重组人干细胞因子理化性质和生物活性分析
吴军 巩新 唱韶红 赵志虎 马清钧
摘 要 干细胞因子(stem cell factor,SCF)是一种对造血细胞有重要作用的因子，在自体外周血造血前体细胞移植、肿瘤放化疗的辅助治疗、贫血和其他血液病的治疗方面有良好的应用前景。目的：分析本所制备的rhSCF的理化性质和生物活性。方法：用反相高效液相色谱、质谱、凝胶高效液相色谱等方法分别测定了制品的纯度、分子量、氨基酸组成、紫外光谱等，并用TF-1细胞测定了制品的生物活性。结论：制品分子量为18 558,与天然hSCF的差异小于0.2%,产物以非共价二聚体形式存在。氨基酸组成与天然hSCF相同，紫外光谱为典型的蛋白光谱，在277 nm有特征吸收，比活为0.95×106 U/mg,与国外参考品相似。上述结果初步说明制备的rhSCF理化性质与天然hSCF一致，生物活性良好，有望进一步开发用于临床。
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关键词：干细胞因子；生物活性;理化性质；色谱法，高压液相；碎片质谱法
干细胞因子(stem cell factor, SCF) 是一种对造血细胞有重要作用的因子,它主要作用于早期多能干细胞、祖细胞，同时对晚期成熟血细胞也有作用。动物实验和临床试验结果显示其在自体外周血造血前体细胞移植、肿瘤放化疗的辅助治疗、贫血和其他血液病的治疗方面有良好的应用前景[1～3]。为了满足基础研究和临床应用的需要，我所已完成了对人SCF基因的克隆和高表达，并初步建立了该工程菌的发酵、产物纯化和复性的中试工艺。我们对制备的rhSCF的理化性质和生物活性进行初步分析。
1 材料与方法
1.1 纯度分析
HP1050高效液相色谱仪为惠普公司产品,C8 4.0 mm×250 mm色谱柱(中国科学院大连化学物理所)；UV 检测器,波长280 nm；流动相A:0.1%TFA+超纯水，流动相B:0.1%TFA+乙腈。洗脱程序为:0→50 min,A:100%→10%，B:0%→90%。上样量20 μl。
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1.2 分子量测定
1.2.1 SDS-PAGE法 15%分离胶，4.5%浓缩胶，蛋白分子量标准购自上海丽珠生物技术有限公司。
1.2.2 基质辅助激光解吸附飞行时间质谱法 Tofspec质谱仪，氮气激光源，线性飞行距离：65 cm，加速电压23 608 V，检测器电压-1 750 V，扫描频率4 ns，信号为50次扫描的累加结果。
1.2.3 凝胶排阻色谱法 PE LC-235高效液相色谱仪，TSK2000色谱柱。Sigma公司产蛋白分子量标准。将标准蛋白分别进样，测其保留时间，以标准蛋白分子量的对数与保留时间作线性回归；rhSCF制品同样条件下进样，测定其保留时间代入上述线性方程计算rhSCF的表观分子量。
1.3 氨基酸组成分析
采用DABS柱前衍生法，样品水解和衍生按Beckman公司试剂盒提供的方法完成，色谱仪：Beckman 黄金系统Ⅰ型，ultrasphere C18 4.6 mm×250 mm，436 nm检测，混合氨基酸标准品(Beckman公司产品)。流动相A:11 mmol/L柠檬酸(含4%二甲基甲酰胺)，用NaOH调pH至6.4，B:30%A液，70%乙腈(含4%二甲基甲酰胺)，流速1.4 ml/min。洗脱程序见表1。
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表1 洗脱程序
t/min
流动相A(%)
流动相B(%)
0
44
56
17.2
14
86
23.2
0
100
, 百拇医药
29.2
75
25
39.9
75
25
1.4 紫外光谱
Beckman DU640型紫外分光光度计，波长扫描范围220～320 nm，样品为0.2 mg/ml。
1.5 活性测定
TF-1细胞株由中国预防医学科学院病毒所吴淑华教授惠赠。rhSCF活性参考品由英国国立生物标准与控制研究所(National Institute for Biological Standards and Control,NIBSC)惠赠(Invoice number 16716)。无血清培养基由本所细胞工程实验室陈昭烈副教授惠赠。rhSCF样品用无血清培养基在96孔板上作倍比稀释,每孔加样100 μl, TF-1细胞培养在含10%新生牛血清和2ng/ml GM-CSF的1640培养基中,使用前,先用无血清培养基洗细胞4次,用无血清培养基稀释至浓度为4×105/ml,以每孔100 μl细胞加入上述96孔板,于37℃、5%CO2条件下培养65 h左右,每孔加20 μl MTT,再培养5 h后,加入20%SDS 80 μl,溶解后在酶联仪上测D570。rhSCF活性参考品用同样条件测定,作为活性计算的标准。
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2 结果与讨论
2.1 纯度分析
采用反相高效液相色谱法测得制品的纯度(图1)大于98%，可用于进一步的理化性质和生物活性测定。
图1 rhSCF的反相高效液相色谱分析
2.2 分子量测定
分子量是表征一个蛋白特性的主要参数之一,传统测定方法是采用SDS-PAGE法,我们采用该法,依据电泳距离测得rhSCF的分子量大约为19 000，与理论分子量18 589误差小于10%。SDS-PAGE测定分子量的缺点是误差较大,难以区分蛋白分子的微小改变,如一个或几个氨基酸的缺失等,而飞行时间质谱分析可以测定蛋白分子的精确分子量,其误差可小于0.2%,对于hSCF这样分子量较小的蛋白,即使缺失一个氨基酸也能被检测到。我们用飞行时间质谱分析，测得rhSCF的精确分子量为18 558 (图2)，与根据天然hSCF氨基酸序列计算的理论分子量18 589仅差0.17%，在仪器误差0.2%以内，可以认为rhSCF的分子量是正确的。
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图2 基质辅助激光解吸附飞行时间质谱法
测定rhSCF的分子量
M+为分子离子峰；M2+和M3+分别为二价和三价离子峰
由凝胶排阻色谱测得的rhSCF的保留时间为7.5 min,而作为分子量标准的牛血清白蛋白(分子量66 000)和溶菌酶(分子量为14 400)分别为6.1 min和8.6 min。因而rhSCF的表观分子量为35 000(图3)，约为飞行时间质谱法测定分子量的两倍。由于凝胶排阻色谱是在接近生理条件下进行的，测定时非共价聚体不会解聚,而飞行时间质谱法测定时由于电离的作用,非共价聚体会解聚，但共价聚体不易解聚。 可见我们制备的rhSCF是以非共价二聚体形式存在的,这一结果与文献[2,3]报道人干细胞因子的活性形式是非共价的二聚体是一致的。
2.3 氨基酸组成分析
, 百拇医药
样品酸水解后，用高效液相色谱(HPLC)分离，以标准氨基酸作外标定量分析，测得各种氨基酸成分如表2所示，其中Trp和Cys水解易破坏，测定值偏低，Gly和His含量低,误差较大,其他氨基酸组成均与理论值相近。
图3 凝胶HPLC法测定rhSCF的分子量
表2 rhSCF氨基酸组成分析
峰 号
氨基酸
rhSCF测定
值(%)
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天然hSCF预测
值(%)
1
Asp+Asn
16.8
8.5+5.5
2
Glu+Gln
8.6
6.1+0.6
3
Ser
12.2
, 百拇医药
12.4
4
Thr
5.7
4.8
5
Arg
4.2
3.6
6
Gly
2.6
1.8
, http://www.100md.com 7
Ala
2.9
2.4
8
Pro
5.2
6.1
9
Val
10.0
11.5
10
Met
, 百拇医药
3.0
3.0
11
Ile
4.7
5.5
12
Leu
8.9
9.1
13
Phe
5.4
, 百拇医药 5.5
14
Cys
0.3
2.4
15
Lys
7.3
8.5
16
Trp
-
0.6
2.4 紫外光谱
, 百拇医药
样品的紫外光谱(图4)表现为典型的蛋白光谱，在277 nm处有一蛋白的特征吸收峰。
图4 rhSCF的紫外光谱
2.5 生物活性测定
纯化产品与NIBSC惠赠的rhSCF活性标准品相似,在无血清培养基中,对TF-1细胞的生长有明显的刺激作用,其半数有效剂量为6～7 ng/ml(图5), 与NIBSC参考品相似，比活为0.95×106 IU/mg。
, 百拇医药
图5 rhSCF对TF-1细胞的作用
制备的rhSCF还可明显增加人骨髓粒细胞、巨噬细胞系集落(CFU-GM)的产率，rhSCF剂量从0增加到40.0 ng时, CFU-GM从(1±0.4)/2×105增加到(348.0±11.6)/2×105骨髓单核细胞。rhSCF与G-CSF，或与EPO+IL-3伍用都呈现明显的协同作用，且协同作用也随剂量的增加而增大。华东理工大学生物反应器国家重点实验室的张孝兵、谭文松使用我们制备的rhSCF(单用或与IL-3合用)进行脐血造血前体细胞的扩增培养也取得了明显效果，CFU-GM和总细胞数都有较大幅度的提高。
上述结果初步说明制备的rhSCF理化性质与天然hSCF基本一致，生物活性良好，有望进一步开发用于临床。
[作者简介] 吴军(1969-)，男，浙江富阳人，博士，助理研究员。
, 百拇医药
吴军(军事医学科学院生物工程研究所，北京 100071)
巩新(军事医学科学院生物工程研究所，北京 100071)
唱韶红(军事医学科学院生物工程研究所，北京 100071)
赵志虎(军事医学科学院生物工程研究所，北京 100071)
马清钧(军事医学科学院生物工程研究所，北京 100071)
参考文献
[1] Williams DE ,Eisenman J,Baird A,et al.Identification of a ligand for the c-kit proto-oncogene[J]. Cell,1990，63(2):167.
, http://www.100md.com
[2] Orazi A,Gordon MS,John K，et al.In vivo effect of recombinant human stem cell factor treatment:a morphologic and immunohistochemical study of bone marrow biopsies[J]. Am J Clin Pathol, 1995,103(2):177.
[3] Shpall EJ,Wheeler CA,Turner SA，et al.A randomized phase 3 study of peripheral blood progenitor cell mobilization with stem cell factor and filgrastim in high-risk breast cancer patients[J]. Blood,1999,93(8):2491., 百拇医药
摘 要 干细胞因子(stem cell factor,SCF)是一种对造血细胞有重要作用的因子，在自体外周血造血前体细胞移植、肿瘤放化疗的辅助治疗、贫血和其他血液病的治疗方面有良好的应用前景。目的：分析本所制备的rhSCF的理化性质和生物活性。方法：用反相高效液相色谱、质谱、凝胶高效液相色谱等方法分别测定了制品的纯度、分子量、氨基酸组成、紫外光谱等，并用TF-1细胞测定了制品的生物活性。结论：制品分子量为18 558,与天然hSCF的差异小于0.2%,产物以非共价二聚体形式存在。氨基酸组成与天然hSCF相同，紫外光谱为典型的蛋白光谱，在277 nm有特征吸收，比活为0.95×106 U/mg,与国外参考品相似。上述结果初步说明制备的rhSCF理化性质与天然hSCF一致，生物活性良好，有望进一步开发用于临床。
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关键词：干细胞因子；生物活性;理化性质；色谱法，高压液相；碎片质谱法
干细胞因子(stem cell factor, SCF) 是一种对造血细胞有重要作用的因子,它主要作用于早期多能干细胞、祖细胞，同时对晚期成熟血细胞也有作用。动物实验和临床试验结果显示其在自体外周血造血前体细胞移植、肿瘤放化疗的辅助治疗、贫血和其他血液病的治疗方面有良好的应用前景[1～3]。为了满足基础研究和临床应用的需要，我所已完成了对人SCF基因的克隆和高表达，并初步建立了该工程菌的发酵、产物纯化和复性的中试工艺。我们对制备的rhSCF的理化性质和生物活性进行初步分析。
1 材料与方法
1.1 纯度分析
HP1050高效液相色谱仪为惠普公司产品,C8 4.0 mm×250 mm色谱柱(中国科学院大连化学物理所)；UV 检测器,波长280 nm；流动相A:0.1%TFA+超纯水，流动相B:0.1%TFA+乙腈。洗脱程序为:0→50 min,A:100%→10%，B:0%→90%。上样量20 μl。
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1.2 分子量测定
1.2.1 SDS-PAGE法 15%分离胶，4.5%浓缩胶，蛋白分子量标准购自上海丽珠生物技术有限公司。
1.2.2 基质辅助激光解吸附飞行时间质谱法 Tofspec质谱仪，氮气激光源，线性飞行距离：65 cm，加速电压23 608 V，检测器电压-1 750 V，扫描频率4 ns，信号为50次扫描的累加结果。
1.2.3 凝胶排阻色谱法 PE LC-235高效液相色谱仪，TSK2000色谱柱。Sigma公司产蛋白分子量标准。将标准蛋白分别进样，测其保留时间，以标准蛋白分子量的对数与保留时间作线性回归；rhSCF制品同样条件下进样，测定其保留时间代入上述线性方程计算rhSCF的表观分子量。
1.3 氨基酸组成分析
采用DABS柱前衍生法，样品水解和衍生按Beckman公司试剂盒提供的方法完成，色谱仪：Beckman 黄金系统Ⅰ型，ultrasphere C18 4.6 mm×250 mm，436 nm检测，混合氨基酸标准品(Beckman公司产品)。流动相A:11 mmol/L柠檬酸(含4%二甲基甲酰胺)，用NaOH调pH至6.4，B:30%A液，70%乙腈(含4%二甲基甲酰胺)，流速1.4 ml/min。洗脱程序见表1。
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表1 洗脱程序
t/min
流动相A(%)
流动相B(%)
0
44
56
17.2
14
86
23.2
0
100
, 百拇医药
29.2
75
25
39.9
75
25
1.4 紫外光谱
Beckman DU640型紫外分光光度计，波长扫描范围220～320 nm，样品为0.2 mg/ml。
1.5 活性测定
TF-1细胞株由中国预防医学科学院病毒所吴淑华教授惠赠。rhSCF活性参考品由英国国立生物标准与控制研究所(National Institute for Biological Standards and Control,NIBSC)惠赠(Invoice number 16716)。无血清培养基由本所细胞工程实验室陈昭烈副教授惠赠。rhSCF样品用无血清培养基在96孔板上作倍比稀释,每孔加样100 μl, TF-1细胞培养在含10%新生牛血清和2ng/ml GM-CSF的1640培养基中,使用前,先用无血清培养基洗细胞4次,用无血清培养基稀释至浓度为4×105/ml,以每孔100 μl细胞加入上述96孔板,于37℃、5%CO2条件下培养65 h左右,每孔加20 μl MTT,再培养5 h后,加入20%SDS 80 μl,溶解后在酶联仪上测D570。rhSCF活性参考品用同样条件测定,作为活性计算的标准。
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2 结果与讨论
2.1 纯度分析
采用反相高效液相色谱法测得制品的纯度(图1)大于98%，可用于进一步的理化性质和生物活性测定。
图1 rhSCF的反相高效液相色谱分析
2.2 分子量测定
分子量是表征一个蛋白特性的主要参数之一,传统测定方法是采用SDS-PAGE法,我们采用该法,依据电泳距离测得rhSCF的分子量大约为19 000，与理论分子量18 589误差小于10%。SDS-PAGE测定分子量的缺点是误差较大,难以区分蛋白分子的微小改变,如一个或几个氨基酸的缺失等,而飞行时间质谱分析可以测定蛋白分子的精确分子量,其误差可小于0.2%,对于hSCF这样分子量较小的蛋白,即使缺失一个氨基酸也能被检测到。我们用飞行时间质谱分析，测得rhSCF的精确分子量为18 558 (图2)，与根据天然hSCF氨基酸序列计算的理论分子量18 589仅差0.17%，在仪器误差0.2%以内，可以认为rhSCF的分子量是正确的。
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图2 基质辅助激光解吸附飞行时间质谱法
测定rhSCF的分子量
M+为分子离子峰；M2+和M3+分别为二价和三价离子峰
由凝胶排阻色谱测得的rhSCF的保留时间为7.5 min,而作为分子量标准的牛血清白蛋白(分子量66 000)和溶菌酶(分子量为14 400)分别为6.1 min和8.6 min。因而rhSCF的表观分子量为35 000(图3)，约为飞行时间质谱法测定分子量的两倍。由于凝胶排阻色谱是在接近生理条件下进行的，测定时非共价聚体不会解聚,而飞行时间质谱法测定时由于电离的作用,非共价聚体会解聚，但共价聚体不易解聚。 可见我们制备的rhSCF是以非共价二聚体形式存在的,这一结果与文献[2,3]报道人干细胞因子的活性形式是非共价的二聚体是一致的。
2.3 氨基酸组成分析
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样品酸水解后，用高效液相色谱(HPLC)分离，以标准氨基酸作外标定量分析，测得各种氨基酸成分如表2所示，其中Trp和Cys水解易破坏，测定值偏低，Gly和His含量低,误差较大,其他氨基酸组成均与理论值相近。
图3 凝胶HPLC法测定rhSCF的分子量
表2 rhSCF氨基酸组成分析
峰 号
氨基酸
rhSCF测定
值(%)
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天然hSCF预测
值(%)
1
Asp+Asn
16.8
8.5+5.5
2
Glu+Gln
8.6
6.1+0.6
3
Ser
12.2
, 百拇医药
12.4
4
Thr
5.7
4.8
5
Arg
4.2
3.6
6
Gly
2.6
1.8
, http://www.100md.com 7
Ala
2.9
2.4
8
Pro
5.2
6.1
9
Val
10.0
11.5
10
Met
, 百拇医药
3.0
3.0
11
Ile
4.7
5.5
12
Leu
8.9
9.1
13
Phe
5.4
, 百拇医药 5.5
14
Cys
0.3
2.4
15
Lys
7.3
8.5
16
Trp
-
0.6
2.4 紫外光谱
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样品的紫外光谱(图4)表现为典型的蛋白光谱，在277 nm处有一蛋白的特征吸收峰。
图4 rhSCF的紫外光谱
2.5 生物活性测定
纯化产品与NIBSC惠赠的rhSCF活性标准品相似,在无血清培养基中,对TF-1细胞的生长有明显的刺激作用,其半数有效剂量为6～7 ng/ml(图5), 与NIBSC参考品相似，比活为0.95×106 IU/mg。
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图5 rhSCF对TF-1细胞的作用
制备的rhSCF还可明显增加人骨髓粒细胞、巨噬细胞系集落(CFU-GM)的产率，rhSCF剂量从0增加到40.0 ng时, CFU-GM从(1±0.4)/2×105增加到(348.0±11.6)/2×105骨髓单核细胞。rhSCF与G-CSF，或与EPO+IL-3伍用都呈现明显的协同作用，且协同作用也随剂量的增加而增大。华东理工大学生物反应器国家重点实验室的张孝兵、谭文松使用我们制备的rhSCF(单用或与IL-3合用)进行脐血造血前体细胞的扩增培养也取得了明显效果，CFU-GM和总细胞数都有较大幅度的提高。
上述结果初步说明制备的rhSCF理化性质与天然hSCF基本一致，生物活性良好，有望进一步开发用于临床。
[作者简介] 吴军(1969-)，男，浙江富阳人，博士，助理研究员。
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吴军(军事医学科学院生物工程研究所，北京 100071)
巩新(军事医学科学院生物工程研究所，北京 100071)
唱韶红(军事医学科学院生物工程研究所，北京 100071)
赵志虎(军事医学科学院生物工程研究所，北京 100071)
马清钧(军事医学科学院生物工程研究所，北京 100071)
参考文献
[1] Williams DE ,Eisenman J,Baird A,et al.Identification of a ligand for the c-kit proto-oncogene[J]. Cell,1990，63(2):167.
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[2] Orazi A,Gordon MS,John K，et al.In vivo effect of recombinant human stem cell factor treatment:a morphologic and immunohistochemical study of bone marrow biopsies[J]. Am J Clin Pathol, 1995,103(2):177.
[3] Shpall EJ,Wheeler CA,Turner SA，et al.A randomized phase 3 study of peripheral blood progenitor cell mobilization with stem cell factor and filgrastim in high-risk breast cancer patients[J]. Blood,1999,93(8):2491., 百拇医药