裂变中子诱导小鼠胸腺细胞凋亡的时间效应及其分子机制初探
苑宾 孙建民 侯春梅 刘洪涛 薛文成 李梁 王宝勤
摘 要 目的：以60Co γ射线为参比射线，研究裂变中子诱导小鼠胸腺细胞凋亡的时间效应，并初步探讨其分子机制。方法：用形态学观察、DNA电泳、流式细胞仪(FCM)分析及二苯胺(DPA)法检测细胞凋亡；用斑点杂交方法检测p53与bcl-2的基因表达。结果：小鼠经裂变中子2.5 Gy照射后2～24 h，在各时间点上均检测到胸腺细胞DNA梯状条带，利用光镜与电镜观察到具有典型凋亡特征的胸腺细胞；以DPA法、FCM分析与形态观察计数测定的结果，绘制时间效应曲线，发现胸腺细胞凋亡比例随着照射时间的延长而增加，在6 h前上升较快，8～10 h达到峰值，12 h后开始下降，24 h较4～12 h明显降低(P<0.05)，但略高于正常水平。γ射线5.0 Gy照射后，胸腺细胞凋亡比例随时间的变化规律与之相似，但在6 h之前增加较缓；此外，在照后24 h检测不到DNA梯状条带。裂变中子2.5 Gy照射后，小鼠胸腺细胞p53基因表达水平在2、4、12、24 h均比未照射组有显著增加(P<0.05 或 P<0.01)；bcl-2基因表达水平均比未照射组明显降低(P<0.01)。结论：裂变中子2.5 Gy照射小鼠可诱导其胸腺细胞凋亡，且与γ射线5.0 Gy照射有类似的时相性，但裂变中子诱导的胸腺细胞凋亡比γ射线增加快、持续时间长，表明裂变中子对小鼠免疫系统损伤较重，损伤修复较慢。斑点杂交结果初步表明，裂变中子诱导的小鼠胸腺细胞凋亡亦受p53与bcl-2基因的调控。
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关键词：裂变中子；胸腺细胞；细胞凋亡；时间效应；斑点杂交；基因表达
免疫系统对电离辐射十分敏感，未成熟胸腺细胞在低剂量照射后即发生间期死亡，其形式主要是细胞凋亡[1]。低LET辐射诱导胸腺细胞凋亡的研究已有不少报道[2～4]，高LET辐射诱导细胞凋亡的研究较少[5～7]，直接以裂变中子为照射源诱导胸腺细胞凋亡的研究则更少。以往研究[8]表明，裂变中子照射对小鼠胸腺细胞的损伤比等效剂量的γ射线照射严重，研究侧重于照射后较长时间(至少1 d)，对照后短时间内的损伤变化了解甚少。为此，我们以60Co γ射线为参比射线，对裂变中子诱导小鼠胸腺细胞凋亡的时间效应进行了研究，探讨中子照射后的短时间内(24 h内)免疫系统损伤的变化规律；同时，利用斑点杂交方法，检测辐射致胸腺细胞凋亡过程中起关键作用的p53与bcl-2基因的表达变化，初步解释裂变中子诱导胸腺细胞凋亡的分子机制。
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1 材料与方法
1.1 实验动物
C57BL/6J雄性小鼠，6～8周龄，体重(18±2)g，由本院实验动物中心提供。
1.2 照射条件
裂变中子照射源及照射条件与文献[8]一致，小鼠吸收剂量为2.5 Gy。参比射线为60Co γ射线，剂量率约1.2 Gy/min，照射剂量5.0 Gy。
1.3 主要试剂
琼脂糖购自Promega公司；RNA酶为Calbiochem公司产品；NP-40购自Fluka公司；Tris购自USB公司；碘化丙啶(PI)、溴化乙啶(EB)、Triton X-100与鲑鱼精DNA购自Sigma公司；硝酸纤维素膜为Amersham公司产品；蛋白酶K购自Merck公司；Ficoll 400购自Pharmacia公司；聚乙烯吡咯烷酮购自BASF公司；地高辛标记检测试剂盒与牛血清白蛋白组分V为Boehringer Mannheim公司产品；其余均为国产分析纯试剂；p53(1.8 kb)与bcl-2(0.9 kb) cDNA探针由本所张雪峰和赵艳华博士惠赠。
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1.4 方法
1.4.1 形态学观察 常规组织切片(5 μm)，HE染色，光镜观察并拍照，计数每400个胸腺细胞中的凋亡细胞数，其百分比作为凋亡指数，每样品随机计数5个以上不同视野[2]。电镜观察由本院仪器测试中心电镜室协助完成，超薄切片经电子染色后，于透射电镜 (Philips公司产品，EM400 T型)下观察并拍照。
1.4.2 胸腺细胞悬液制备 断头活杀小鼠，取其胸腺，加PBS(pH 7.2)轻轻研磨，各过一次200目钢网与尼龙网，再经PBS漂洗，Tris-NH4Cl(pH 7.2)溶解红细胞，800 r/min离心10 min收集细胞，最后用PBS调整细胞浓度约为107个/ml，0.2%锥虫蓝计数细胞活力。
1.4.3 流式细胞仪(FCM)检测 取1×106个胸腺细胞，70%乙醇4℃固定12 h，离心收取细胞，加终浓度为200 μg/ml的RNA酶，37℃水浴30 min，然后加入PI使其终浓度为50 μg/ml，4℃条件下避光染色30 min，上机测试。每份样品计数1×104个细胞，流式细胞仪为美国BD公司FACS Calibur型，利用ModFit LT 2.0版软件分析结果。
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1.4.4 二苯胺(DPA)法分析DNA片段含量 参考文献[3]、[4]。结果以DNA片段百分率表示，即第二次13 000 r/min离心后上清中DNA的D值与上清及沉淀中DNA的D值之和的比。
1.4.5 DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳 DNA的提取参考文献[9]。取适量DNA样品及DNA分子量标准参照物 (λDNA，EcoRⅠ与HindⅢ双酶切)于1.0%琼脂糖凝胶(含0.5 μg/ml的EB)、0.5×TBE、2 V/cm的条件下电泳1～2 h。紫外灯下观察并拍照。
1.4.6 探针标记及斑点杂交 用地高辛标记p53与bcl-2 cDNA基因探针，参照试剂盒说明书进行。点膜、固定、(预)杂交、洗膜与显色等均参考文献[10]与试剂盒说明书。杂交信号用薄层扫描分析仪(GS-700型，Bio-Rad公司产品)定量分析，以光密度值表示基因的表达水平。
1.5 统计学分析
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数据以X±s表示，经单因素方差分析与双侧Dunnett t检验判断组间差异。
2 结果
2.1 裂变中子照射可诱发小鼠胸腺细胞凋亡
2.1.1 细胞凋亡的形态特征 裂变中子2.5 Gy照射后2～24 h，小鼠胸腺组织切片，在光镜下可观察到多种形态的凋亡细胞。照后2 h即看到核染色质浓缩，聚集；照后6 h最典型，可见核内染色质边集成块状、环状、戒指状和月牙状等多种形态；照后12 h，核染色质呈团块状，有核碎片形成；照后24 h，凋亡细胞较照后6 h明显减少。电镜观察发现，凋亡细胞体积变小，线粒体等细胞器及质膜结构完整，核内染色质浓缩呈块状等，进而核膜内陷，包裹致密、断裂的染色质，形成许多细小的、由膜包裹的核碎片，并进一步形成凋亡小体(图1)。
2.1.2 细胞凋亡的电泳特征 DNA电泳显示，中子2.5 Gy照后2～24 h，均检测到细胞凋亡特征性的梯状条带，4～12 h条带较明显，2或24 h条带较微弱(图2)；而等效剂量(5 Gy)的γ射线照后24 h检测不到DNA 梯状条带(图略)。
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2.2 裂变中子照射所致胸腺细胞凋亡的时间效应
根据FCM分析、DPA法与形态观察计数的结果，得到时间效应曲线(图3)。由图3可见，2.5 Gy的裂变中子照射小鼠后2～24 h，其胸腺细胞凋亡的比例在6 h前迅速上升，各时间点与未照射组相比有显著差异(P<0.01)，8～10 h达到高峰，12 h后开始下降，24 h则较4～12 h明显降低(P<0.05)。三种方法测定的结果虽在个别时间点上有一定差别，但总体变化趋势比较一致。
图1 裂变中子2.5 Gy照射后6 h，小鼠胸腺
电镜照片(×4 600)
空心箭头示正常细胞；实心箭头示凋亡细胞
图2 裂变中子2.5 Gy照射后的小鼠胸腺细胞
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NA电泳图谱
A.λDNA EcoRⅠ/HindⅢ；B～H.依次为照后
2，4，6，8，10，12，24 h
2.3 γ射线照射所致胸腺细胞凋亡的时间效应
根据DPA法测定结果，拟合得到时间效应曲线，可见γ射线5 Gy照射后，小鼠胸腺细胞凋亡的比例在6 h前增加较缓，8 h达到峰值，而后下降(图4)。
图3 裂变中子2.5 Gy照射小鼠胸腺细胞凋亡的
时间效应曲线
图4 γ射线5 Gy照射小鼠胸腺细胞凋亡的时间效应曲线
2.4 p53与bcl-2基因表达的变化
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斑点杂交结果，经薄层扫描测定杂交信号的光密度值，可定量分析有关基因的表达变化。对扫描数据进行统计学处理后，发现裂变中子2.5 Gy照射后2，4，12，24 h，小鼠胸腺细胞p53基因的表达水平比未照射组有显著增加(P<0.05或P<0.01)；与此同时，bcl-2基因表达量则在各个时间点上有明显降低(P<0.01)，见表1。
表1 2.5 Gy裂变中子照后不同时间小鼠胸腺细胞
p53与bcl-2基因表达
照后时间(t/h)
p53
bcl-2
未照射组
0.300±0.027
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0.567±0.045
2
0.356±0.023*
0.248±0.045**
4
0.408±0.028**
0.238±0.051**
12
0.496±0.191**
0.207±0.042**
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24
0.366±0.008*
0.291±0.030**
±s, n=9；* P<0.05；** P<0.01，与对照组相比
3 讨论
依据文献[8]与剂量效应研究[11]所得的RBE值接近2的结果，本实验采用亚致死剂量(2.5 Gy)的裂变中子与等效剂量(5.0 Gy)的γ射线照射小鼠，研究其诱导胸腺细胞凋亡的时间效应。DNA电泳与形态观察，尤其是电镜观察结果充分证明裂变中子2.5 Gy照射可诱导小鼠胸腺细胞凋亡。等效剂量的裂变中子与γ射线照射相比，其诱导胸腺细胞凋亡的特点是：凋亡比例增加较快，持续时间较长；都在照后8～10 h达到峰值，12 h后开始下降(图3、4)。有研究[4]显示，γ射线5.0 Gy照射诱导小鼠胸腺细胞凋亡的时相变化与本文结果不尽相同，峰值出现在照后4～6 h，之后即下降，这可能是使用不同品系的小鼠所致。相同照射条件下的不同小鼠，在同一时间点上，其胸腺细胞凋亡发生的比例有一定差别[2]。本文与另文[11]的研究结果表明，裂变中子照射后的24 h内，其对小鼠免疫系统的损伤不仅比γ射线照射重，而且持续时间较长，恢复较慢，这可能是24 h后免疫系统损伤较重的基础。
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光镜观察还发现，受照小鼠的胸腺，靠近浅表部位的细胞凋亡发生比例较高。这可能是由于分布在胸腺皮质区的幼稚淋巴细胞有非常高的辐射敏感性[8]，受照后更易发生凋亡之故；而位于胸腺髓质区的较成熟淋巴细胞有较高的辐射抗性[8]，受照后较难发生凋亡。胸腺细胞的不同成分对辐射所致细胞凋亡的敏感性有何差异及对裂变中子与γ射线照射有无不同，尚待进一步研究。
研究表明，小鼠受照后胸腺细胞凋亡与p53表达增加及bcl-2表达降低密切相关[5,12]。p53不仅可通过活化p21与GADD45引起细胞G1阻滞与DNA修复，还可通过活化大量凋亡促进基因而引发凋亡通路，其调控机制可能包括与bcl-2基因家族的相互作用；bcl-2基因激活后可抑制辐射等多种因素诱导的细胞凋亡，其调控机制涉及与该家族内bax与bcl-XL基因的相互作用[12]。本文结果显示，小鼠受2.5 Gy裂变中子照射后2～24 h，p53基因在mRNA水平上高表达，bcl-2基因表达显著降低，与胸腺细胞凋亡的时相性较一致，提示这两个基因可能都参与了中子诱导细胞凋亡的调控，但其确切机制及与γ射线照射相比有无基因表达种类或表达量的差异，仍需深入探讨。
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[基金项目] 总后指令性课题资助(96L011)；国家攀登计划B项目(86-45-01-1)资助
[作者简介] 苑宾(1971-)，男，山东淄博人，硕士，研究实习员。
苑宾(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
孙建民(军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850)
侯春梅(军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850)
刘洪涛(解放军154医院检验科，信阳 464000)
薛文成(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
李梁(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
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王宝勤(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
参考文献
[1] Szumiel I. Ionizing radiation-induced cell death[J]. Int J Radiat Biol, 1994, 66(4): 329.
[2] Weil MM, Amos CI, Mason KA, et al. Genetic basis of strain variation in levels of radiation-induced apoptosis of thymocytes[J]. Radiat Res, 1996, 146(6): 646.
[3] Mathieu J, Ferlat S, Ballester B, et al. Radiation-induced apoptosis in thymocytes: inhibition by diethylthiocarbamate and zinc[J]. Radiat Res, 1996, 146(6): 652.
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[4] 童 新，董 燕，张双喜，等.γ射线诱发细胞程序性死亡的时间及剂量效应研究[J].辐射研究与工艺学报,1996,14(2):111.
[5] Hendry JH, Potten CS, Merrit A. Apoptosis induced by high- and low-LET radiation[J]. Radiat Environ Biophys, 1995, 34(1): 59.
[6] Warenius HM, Down JD. RBE of fast neutrons for apoptosis in mouse thymocytes[J]. Int J Radiat Biol, 1995, 68(6): 625.
[7] Meijer AE, Kronqvist USE, Lewensohn R, et al. RBE for the induction of apoptosis in human peripheral lymphocytes exposed in vitro to high-LET radiation generated by accelerated nitrogen ions[J]. Int J Radiat Biol, 1998, 73(2): 169.
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[8] 王宝勤，熊景峰，王 珏，等. 裂变中子照射对小鼠胸腺淋巴细胞亚群的影响[J]. 军事医学科学院院刊，1998, 22(1): 13.
[9] John SMW, Weitzner G, Rozen R, et al. A rapid procedure for extracting genomic DNA from leukocytes[J]. Nucleic Acids Res, 1991, 19(1): 108.
[10] 鲍家驹, 沈德瑜, 王瑞瑜, 等. 一种简便且灵敏的核酸杂交新方法——地高辛配基标记探针细胞原位杂交法应用于原癌基因表达研究[J]. 中国医学科学院学报, 1991, 13(6): 439.
[11] 苑 宾, 李 梁, 薛文成, 等. 裂变中子诱导小鼠胸腺细胞凋亡的剂量效应[J].中华放射医学与防护杂志， 2000, 20(2): 87.
[12] 苑 宾, 王宝勤. 辐射诱导细胞凋亡的基因调控[J]. 国外医学放射医学与核医学分册, 1998, 22(6): 269., http://www.100md.com
摘 要 目的：以60Co γ射线为参比射线，研究裂变中子诱导小鼠胸腺细胞凋亡的时间效应，并初步探讨其分子机制。方法：用形态学观察、DNA电泳、流式细胞仪(FCM)分析及二苯胺(DPA)法检测细胞凋亡；用斑点杂交方法检测p53与bcl-2的基因表达。结果：小鼠经裂变中子2.5 Gy照射后2～24 h，在各时间点上均检测到胸腺细胞DNA梯状条带，利用光镜与电镜观察到具有典型凋亡特征的胸腺细胞；以DPA法、FCM分析与形态观察计数测定的结果，绘制时间效应曲线，发现胸腺细胞凋亡比例随着照射时间的延长而增加，在6 h前上升较快，8～10 h达到峰值，12 h后开始下降，24 h较4～12 h明显降低(P<0.05)，但略高于正常水平。γ射线5.0 Gy照射后，胸腺细胞凋亡比例随时间的变化规律与之相似，但在6 h之前增加较缓；此外，在照后24 h检测不到DNA梯状条带。裂变中子2.5 Gy照射后，小鼠胸腺细胞p53基因表达水平在2、4、12、24 h均比未照射组有显著增加(P<0.05 或 P<0.01)；bcl-2基因表达水平均比未照射组明显降低(P<0.01)。结论：裂变中子2.5 Gy照射小鼠可诱导其胸腺细胞凋亡，且与γ射线5.0 Gy照射有类似的时相性，但裂变中子诱导的胸腺细胞凋亡比γ射线增加快、持续时间长，表明裂变中子对小鼠免疫系统损伤较重，损伤修复较慢。斑点杂交结果初步表明，裂变中子诱导的小鼠胸腺细胞凋亡亦受p53与bcl-2基因的调控。
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关键词：裂变中子；胸腺细胞；细胞凋亡；时间效应；斑点杂交；基因表达
免疫系统对电离辐射十分敏感，未成熟胸腺细胞在低剂量照射后即发生间期死亡，其形式主要是细胞凋亡[1]。低LET辐射诱导胸腺细胞凋亡的研究已有不少报道[2～4]，高LET辐射诱导细胞凋亡的研究较少[5～7]，直接以裂变中子为照射源诱导胸腺细胞凋亡的研究则更少。以往研究[8]表明，裂变中子照射对小鼠胸腺细胞的损伤比等效剂量的γ射线照射严重，研究侧重于照射后较长时间(至少1 d)，对照后短时间内的损伤变化了解甚少。为此，我们以60Co γ射线为参比射线，对裂变中子诱导小鼠胸腺细胞凋亡的时间效应进行了研究，探讨中子照射后的短时间内(24 h内)免疫系统损伤的变化规律；同时，利用斑点杂交方法，检测辐射致胸腺细胞凋亡过程中起关键作用的p53与bcl-2基因的表达变化，初步解释裂变中子诱导胸腺细胞凋亡的分子机制。
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1 材料与方法
1.1 实验动物
C57BL/6J雄性小鼠，6～8周龄，体重(18±2)g，由本院实验动物中心提供。
1.2 照射条件
裂变中子照射源及照射条件与文献[8]一致，小鼠吸收剂量为2.5 Gy。参比射线为60Co γ射线，剂量率约1.2 Gy/min，照射剂量5.0 Gy。
1.3 主要试剂
琼脂糖购自Promega公司；RNA酶为Calbiochem公司产品；NP-40购自Fluka公司；Tris购自USB公司；碘化丙啶(PI)、溴化乙啶(EB)、Triton X-100与鲑鱼精DNA购自Sigma公司；硝酸纤维素膜为Amersham公司产品；蛋白酶K购自Merck公司；Ficoll 400购自Pharmacia公司；聚乙烯吡咯烷酮购自BASF公司；地高辛标记检测试剂盒与牛血清白蛋白组分V为Boehringer Mannheim公司产品；其余均为国产分析纯试剂；p53(1.8 kb)与bcl-2(0.9 kb) cDNA探针由本所张雪峰和赵艳华博士惠赠。
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1.4 方法
1.4.1 形态学观察 常规组织切片(5 μm)，HE染色，光镜观察并拍照，计数每400个胸腺细胞中的凋亡细胞数，其百分比作为凋亡指数，每样品随机计数5个以上不同视野[2]。电镜观察由本院仪器测试中心电镜室协助完成，超薄切片经电子染色后，于透射电镜 (Philips公司产品，EM400 T型)下观察并拍照。
1.4.2 胸腺细胞悬液制备 断头活杀小鼠，取其胸腺，加PBS(pH 7.2)轻轻研磨，各过一次200目钢网与尼龙网，再经PBS漂洗，Tris-NH4Cl(pH 7.2)溶解红细胞，800 r/min离心10 min收集细胞，最后用PBS调整细胞浓度约为107个/ml，0.2%锥虫蓝计数细胞活力。
1.4.3 流式细胞仪(FCM)检测 取1×106个胸腺细胞，70%乙醇4℃固定12 h，离心收取细胞，加终浓度为200 μg/ml的RNA酶，37℃水浴30 min，然后加入PI使其终浓度为50 μg/ml，4℃条件下避光染色30 min，上机测试。每份样品计数1×104个细胞，流式细胞仪为美国BD公司FACS Calibur型，利用ModFit LT 2.0版软件分析结果。
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1.4.4 二苯胺(DPA)法分析DNA片段含量 参考文献[3]、[4]。结果以DNA片段百分率表示，即第二次13 000 r/min离心后上清中DNA的D值与上清及沉淀中DNA的D值之和的比。
1.4.5 DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳 DNA的提取参考文献[9]。取适量DNA样品及DNA分子量标准参照物 (λDNA，EcoRⅠ与HindⅢ双酶切)于1.0%琼脂糖凝胶(含0.5 μg/ml的EB)、0.5×TBE、2 V/cm的条件下电泳1～2 h。紫外灯下观察并拍照。
1.4.6 探针标记及斑点杂交 用地高辛标记p53与bcl-2 cDNA基因探针，参照试剂盒说明书进行。点膜、固定、(预)杂交、洗膜与显色等均参考文献[10]与试剂盒说明书。杂交信号用薄层扫描分析仪(GS-700型，Bio-Rad公司产品)定量分析，以光密度值表示基因的表达水平。
1.5 统计学分析
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数据以X±s表示，经单因素方差分析与双侧Dunnett t检验判断组间差异。
2 结果
2.1 裂变中子照射可诱发小鼠胸腺细胞凋亡
2.1.1 细胞凋亡的形态特征 裂变中子2.5 Gy照射后2～24 h，小鼠胸腺组织切片，在光镜下可观察到多种形态的凋亡细胞。照后2 h即看到核染色质浓缩，聚集；照后6 h最典型，可见核内染色质边集成块状、环状、戒指状和月牙状等多种形态；照后12 h，核染色质呈团块状，有核碎片形成；照后24 h，凋亡细胞较照后6 h明显减少。电镜观察发现，凋亡细胞体积变小，线粒体等细胞器及质膜结构完整，核内染色质浓缩呈块状等，进而核膜内陷，包裹致密、断裂的染色质，形成许多细小的、由膜包裹的核碎片，并进一步形成凋亡小体(图1)。
2.1.2 细胞凋亡的电泳特征 DNA电泳显示，中子2.5 Gy照后2～24 h，均检测到细胞凋亡特征性的梯状条带，4～12 h条带较明显，2或24 h条带较微弱(图2)；而等效剂量(5 Gy)的γ射线照后24 h检测不到DNA 梯状条带(图略)。
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2.2 裂变中子照射所致胸腺细胞凋亡的时间效应
根据FCM分析、DPA法与形态观察计数的结果，得到时间效应曲线(图3)。由图3可见，2.5 Gy的裂变中子照射小鼠后2～24 h，其胸腺细胞凋亡的比例在6 h前迅速上升，各时间点与未照射组相比有显著差异(P<0.01)，8～10 h达到高峰，12 h后开始下降，24 h则较4～12 h明显降低(P<0.05)。三种方法测定的结果虽在个别时间点上有一定差别，但总体变化趋势比较一致。
图1 裂变中子2.5 Gy照射后6 h，小鼠胸腺
电镜照片(×4 600)
空心箭头示正常细胞；实心箭头示凋亡细胞
图2 裂变中子2.5 Gy照射后的小鼠胸腺细胞
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NA电泳图谱
A.λDNA EcoRⅠ/HindⅢ；B～H.依次为照后
2，4，6，8，10，12，24 h
2.3 γ射线照射所致胸腺细胞凋亡的时间效应
根据DPA法测定结果，拟合得到时间效应曲线，可见γ射线5 Gy照射后，小鼠胸腺细胞凋亡的比例在6 h前增加较缓，8 h达到峰值，而后下降(图4)。
图3 裂变中子2.5 Gy照射小鼠胸腺细胞凋亡的
时间效应曲线
图4 γ射线5 Gy照射小鼠胸腺细胞凋亡的时间效应曲线
2.4 p53与bcl-2基因表达的变化
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斑点杂交结果，经薄层扫描测定杂交信号的光密度值，可定量分析有关基因的表达变化。对扫描数据进行统计学处理后，发现裂变中子2.5 Gy照射后2，4，12，24 h，小鼠胸腺细胞p53基因的表达水平比未照射组有显著增加(P<0.05或P<0.01)；与此同时，bcl-2基因表达量则在各个时间点上有明显降低(P<0.01)，见表1。
表1 2.5 Gy裂变中子照后不同时间小鼠胸腺细胞
p53与bcl-2基因表达
照后时间(t/h)
p53
bcl-2
未照射组
0.300±0.027
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0.567±0.045
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0.356±0.023*
0.248±0.045**
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0.207±0.042**
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0.366±0.008*
0.291±0.030**
±s, n=9；* P<0.05；** P<0.01，与对照组相比
3 讨论
依据文献[8]与剂量效应研究[11]所得的RBE值接近2的结果，本实验采用亚致死剂量(2.5 Gy)的裂变中子与等效剂量(5.0 Gy)的γ射线照射小鼠，研究其诱导胸腺细胞凋亡的时间效应。DNA电泳与形态观察，尤其是电镜观察结果充分证明裂变中子2.5 Gy照射可诱导小鼠胸腺细胞凋亡。等效剂量的裂变中子与γ射线照射相比，其诱导胸腺细胞凋亡的特点是：凋亡比例增加较快，持续时间较长；都在照后8～10 h达到峰值，12 h后开始下降(图3、4)。有研究[4]显示，γ射线5.0 Gy照射诱导小鼠胸腺细胞凋亡的时相变化与本文结果不尽相同，峰值出现在照后4～6 h，之后即下降，这可能是使用不同品系的小鼠所致。相同照射条件下的不同小鼠，在同一时间点上，其胸腺细胞凋亡发生的比例有一定差别[2]。本文与另文[11]的研究结果表明，裂变中子照射后的24 h内，其对小鼠免疫系统的损伤不仅比γ射线照射重，而且持续时间较长，恢复较慢，这可能是24 h后免疫系统损伤较重的基础。
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光镜观察还发现，受照小鼠的胸腺，靠近浅表部位的细胞凋亡发生比例较高。这可能是由于分布在胸腺皮质区的幼稚淋巴细胞有非常高的辐射敏感性[8]，受照后更易发生凋亡之故；而位于胸腺髓质区的较成熟淋巴细胞有较高的辐射抗性[8]，受照后较难发生凋亡。胸腺细胞的不同成分对辐射所致细胞凋亡的敏感性有何差异及对裂变中子与γ射线照射有无不同，尚待进一步研究。
研究表明，小鼠受照后胸腺细胞凋亡与p53表达增加及bcl-2表达降低密切相关[5,12]。p53不仅可通过活化p21与GADD45引起细胞G1阻滞与DNA修复，还可通过活化大量凋亡促进基因而引发凋亡通路，其调控机制可能包括与bcl-2基因家族的相互作用；bcl-2基因激活后可抑制辐射等多种因素诱导的细胞凋亡，其调控机制涉及与该家族内bax与bcl-XL基因的相互作用[12]。本文结果显示，小鼠受2.5 Gy裂变中子照射后2～24 h，p53基因在mRNA水平上高表达，bcl-2基因表达显著降低，与胸腺细胞凋亡的时相性较一致，提示这两个基因可能都参与了中子诱导细胞凋亡的调控，但其确切机制及与γ射线照射相比有无基因表达种类或表达量的差异，仍需深入探讨。
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[基金项目] 总后指令性课题资助(96L011)；国家攀登计划B项目(86-45-01-1)资助
[作者简介] 苑宾(1971-)，男，山东淄博人，硕士，研究实习员。
苑宾(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
孙建民(军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850)
侯春梅(军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850)
刘洪涛(解放军154医院检验科，信阳 464000)
薛文成(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
李梁(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
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王宝勤(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
参考文献
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