴细胞和绒毛细胞。国内为数不多的几份研究文献，仅见于王应雄等[2-4]研究报道。他们对正常人外周血、胚胎绒毛进行Cd研究；对流产夫妇、肺癌患者、21三体患者进行Cd研究。研究结果表明，正常人Cd结构的变化与年龄有关。这同国外的研究成果接近。国外Nakagome[10]对老年妇女(66～87岁)外周血细胞染色体Cd结构分析，发现老年妇女细胞染色体Cd消失频率显著升高，认为人随年龄增长，其细胞染色体Cd结构可能会出现退化现象，Cd结构的这种退化会影响到染色体的正常分离而导致非整倍体细胞产生，并推测人类生殖细胞中也会有类似的现象发生。
, http://www.100md.com
我们对正常男性不同年龄组中Cd丢失、单Cd、Cd-NOR融合进行了结构分析比较。发现外周血染色体Cd丢失的频率基本上和王应雄等报道的相似，45～55岁男性Cd功能活性开始出现下降。这与国外报道的老年妇女外周血Cd消失的结果也基本一致。
在我们的实验中，精子染色体Cd消失的频率Ⅰ、Ⅱ组较低，Ⅲ组明显增高，和外周血的结果相同。精子和外周血染色体Cd消失各年龄组间比较，没有明显的差异(表5)，这也和国外学者的结果一致。
在本实验中，外周血染色体单Cd出现的频率，各年龄组间无统计学差异，而精子染色体单Cd出现频率，在各年龄组均有极显著差异。精子染色体组的单Cd明显高于外周血染色体组的单Cd。王应雄等实验结果显示，单Cd对染色体的正常分离有影响，它可导致两个染色单体不分离或丢失，出现非整倍畸变。我们分析认为，精子染色体出现单Cd频率如此之高，可能与下列两个因素有关：(1)减数分裂中期Ⅰ时，纺锤体侵入核区，分散于核中的四分体开始向纺锤体中部移动。不同于有丝分裂的是，四分体上有4个着丝点，纺锤丝与着丝点相连，使两条同源染色体的着丝点朝向两极，最后二分为二。(2)精子染色体的着丝粒常出现着丝粒裂隙。在光学显微镜下可以看到大约40%～50%的精子单倍体都有1个或2个以上的染色体着丝粒区存在“裂隙”现象，曾经引起学者们的兴趣。Navarro等[11]应用电镜技术对单倍体中的着丝粒裂隙进行了研究。他们发现这些裂隙是由1条或者2条直径为80～250 nm，长度为333～2000 nm的染色线平行走向或相互交叉构成并与染色体的两条臂相连接。每条染色线含有1条、2条或3条直径为80 nm的纤丝。他们的研究证实了那些在光学显微镜下看来似乎在着丝粒“断开”的染色体的两条臂实际上是连续的。我们推测，正是由于前述两种原因造成精子染色体单Cd增高。在显微镜下分析精子染色体Cd结构时，我们常见到染色体的长臂、短臂之间有两根被深染的细丝连着，染色体的长、短臂靠近着丝粒区分别有两个被深染的小点，往往Cd消失时，同侧的长、短臂上的小点消失。单Cd却表现为长、短臂着丝区有一较粗的被深染的线连接染色体的长、短臂，而长、短臂着丝粒区的4个小黑点消失。
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在实验中我们发现，越长的染色体(A组、B组)出现单Cd的频率就越高。此现象的成因有待今后进一步探讨。
综上所述，我们通过对15名正常男性的精子和外周血淋巴细胞染色体Cd结构分析和比较研究认为：人精子染色体Cd结构的变化与年龄有关，随年龄的增加，各种变化的频率升高，其中变化最明显的是45～55岁以上的年龄组；而且精子染色体比外周血淋巴细胞的变化更明显。
基金项目：重庆市科委重点项目
作者单位：蔡敏(400020 重庆市计划生育科研所)
厉广坤(400020 重庆市计划生育科研所)
童跃先(400020 重庆市计划生育科研所)
周利民(400020 重庆市计划生育科研所)
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鄢采芹(400020 重庆市计划生育科研所)
曾维三(400020 重庆市计划生育科研所)
参考文献
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