骨髓基质细胞体外增殖后移植修复关节软骨缺损的实验研究
骨髓基质细胞体外增殖后移植修复关节软骨缺损的实验研究
董启榕 戴涟生 郑祖根
摘 要 目的：用组织工程的方法将骨髓基质细胞体外培养增殖后植入软骨缺损，观察关节软骨缺损的修复效果。方法：抽取兔骨髓基质细胞体外培养增殖后，将其与Ⅱ型胶原凝胶相结合，植入到兔膝关节实验性关节软骨缺损中，对照组的缺损分别置入与髓腔血混合的Ⅱ型胶原凝胶、单纯Ⅱ型胶原凝胶或不作任何处理，术后4、8、12周取材观察及组织学检查。结果：术后4周，实验组的缺损由透明样软骨样组织充填，术后12周，软骨及软骨下骨组织基本修复；在对照组缺损，软骨下骨在术后12周亦基本修复，但表层软骨主要由纤维组织修复。结论：骨髓基质细胞来源丰富，采集方便，经体外培养增殖后，足量的未分化细胞与Ⅱ型胶原凝胶载体相结合，修复关节软骨缺损的效果较好。
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关键词：骨髓基质细胞；关节软骨；修复
关节软骨损伤后的自身修复能力有限，常绵延为退行性变。许多学者在实验性软骨缺损修复方面做了不少工作。近期又开展了组织工程，取机体的组织细胞在体外培养增殖，与一定的支架相结合后植回体内，修复组织。国内报道的多用软骨细胞培养后移植，很少用骨髓基质细胞体外培养增殖法。骨髓基质细胞(bone marrow stromal cell)是骨髓的一种间充质细胞，具有多向分化潜能，在不同理化环境和细胞因子的诱导下，可定向地向成骨或成软骨细胞系方向分化形成骨或软骨。本实验应用组织工程原理，研究骨髓基质细胞体外培养增殖后移植，对关节软骨缺损进行修复，报告如下。
1 材料与方法
1.1骨髓基质细胞的体外培养增殖
取3～4月龄家兔，在胫骨上端或股骨下端行骨髓穿刺，抽取骨髓1ml，磷酸缓冲液稀释，分层，取单个核细胞层，接种于5ml培养瓶中，在37°C温箱，5%CO2饱和湿度下培养。每3～4d换液一次。换液时将上清液中的有形成分离心后回收，重新置于原培养瓶中培养。每天倒置显微镜下进行动态观察细胞形态及细胞生长速度。
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1.2 细胞—胶原凝胶混合物的制备
骨髓基质细胞体外培养增殖后，取P2～P3代细胞，细胞融合成层后，用胰酶消化，行细胞计数，洗涤离心，在沉淀(即细胞)上加入由胎牛软骨制备的Ⅱ型胶原凝胶(由苏州医学院生化教研室提供)，混匀，使最终细胞密度为2×106/ml，备用。
1.3 细胞—胶原凝胶对关节软骨缺损的修复实验
1.3.1 实验动物分组：家兔34只68侧膝关节，随机分为4组。Ⅰ组：17侧膝关节，缺损中植入细胞—胶原凝胶混合物；Ⅱ组：12侧膝关节，缺损中植入胶原凝胶和髓腔血混合物；Ⅲ组：17侧膝关节，缺损中植入空白胶原凝胶；Ⅳ组：22侧膝关节，缺损不作任何处理。
1.3.2 手术方法
, http://www.100md.com 手术在细胞—胶原凝胶混合物制备后立即施行，家兔髌骨外侧作纵切口进入膝关节，在股骨髁滑车关节面上制成直径3mm的全厚层软骨缺损，深度约3mm达髓腔，至髓腔渗血。取细胞—胶原凝胶混合物植入缺损处为Ⅰ组(植入的细胞均为家兔的自体细胞)；Ⅱ组植入与缺损处渗出的髓腔血相混的胶原凝胶；Ⅲ组植入空白胶原凝胶；Ⅳ组不作任何处理。术后家兔笼养，允许其自由活动，分别于术后4、8、12周处死，进行大体及组织学切片观察。
2 结 果
实验动物病死4只，关节腔感染1只，均被排除出实验组，其余动物按期处死取材。按Noguchi[1]等和O’Driscoll[2]等对实验性软骨缺损修复情况进行评价，术后4、12周的结果如下。
2.1 大体观察：术后所有家兔膝关节活动正常，各标本未见关节腔粘连，软骨磨损及骨赘形成等。
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2.1.1 术后4周 Ⅰ组标本可见缺损由白色、半透明、透明软骨样组织所填充，界限清楚，表面稍不光整；Ⅱ组、Ⅲ组标本的缺损内充填着白色凝胶样物质，表面稍凹陷；Ⅳ组标本的缺损内充填着红色半透明肉芽组织样物质，表面明显凹陷。
2.1.2 术后12周 Ⅰ组标本缺损处修复组织的色泽同前，但与周围正常软骨的界限已变得模糊不清；Ⅱ组与Ⅲ组缺损处充填物的色泽与周围软骨组织类似，表面平坦，但边界仍清晰可辨；Ⅳ组标本缺损充填物为白色、细腻、半透明样、凹陷。
2.2 组织学观察
2.2.1 术后4周 Ⅰ组标本镜下可见缺损由透明软骨样组织充填，边界清楚，表面略不平整，全层均可见明显的基质异染，细胞形态类似于透明软骨细胞，围以异染基质，细胞数目明显多于周围正常软骨，底部开始被松质骨所取代；Ⅱ组标本可见缺损区修复组织为类似软骨样的组织充填，基底有新骨形成；Ⅲ组标本表面可见纤维组织形成，稍凹陷，边界清楚，基底有新骨形成；Ⅳ组标本缺损主要由纤维组织充填，凹陷更明显。
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2.2.2 术后12周 所有四组标本软骨下骨均基本修复。
Ⅰ组标本软骨的厚度接近正常，为透明样软骨，与周围软骨连接良好，基质染色正常，细胞数目仍多于正常软骨(见图1)。Ⅱ组标本的修复组织较多为透明样软骨，与周围软骨连接尚好，但不如Ⅰ组；Ⅲ组与Ⅳ组标本表层为纤维组织，性质同前，但凹陷变得不明显。
图1 细胞-胶原治疗组，术后12周，软骨的厚度接近正常，与周围软骨连接良好，基质染色正常，软骨下骨基本修复。
3 讨 论
骨髓基质细胞是一种间充质细胞。其中有少许具有多向分化潜能的干细胞，这些干细胞在不同理化环境和细胞因子的诱导下，可定向地向成骨或成软骨细胞系方向分化，最终形成骨或软骨[3]。骨与软骨损伤后其周围的环境能诱导干细胞定向分化，使损伤得到修复。软骨组织对损伤有短暂的反应，但这种反应连很小的软骨缺损也无法修复，其原因可能是软骨缺损后软骨下骨板依然存在，骨髓基质干细胞不能向缺损处集中[4]。Shapiro[5]应用放射自显影的方法证实：累及软骨下骨的缺损，其周围的软骨细胞不参与细胞再生，修复组织主要起源于髓腔内的基质细胞。
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本实验软骨缺损模型打穿了软骨下骨板，与骨髓腔相通，使骨髓基质细胞参与修复。关节腔的乏氧环境和滑液中的各种活性因子，促使骨髓基质细胞向软骨细胞方向分化，而缺损底部邻近髓腔，较高的氧分压促使骨髓基质细胞向成骨细胞转化，形成骨小梁，这有利于修复组织与邻近组织的结合。骨髓基质中多能干细胞数量稀少，每10万个有核细胞中才有1个。随着组织工程的兴起，人们开始将其原理用于骨缺损的治疗，即抽取骨髓基质干细胞，在体外培养扩增，将其置于合适的载体内，再植于骨缺损处，通过基质干细胞的增殖、分化、成骨而达到骨缺损的修复。国外学者在作基质细胞培养时，习惯于在换液时弃去所有的未贴壁细胞[6]。本实验发现，基质细胞的贴壁时间长短不一，在前两次换液时，上清液中仍含有相当数量的基质细胞。因此在换液时将培养液全部更新，而上清液中的有形成分则在离心后重新置于原培养瓶中，这样可以明显缩短细胞培养时间，增加基质细胞的数量。骨髓基质细胞取材容易，仅需行骨髓穿刺即可获得，创伤小，采集方便，骨髓基质细胞在软骨修复中有着广泛的应用前景。
用组织工程技术修复软骨，其细胞必须与一定的载体结合后才能植入体内，该载体应具有以下特性：允许或促进细胞在其中的生长，有良好的塑形性、一定的稳定性、可降解性以及对宿主无不良作用等。本实验将体外培养增殖的骨髓基质细胞，与Ⅱ型胶原凝胶相混合后再植于缺损内。结果在细胞治疗组(Ⅰ组)，缺损均由类透明软骨组织修复，Ⅱ组的修复组织中有较多类透明软骨但不如Ⅰ组，而在非细胞治疗组(Ⅲ、Ⅳ组)，缺损主要由纤维组织修复。可能是因为在细胞治疗组，缺损全层均有足量的基质细胞，而在Ⅱ组，自体髓腔血中的间叶细胞在胶原凝胶载体的保护下，形成部分类透明样软骨组织，Ⅲ组，由髓腔进入缺损的基质细胞数量甚少，且未与胶原凝胶载体充分结合保护，未能在缺损形成足量的软骨组织，Ⅳ组的缺损区未能使进入缺损的髓腔基质细胞留驻，故仅形成修复性纤维组织。软骨下骨的修复与软骨的修复效果呈明显的正相关[7]。在本实验中，术后4周各组即可在缺损底部见到明显的骨小梁形成，术后12周潮线以下的骨组织基本修复。这是由于骨髓基质细胞在分化上较为原始，其增殖的能力更强，在骨髓腔丰富血供和高氧分压状态下，向骨细胞分化良好；而在软骨缺损表面的骨髓基质细胞，因受关节腔内乏氧条件和关节应力影响，向软骨细胞分化。本实验用Ⅱ型胶原凝胶作为载体，获得透明样软骨修复，与Wakitani[8]的采用骨髓基质细胞体外培养后与Ⅰ型胶原凝胶的修复结果相比，修复软骨与周围组织的连接更好。可能是由于软骨基质的胶原成分主要为Ⅱ型，用Ⅱ型胶原凝胶作为载体更接近软骨细胞所处的生理环境，从而更有利于骨髓基质细胞向软骨细胞的分化以及软骨细胞的增殖和生物学性状的保持[1]。用Ⅱ型胶原凝胶作为软骨修复的细胞载体植入体内，到目前为止尚未见到类似的报道。
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作者简介：董启榕(1956-),男，江苏苏州人，博士，主任医师。主研方向：髋膝关节外科。电话：(0512)8281454-3947(办)
董启榕(苏州医学院附属第二医院骨科， 215004)
戴涟生(苏州医学院附属第二医院骨科， 215004)
郑祖根(苏州医学院附属第二医院骨科， 215004)
参考文献：
[1] Noguchi T,Oka M,Fujino M,et al.Repair of osteochondral defects with grafts of cultured chondrocytes[J].Clin Orthop,1994,302:251～258.
, http://www.100md.com
[2] O'Driscoll SW,Keeley FW,Salter RB.The chondrogenic potential of free autogenous periosteal grafts for biological resurfacing of major full-thickness defects in joint surfaces under the influence of continuous passive motion[J].J Bone Joint Surg,1986,68A:1017～1035.
[3] Berry L,Grant ME,Mcclure J,et al.Bone-marrow-derived chondrogenesis in vitro[J].J Cell Sci,1992,101:333～342.
[4] Caphan AI,Elyaderani M,Mochizoki Y,et al.Principles of cartilage repair and regeneration[J].Clin Orthop,1997,342:254～269.
, 百拇医药
[5] Shapiro F,Koide S,Glimcher MJ.Cell origin and differentiation in the repair of full-thickness defects of articular cartilage[J].J Bone Joint Surg(Am),1993,75:532～553.
[6] Shibano K,Watanabe J,Iwamoto M,et al.Culture of stromal cell derived from medullary cavity of human long bone in the presence of 1,25-dihydroxyvitamin D3,recomin D3,recombinant human bone morphogenetic protein-2,or ipriflavone[J].Bone,1998,22:251～258.
[7] Constance RC,Dounchis JS,Yoshioka M,et al.Osteochondral repair using perichondrial cells[J].Clin Orthop,1997,340:220～229.
[8] Wakitani S,Goto T,Pineda SJ,et al.Mesenchymal cell-based repair of large,full-thickness defects of articular carticular cartilage[J].J Bone Joint Surg(Am),1994,76:579～592., 百拇医药
董启榕 戴涟生 郑祖根
摘 要 目的：用组织工程的方法将骨髓基质细胞体外培养增殖后植入软骨缺损，观察关节软骨缺损的修复效果。方法：抽取兔骨髓基质细胞体外培养增殖后，将其与Ⅱ型胶原凝胶相结合，植入到兔膝关节实验性关节软骨缺损中，对照组的缺损分别置入与髓腔血混合的Ⅱ型胶原凝胶、单纯Ⅱ型胶原凝胶或不作任何处理，术后4、8、12周取材观察及组织学检查。结果：术后4周，实验组的缺损由透明样软骨样组织充填，术后12周，软骨及软骨下骨组织基本修复；在对照组缺损，软骨下骨在术后12周亦基本修复，但表层软骨主要由纤维组织修复。结论：骨髓基质细胞来源丰富，采集方便，经体外培养增殖后，足量的未分化细胞与Ⅱ型胶原凝胶载体相结合，修复关节软骨缺损的效果较好。
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关键词：骨髓基质细胞；关节软骨；修复
关节软骨损伤后的自身修复能力有限，常绵延为退行性变。许多学者在实验性软骨缺损修复方面做了不少工作。近期又开展了组织工程，取机体的组织细胞在体外培养增殖，与一定的支架相结合后植回体内，修复组织。国内报道的多用软骨细胞培养后移植，很少用骨髓基质细胞体外培养增殖法。骨髓基质细胞(bone marrow stromal cell)是骨髓的一种间充质细胞，具有多向分化潜能，在不同理化环境和细胞因子的诱导下，可定向地向成骨或成软骨细胞系方向分化形成骨或软骨。本实验应用组织工程原理，研究骨髓基质细胞体外培养增殖后移植，对关节软骨缺损进行修复，报告如下。
1 材料与方法
1.1骨髓基质细胞的体外培养增殖
取3～4月龄家兔，在胫骨上端或股骨下端行骨髓穿刺，抽取骨髓1ml，磷酸缓冲液稀释，分层，取单个核细胞层，接种于5ml培养瓶中，在37°C温箱，5%CO2饱和湿度下培养。每3～4d换液一次。换液时将上清液中的有形成分离心后回收，重新置于原培养瓶中培养。每天倒置显微镜下进行动态观察细胞形态及细胞生长速度。
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1.2 细胞—胶原凝胶混合物的制备
骨髓基质细胞体外培养增殖后，取P2～P3代细胞，细胞融合成层后，用胰酶消化，行细胞计数，洗涤离心，在沉淀(即细胞)上加入由胎牛软骨制备的Ⅱ型胶原凝胶(由苏州医学院生化教研室提供)，混匀，使最终细胞密度为2×106/ml，备用。
1.3 细胞—胶原凝胶对关节软骨缺损的修复实验
1.3.1 实验动物分组：家兔34只68侧膝关节，随机分为4组。Ⅰ组：17侧膝关节，缺损中植入细胞—胶原凝胶混合物；Ⅱ组：12侧膝关节，缺损中植入胶原凝胶和髓腔血混合物；Ⅲ组：17侧膝关节，缺损中植入空白胶原凝胶；Ⅳ组：22侧膝关节，缺损不作任何处理。
1.3.2 手术方法
, http://www.100md.com 手术在细胞—胶原凝胶混合物制备后立即施行，家兔髌骨外侧作纵切口进入膝关节，在股骨髁滑车关节面上制成直径3mm的全厚层软骨缺损，深度约3mm达髓腔，至髓腔渗血。取细胞—胶原凝胶混合物植入缺损处为Ⅰ组(植入的细胞均为家兔的自体细胞)；Ⅱ组植入与缺损处渗出的髓腔血相混的胶原凝胶；Ⅲ组植入空白胶原凝胶；Ⅳ组不作任何处理。术后家兔笼养，允许其自由活动，分别于术后4、8、12周处死，进行大体及组织学切片观察。
2 结 果
实验动物病死4只，关节腔感染1只，均被排除出实验组，其余动物按期处死取材。按Noguchi[1]等和O’Driscoll[2]等对实验性软骨缺损修复情况进行评价，术后4、12周的结果如下。
2.1 大体观察：术后所有家兔膝关节活动正常，各标本未见关节腔粘连，软骨磨损及骨赘形成等。
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2.1.1 术后4周 Ⅰ组标本可见缺损由白色、半透明、透明软骨样组织所填充，界限清楚，表面稍不光整；Ⅱ组、Ⅲ组标本的缺损内充填着白色凝胶样物质，表面稍凹陷；Ⅳ组标本的缺损内充填着红色半透明肉芽组织样物质，表面明显凹陷。
2.1.2 术后12周 Ⅰ组标本缺损处修复组织的色泽同前，但与周围正常软骨的界限已变得模糊不清；Ⅱ组与Ⅲ组缺损处充填物的色泽与周围软骨组织类似，表面平坦，但边界仍清晰可辨；Ⅳ组标本缺损充填物为白色、细腻、半透明样、凹陷。
2.2 组织学观察
2.2.1 术后4周 Ⅰ组标本镜下可见缺损由透明软骨样组织充填，边界清楚，表面略不平整，全层均可见明显的基质异染，细胞形态类似于透明软骨细胞，围以异染基质，细胞数目明显多于周围正常软骨，底部开始被松质骨所取代；Ⅱ组标本可见缺损区修复组织为类似软骨样的组织充填，基底有新骨形成；Ⅲ组标本表面可见纤维组织形成，稍凹陷，边界清楚，基底有新骨形成；Ⅳ组标本缺损主要由纤维组织充填，凹陷更明显。
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2.2.2 术后12周 所有四组标本软骨下骨均基本修复。
Ⅰ组标本软骨的厚度接近正常，为透明样软骨，与周围软骨连接良好，基质染色正常，细胞数目仍多于正常软骨(见图1)。Ⅱ组标本的修复组织较多为透明样软骨，与周围软骨连接尚好，但不如Ⅰ组；Ⅲ组与Ⅳ组标本表层为纤维组织，性质同前，但凹陷变得不明显。
图1 细胞-胶原治疗组，术后12周，软骨的厚度接近正常，与周围软骨连接良好，基质染色正常，软骨下骨基本修复。
3 讨 论
骨髓基质细胞是一种间充质细胞。其中有少许具有多向分化潜能的干细胞，这些干细胞在不同理化环境和细胞因子的诱导下，可定向地向成骨或成软骨细胞系方向分化，最终形成骨或软骨[3]。骨与软骨损伤后其周围的环境能诱导干细胞定向分化，使损伤得到修复。软骨组织对损伤有短暂的反应，但这种反应连很小的软骨缺损也无法修复，其原因可能是软骨缺损后软骨下骨板依然存在，骨髓基质干细胞不能向缺损处集中[4]。Shapiro[5]应用放射自显影的方法证实：累及软骨下骨的缺损，其周围的软骨细胞不参与细胞再生，修复组织主要起源于髓腔内的基质细胞。
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本实验软骨缺损模型打穿了软骨下骨板，与骨髓腔相通，使骨髓基质细胞参与修复。关节腔的乏氧环境和滑液中的各种活性因子，促使骨髓基质细胞向软骨细胞方向分化，而缺损底部邻近髓腔，较高的氧分压促使骨髓基质细胞向成骨细胞转化，形成骨小梁，这有利于修复组织与邻近组织的结合。骨髓基质中多能干细胞数量稀少，每10万个有核细胞中才有1个。随着组织工程的兴起，人们开始将其原理用于骨缺损的治疗，即抽取骨髓基质干细胞，在体外培养扩增，将其置于合适的载体内，再植于骨缺损处，通过基质干细胞的增殖、分化、成骨而达到骨缺损的修复。国外学者在作基质细胞培养时，习惯于在换液时弃去所有的未贴壁细胞[6]。本实验发现，基质细胞的贴壁时间长短不一，在前两次换液时，上清液中仍含有相当数量的基质细胞。因此在换液时将培养液全部更新，而上清液中的有形成分则在离心后重新置于原培养瓶中，这样可以明显缩短细胞培养时间，增加基质细胞的数量。骨髓基质细胞取材容易，仅需行骨髓穿刺即可获得，创伤小，采集方便，骨髓基质细胞在软骨修复中有着广泛的应用前景。
用组织工程技术修复软骨，其细胞必须与一定的载体结合后才能植入体内，该载体应具有以下特性：允许或促进细胞在其中的生长，有良好的塑形性、一定的稳定性、可降解性以及对宿主无不良作用等。本实验将体外培养增殖的骨髓基质细胞，与Ⅱ型胶原凝胶相混合后再植于缺损内。结果在细胞治疗组(Ⅰ组)，缺损均由类透明软骨组织修复，Ⅱ组的修复组织中有较多类透明软骨但不如Ⅰ组，而在非细胞治疗组(Ⅲ、Ⅳ组)，缺损主要由纤维组织修复。可能是因为在细胞治疗组，缺损全层均有足量的基质细胞，而在Ⅱ组，自体髓腔血中的间叶细胞在胶原凝胶载体的保护下，形成部分类透明样软骨组织，Ⅲ组，由髓腔进入缺损的基质细胞数量甚少，且未与胶原凝胶载体充分结合保护，未能在缺损形成足量的软骨组织，Ⅳ组的缺损区未能使进入缺损的髓腔基质细胞留驻，故仅形成修复性纤维组织。软骨下骨的修复与软骨的修复效果呈明显的正相关[7]。在本实验中，术后4周各组即可在缺损底部见到明显的骨小梁形成，术后12周潮线以下的骨组织基本修复。这是由于骨髓基质细胞在分化上较为原始，其增殖的能力更强，在骨髓腔丰富血供和高氧分压状态下，向骨细胞分化良好；而在软骨缺损表面的骨髓基质细胞，因受关节腔内乏氧条件和关节应力影响，向软骨细胞分化。本实验用Ⅱ型胶原凝胶作为载体，获得透明样软骨修复，与Wakitani[8]的采用骨髓基质细胞体外培养后与Ⅰ型胶原凝胶的修复结果相比，修复软骨与周围组织的连接更好。可能是由于软骨基质的胶原成分主要为Ⅱ型，用Ⅱ型胶原凝胶作为载体更接近软骨细胞所处的生理环境，从而更有利于骨髓基质细胞向软骨细胞的分化以及软骨细胞的增殖和生物学性状的保持[1]。用Ⅱ型胶原凝胶作为软骨修复的细胞载体植入体内，到目前为止尚未见到类似的报道。
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作者简介：董启榕(1956-),男，江苏苏州人，博士，主任医师。主研方向：髋膝关节外科。电话：(0512)8281454-3947(办)
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戴涟生(苏州医学院附属第二医院骨科， 215004)
郑祖根(苏州医学院附属第二医院骨科， 215004)
参考文献：
[1] Noguchi T,Oka M,Fujino M,et al.Repair of osteochondral defects with grafts of cultured chondrocytes[J].Clin Orthop,1994,302:251～258.
, http://www.100md.com
[2] O'Driscoll SW,Keeley FW,Salter RB.The chondrogenic potential of free autogenous periosteal grafts for biological resurfacing of major full-thickness defects in joint surfaces under the influence of continuous passive motion[J].J Bone Joint Surg,1986,68A:1017～1035.
[3] Berry L,Grant ME,Mcclure J,et al.Bone-marrow-derived chondrogenesis in vitro[J].J Cell Sci,1992,101:333～342.
[4] Caphan AI,Elyaderani M,Mochizoki Y,et al.Principles of cartilage repair and regeneration[J].Clin Orthop,1997,342:254～269.
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[5] Shapiro F,Koide S,Glimcher MJ.Cell origin and differentiation in the repair of full-thickness defects of articular cartilage[J].J Bone Joint Surg(Am),1993,75:532～553.
[6] Shibano K,Watanabe J,Iwamoto M,et al.Culture of stromal cell derived from medullary cavity of human long bone in the presence of 1,25-dihydroxyvitamin D3,recomin D3,recombinant human bone morphogenetic protein-2,or ipriflavone[J].Bone,1998,22:251～258.
[7] Constance RC,Dounchis JS,Yoshioka M,et al.Osteochondral repair using perichondrial cells[J].Clin Orthop,1997,340:220～229.
[8] Wakitani S,Goto T,Pineda SJ,et al.Mesenchymal cell-based repair of large,full-thickness defects of articular carticular cartilage[J].J Bone Joint Surg(Am),1994,76:579～592., 百拇医药