人骨形态发生蛋白-7在昆虫细胞中的表达
人骨形态发生蛋白-7在昆虫细胞中的表达
饶亚兰 张杰 柳川 赵明
关键词：骨形态发生蛋白-7；昆虫细胞；表达
骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7,BMP-7)又称成骨蛋白-1(osteogenic protein-1,OP-1)是骨形态发生蛋白家族的成员，具有广泛的生理功能，尤其在诱导骨组织和肾组织形成方面起重要作用。至今已有大量报道证实BMP-7有助于骨及软骨组织缺损的修复，显示了良好的临床应用前景。此外，BMP-7能减轻大鼠急性缺血性肾衰竭的严重程度，将来有可能用于肾衰的治疗。人BMP-7全长cDNA编码431个氨基酸，分为信号肽段、前体肽段和成熟肽段。成熟肽具7个Cys，形成三个链内二硫键，两成熟肽单体通过一个链间二硫键形成二聚体。成熟肽单体有一个位点被糖基化。信号肽段、前体肽段参与BMP-7表达的胞内翻译后加工过程，这些加工过程只在真核细胞发生。在原核系统表达BMP-7很难得到活性产物，国内外文献尚未见到成功报道。文献已报道了人BMP-7蛋白在CHO细胞中的表达。我们在获得人BMP-7全长cDNA的基础上，采用BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达重组人BMP-7蛋白。
首先，将PCR扩增的hBMP-7全长cDNA插入到转移质粒pFASTBAC中构建重组转移质粒pFASTBAC-hBMP-7。扩增hBMP-7的下游引物5′端只有酶切位点而无终止密码子，如此构建pFASTBAC-hBMP-7恰好在hBMP-7基因下游加入6×His*Tag编码区。重组转移质粒转化DH10BAC感受态宿主菌，在菌体内发生位点特异性转座，pFASTBAC-hBMP-7的hBMP-7基因及其上游的Ppolh和下游的SV40 polyA信号插入到穿梭质粒pBacmid的LacZ中，通过蓝白斑筛选和PCR鉴定，获得重组穿梭质粒pBacmid-hBMP-7。提取pBacmid-hBMP，用细胞转染介导的方法，将其转染入sf21昆虫细胞中，获得具感染能力的重组病毒。重组病毒扩增后，根据蟾蜍BMP-7在昆虫细胞中表达的条件，选定MOI=8、病毒感染后3 d收获为本实验的表达条件。收集经重组病毒感染的sf21细胞无血清培养上清，采用针对6×His*Tag的金属螯合层析柱一步纯化重组蛋白，SDS-PAGE可见目的条带的洗脱。重组病毒感染的sf21细胞无血清培养上清以不同稀释比加入到成骨细胞MC3T3-E1细胞培养基，可见MC3T3-E1细胞的碱性磷酸酶(ALP)随加入的昆虫细胞表达上清比例升高而增加。ALP水平是成骨细胞分化指征之一，我们的结果表明，在昆虫细胞培养上清中有具诱骨活性的重组蛋白表达。目前重组蛋白表达量还很低，需要优化表达条件以提高产量。
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(9806192)
[作者简介] 饶亚兰(1976-)，女，江西临川人，在读硕士生。
饶亚兰(军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850)
张杰(军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850)
柳川(军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850)
赵明(军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850), 百拇医药
饶亚兰 张杰 柳川 赵明
关键词：骨形态发生蛋白-7；昆虫细胞；表达
骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7,BMP-7)又称成骨蛋白-1(osteogenic protein-1,OP-1)是骨形态发生蛋白家族的成员，具有广泛的生理功能，尤其在诱导骨组织和肾组织形成方面起重要作用。至今已有大量报道证实BMP-7有助于骨及软骨组织缺损的修复，显示了良好的临床应用前景。此外，BMP-7能减轻大鼠急性缺血性肾衰竭的严重程度，将来有可能用于肾衰的治疗。人BMP-7全长cDNA编码431个氨基酸，分为信号肽段、前体肽段和成熟肽段。成熟肽具7个Cys，形成三个链内二硫键，两成熟肽单体通过一个链间二硫键形成二聚体。成熟肽单体有一个位点被糖基化。信号肽段、前体肽段参与BMP-7表达的胞内翻译后加工过程，这些加工过程只在真核细胞发生。在原核系统表达BMP-7很难得到活性产物，国内外文献尚未见到成功报道。文献已报道了人BMP-7蛋白在CHO细胞中的表达。我们在获得人BMP-7全长cDNA的基础上，采用BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达重组人BMP-7蛋白。
首先，将PCR扩增的hBMP-7全长cDNA插入到转移质粒pFASTBAC中构建重组转移质粒pFASTBAC-hBMP-7。扩增hBMP-7的下游引物5′端只有酶切位点而无终止密码子，如此构建pFASTBAC-hBMP-7恰好在hBMP-7基因下游加入6×His*Tag编码区。重组转移质粒转化DH10BAC感受态宿主菌，在菌体内发生位点特异性转座，pFASTBAC-hBMP-7的hBMP-7基因及其上游的Ppolh和下游的SV40 polyA信号插入到穿梭质粒pBacmid的LacZ中，通过蓝白斑筛选和PCR鉴定，获得重组穿梭质粒pBacmid-hBMP-7。提取pBacmid-hBMP，用细胞转染介导的方法，将其转染入sf21昆虫细胞中，获得具感染能力的重组病毒。重组病毒扩增后，根据蟾蜍BMP-7在昆虫细胞中表达的条件，选定MOI=8、病毒感染后3 d收获为本实验的表达条件。收集经重组病毒感染的sf21细胞无血清培养上清，采用针对6×His*Tag的金属螯合层析柱一步纯化重组蛋白，SDS-PAGE可见目的条带的洗脱。重组病毒感染的sf21细胞无血清培养上清以不同稀释比加入到成骨细胞MC3T3-E1细胞培养基，可见MC3T3-E1细胞的碱性磷酸酶(ALP)随加入的昆虫细胞表达上清比例升高而增加。ALP水平是成骨细胞分化指征之一，我们的结果表明，在昆虫细胞培养上清中有具诱骨活性的重组蛋白表达。目前重组蛋白表达量还很低，需要优化表达条件以提高产量。
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(9806192)
[作者简介] 饶亚兰(1976-)，女，江西临川人，在读硕士生。
饶亚兰(军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850)
张杰(军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850)
柳川(军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850)
赵明(军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850), 百拇医药