汉丹肝乐对猪血清免疫性肝纤维化大鼠胶原酶活性的影响
陆荫英 陆彤 程明亮 丁一生
摘 要 目的 研究猪血清免疫性肝纤维化的胶原酶活性变化及汉丹肝乐对其的影响。 方法 用猪血清腹腔内注射复制免疫损伤性肝纤维化模型，以汉丹肝乐为治疗组，秋水仙碱作为对照给药，第 12 周处死动物测定肝胶原酶活性，肝胶原纤维染色半定量，肝胶原蛋白含量。 结果 汉丹肝乐能增加胶原酶活性(μg/ml)高剂量组为 3.93、模型组为 2.34。降低肝内胶原纤维及胶原蛋白的含量[每克干肝(mg)高剂量组为 25.45、模型组为 52.25]，高剂量组疗效最佳，明显优于秋水仙碱。 结论 汉丹肝乐能有效增加胶原酶活性，促进胶原降解，抗肝纤维化。
关键词：肝纤维化；模型，免疫学；胶原酶；汉丹肝乐
, 百拇医药
我们用猪血清腹腔内注射复制免疫损伤性肝纤维化动物模型，研究汉丹肝乐对胶原生成及降解的影响。
材料与方法
1.材料：(1)实验动物：雄性Wistar大鼠60只，200～250g，购自贵州省药检所动物室。(2)猪血清：本实验室自制。(3)主要试剂：酸可溶胶原、二氮杂菲购自Sigma公司，Beckman system——6300型高效氨基酸分析仪，其它普通试剂均购自上海化学试剂公司。(4)药物：汉丹肝乐胶囊(主由丹参、汉防己、银杏、黄芪、赤芍等组成)，每粒0.4g，由贵阳制药厂生产；秋水仙碱为云南省昆明植物药厂出品。
2.方法：(1)模型制备及汉丹肝乐治疗：Wistar大鼠随机分为五组，每组 12 只，为正常对照组、肝纤维化模型组、汉丹肝乐低剂量组(0.3g/kg)、汉丹肝乐高剂量组(0.6g/kg)、秋水仙碱组(0.14mg/kg)。除正常对照组外，其余各组实验第一天起给予猪血清腹腔内注射造肝纤维化模型，每次0.5ml/只，每周2次，模型组及正常对照组不给药，其余各组给予相应剂量药物，喂饲加间歇灌胃给药，饲以普通饲料及自来水。第 12 周颈动脉放血处死动物,取肝脏作相应检测。(2)胶原酶活性测定：右叶肝脏冰盐水反复灌洗后迅速投入液氮，以后转-70℃冰箱保存。冰冻状态下肝脏切碎，准确称取100mg加pH7.6Tris-HCl缓冲液1ml，冰水浴条件下匀浆，4℃放置3～4h，离心10min，取上清液备用。实验管1中加入 200μl 样品上清液，0.2%胶原200μl，20μl缓冲液，测定潜在的胶原酶活性；实验管2中加入20μl对氯化汞苯甲酸代替缓冲液作为酶激活剂，测定活化的胶原酶活性；空白管中加入样品上清液200μl，0.1 MTris-HCl缓冲液(pH7.6)220μl。35℃ 24h，0.08mol/L二氮杂菲 20μl终止反应，加入20μl二恶烷沉淀未变性的胶原，离心10min取上清，加等量浓盐酸124～126℃充分水解5h，过滤取滤液于高效氨基酸分析仪测羟脯氨酸含量，羟脯氨酸含量高，被分解的底物量多，胶原酶活性就高，结果为实验管减去空白管值。(3)肝组织胶原蛋白含量测定：参照文献[1]，略有改进。(4)肝脏组织病理切片：部分肝左叶中性甲醛固定24h，石蜡包埋切片Masson’s三色染色胶原纤维半定量分析。正常为—；+：汇管区、小叶中央静脉周围胶原增加；++：汇管区、小叶中央静脉周围胶原进一步增加，胶原开始穿插、分隔肝小叶；+++：胶原纤维较细包绕、分隔肝小叶；++++：胶原纤维隔进一步增宽、增多。(5)统计方法：胶原酶活性测定值及肝胶原蛋白含量采用t 检验法，Masson’s染色半定量采用Ridit检验法。
, 百拇医药
结 果
1.肝组织胶原酶活性变化：模型组胶原酶活性略高于正常组。三个治疗组活化和潜在胶原酶活性显著高于模型组，各治疗组间有显著性差异，高剂量组活性最高，见表 1。
表1 各组大鼠肝组织中胶原酶活性(羟脯氨酸含量mg/L)
组 别
A
L
A/L
正常组
1.14±0.043*
3.62±0.185*
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0.299±0.015
低剂量组
3.11±0.125*△
8.62±0.341*
0.360±0.016
高剂量组
3.93±0.338*△
11.33±0.894*△
0.347±0.012
秋水仙碱组
2.52±0.153*
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7.63±0.427*
0.331±0.006
模型组
2.34±0.230
6.71±0.610
0.343±0.011
* 与模型组比较：t 值正常组为17.42、低剂量组为9.97、高剂量组为13.3、秋水仙碱组为2.15，P 值均<0.05；△ 与秋水仙碱组比较：t 值低剂量组为10.34、高剂量组为13.23(A)，12.95(L)，P 值均<0.05；A 活化的胶原酶活性；L 潜在的胶原酶活性
2.肝胶原蛋白含量测定结果：肝(干肝)胶原蛋白含量(mg/g)正常组 8.33±0.74、汉丹肝乐低剂量组 36.40±4.97、高剂量组 25.45±5.55、秋水仙碱组 36.39±4.79 和模型组 52.25±6.93。与模型组比较，t 值正常组 23.60，低剂量组 7.92、高剂量组 11.88、秋水仙碱组 8.63，P 值均<0.05。各用药组含量均较模型组少，高剂量组低于秋水仙碱组，t＝5.16，P<0.05。
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3.肝胶原纤维Masson’s染色半定量分析：汉丹肝乐治疗组肝胶原纤维量明显较模型组少，见表 2。
表2 Masson’s染色分级
组 别
—
+
++
+++
++++
平均
正常组
12
0
, 百拇医药
0
0
0
3.8
低剂量组*
0
2
3
6
1
2.5
高剂量组**△
0
, 百拇医药
4
5
3
0
1.8
秋水仙碱组*
0
1
6
4
1
2.4
模型组
, http://www.100md.com 0
0
0
3
9
0
* 与模型组比较：χ2＝6.02，P<0.05；** 与模型组比较：χ2＝14.02，P<0.01；△ 与秋水仙碱组比较：χ2＝8.25，P<0.05
讨 论
用猪血清复制大鼠肝纤维化模型，较其它模型的整体损伤小，更接近临床病例的发病特点，是理想的肝纤维化模型[2]。
有报道[3]肝硬化阶段大鼠肝内胶原酶活性下降，在恢复过程中其活性升高。因此，增加胶原酶活性能促进胶原降解，减少胶原沉积。根据酶分解胶原产生的底物主要是羟脯氨酸，通过高效氨基酸分析仪测定羟脯氨酸的含量得出被分解的底物的量，间接推断出酶活性，实验结果表明模型组胶原酶活性高于正常组，汉丹肝乐治疗组潜在和活化的胶原酶活性均明显高于模型组，高剂量治疗组酶活性高于秋水仙碱组；肝内胶原蛋白含量与胶原纤维Masson’s染色半定量分析结果一致，模型组肝内胶原大量沉积，各用药组较之有不同程度减少，差异有显著性意义，其中高剂量组最少，明显低于秋水仙碱组，胶原酶活性与肝内胶原蛋白含量、病理检查结果相符。提示复方中药制剂汉丹肝乐能显著增加猪血清免疫损伤性肝纤维化胶原酶的活性，促进胶原降解，减少肝内胶原纤维的生成及胶原蛋白的含量，减轻肝纤维化程度，延缓肝纤维化的进程。
, 百拇医药
贵州省“九五”攻关项目
陆荫英，女，26岁，硕士
陆荫英(550004 贵阳医学院附属医院传染科)
陆彤(550004 贵阳医学院附属医院传染科)
程明亮(550004 贵阳医学院附属医院传染科)
丁一生(550004 贵阳医学院附属医院传染科)
参考文献
[1]郑少雄，蔡文仪，邱明才. 血尿羟脯氨酸测定方法的改进. 中华医学检验学杂志，1983, 6:
[2]于世瀛，贲长恩，杨美娟. 免疫性和化学损伤性肝纤维化动物模型的比较. 实验动物科学与管理，1995,12: 5.
[3]王爱明，王宝恩. 实验性肝纤维化过程中胶原酶活性的动态变化. 中华肝脏病杂志，1998, 18：213., 百拇医药
摘 要 目的 研究猪血清免疫性肝纤维化的胶原酶活性变化及汉丹肝乐对其的影响。 方法 用猪血清腹腔内注射复制免疫损伤性肝纤维化模型，以汉丹肝乐为治疗组，秋水仙碱作为对照给药，第 12 周处死动物测定肝胶原酶活性，肝胶原纤维染色半定量，肝胶原蛋白含量。 结果 汉丹肝乐能增加胶原酶活性(μg/ml)高剂量组为 3.93、模型组为 2.34。降低肝内胶原纤维及胶原蛋白的含量[每克干肝(mg)高剂量组为 25.45、模型组为 52.25]，高剂量组疗效最佳，明显优于秋水仙碱。 结论 汉丹肝乐能有效增加胶原酶活性，促进胶原降解，抗肝纤维化。
关键词：肝纤维化；模型，免疫学；胶原酶；汉丹肝乐
, 百拇医药
我们用猪血清腹腔内注射复制免疫损伤性肝纤维化动物模型，研究汉丹肝乐对胶原生成及降解的影响。
材料与方法
1.材料：(1)实验动物：雄性Wistar大鼠60只，200～250g，购自贵州省药检所动物室。(2)猪血清：本实验室自制。(3)主要试剂：酸可溶胶原、二氮杂菲购自Sigma公司，Beckman system——6300型高效氨基酸分析仪，其它普通试剂均购自上海化学试剂公司。(4)药物：汉丹肝乐胶囊(主由丹参、汉防己、银杏、黄芪、赤芍等组成)，每粒0.4g，由贵阳制药厂生产；秋水仙碱为云南省昆明植物药厂出品。
2.方法：(1)模型制备及汉丹肝乐治疗：Wistar大鼠随机分为五组，每组 12 只，为正常对照组、肝纤维化模型组、汉丹肝乐低剂量组(0.3g/kg)、汉丹肝乐高剂量组(0.6g/kg)、秋水仙碱组(0.14mg/kg)。除正常对照组外，其余各组实验第一天起给予猪血清腹腔内注射造肝纤维化模型，每次0.5ml/只，每周2次，模型组及正常对照组不给药，其余各组给予相应剂量药物，喂饲加间歇灌胃给药，饲以普通饲料及自来水。第 12 周颈动脉放血处死动物,取肝脏作相应检测。(2)胶原酶活性测定：右叶肝脏冰盐水反复灌洗后迅速投入液氮，以后转-70℃冰箱保存。冰冻状态下肝脏切碎，准确称取100mg加pH7.6Tris-HCl缓冲液1ml，冰水浴条件下匀浆，4℃放置3～4h，离心10min，取上清液备用。实验管1中加入 200μl 样品上清液，0.2%胶原200μl，20μl缓冲液，测定潜在的胶原酶活性；实验管2中加入20μl对氯化汞苯甲酸代替缓冲液作为酶激活剂，测定活化的胶原酶活性；空白管中加入样品上清液200μl，0.1 MTris-HCl缓冲液(pH7.6)220μl。35℃ 24h，0.08mol/L二氮杂菲 20μl终止反应，加入20μl二恶烷沉淀未变性的胶原，离心10min取上清，加等量浓盐酸124～126℃充分水解5h，过滤取滤液于高效氨基酸分析仪测羟脯氨酸含量，羟脯氨酸含量高，被分解的底物量多，胶原酶活性就高，结果为实验管减去空白管值。(3)肝组织胶原蛋白含量测定：参照文献[1]，略有改进。(4)肝脏组织病理切片：部分肝左叶中性甲醛固定24h，石蜡包埋切片Masson’s三色染色胶原纤维半定量分析。正常为—；+：汇管区、小叶中央静脉周围胶原增加；++：汇管区、小叶中央静脉周围胶原进一步增加，胶原开始穿插、分隔肝小叶；+++：胶原纤维较细包绕、分隔肝小叶；++++：胶原纤维隔进一步增宽、增多。(5)统计方法：胶原酶活性测定值及肝胶原蛋白含量采用t 检验法，Masson’s染色半定量采用Ridit检验法。
, 百拇医药
结 果
1.肝组织胶原酶活性变化：模型组胶原酶活性略高于正常组。三个治疗组活化和潜在胶原酶活性显著高于模型组，各治疗组间有显著性差异，高剂量组活性最高，见表 1。
表1 各组大鼠肝组织中胶原酶活性(羟脯氨酸含量mg/L)
组 别
A
L
A/L
正常组
1.14±0.043*
3.62±0.185*
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0.299±0.015
低剂量组
3.11±0.125*△
8.62±0.341*
0.360±0.016
高剂量组
3.93±0.338*△
11.33±0.894*△
0.347±0.012
秋水仙碱组
2.52±0.153*
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7.63±0.427*
0.331±0.006
模型组
2.34±0.230
6.71±0.610
0.343±0.011
* 与模型组比较：t 值正常组为17.42、低剂量组为9.97、高剂量组为13.3、秋水仙碱组为2.15，P 值均<0.05；△ 与秋水仙碱组比较：t 值低剂量组为10.34、高剂量组为13.23(A)，12.95(L)，P 值均<0.05；A 活化的胶原酶活性；L 潜在的胶原酶活性
2.肝胶原蛋白含量测定结果：肝(干肝)胶原蛋白含量(mg/g)正常组 8.33±0.74、汉丹肝乐低剂量组 36.40±4.97、高剂量组 25.45±5.55、秋水仙碱组 36.39±4.79 和模型组 52.25±6.93。与模型组比较，t 值正常组 23.60，低剂量组 7.92、高剂量组 11.88、秋水仙碱组 8.63，P 值均<0.05。各用药组含量均较模型组少，高剂量组低于秋水仙碱组，t＝5.16，P<0.05。
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3.肝胶原纤维Masson’s染色半定量分析：汉丹肝乐治疗组肝胶原纤维量明显较模型组少，见表 2。
表2 Masson’s染色分级
组 别
—
+
++
+++
++++
平均
正常组
12
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3.8
低剂量组*
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高剂量组**△
0
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秋水仙碱组*
0
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模型组
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0
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* 与模型组比较：χ2＝6.02，P<0.05；** 与模型组比较：χ2＝14.02，P<0.01；△ 与秋水仙碱组比较：χ2＝8.25，P<0.05
讨 论
用猪血清复制大鼠肝纤维化模型，较其它模型的整体损伤小，更接近临床病例的发病特点，是理想的肝纤维化模型[2]。
有报道[3]肝硬化阶段大鼠肝内胶原酶活性下降，在恢复过程中其活性升高。因此，增加胶原酶活性能促进胶原降解，减少胶原沉积。根据酶分解胶原产生的底物主要是羟脯氨酸，通过高效氨基酸分析仪测定羟脯氨酸的含量得出被分解的底物的量，间接推断出酶活性，实验结果表明模型组胶原酶活性高于正常组，汉丹肝乐治疗组潜在和活化的胶原酶活性均明显高于模型组，高剂量治疗组酶活性高于秋水仙碱组；肝内胶原蛋白含量与胶原纤维Masson’s染色半定量分析结果一致，模型组肝内胶原大量沉积，各用药组较之有不同程度减少，差异有显著性意义，其中高剂量组最少，明显低于秋水仙碱组，胶原酶活性与肝内胶原蛋白含量、病理检查结果相符。提示复方中药制剂汉丹肝乐能显著增加猪血清免疫损伤性肝纤维化胶原酶的活性，促进胶原降解，减少肝内胶原纤维的生成及胶原蛋白的含量，减轻肝纤维化程度，延缓肝纤维化的进程。
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贵州省“九五”攻关项目
陆荫英，女，26岁，硕士
陆荫英(550004 贵阳医学院附属医院传染科)
陆彤(550004 贵阳医学院附属医院传染科)
程明亮(550004 贵阳医学院附属医院传染科)
丁一生(550004 贵阳医学院附属医院传染科)
参考文献
[1]郑少雄，蔡文仪，邱明才. 血尿羟脯氨酸测定方法的改进. 中华医学检验学杂志，1983, 6:
[2]于世瀛，贲长恩，杨美娟. 免疫性和化学损伤性肝纤维化动物模型的比较. 实验动物科学与管理，1995,12: 5.
[3]王爱明，王宝恩. 实验性肝纤维化过程中胶原酶活性的动态变化. 中华肝脏病杂志，1998, 18：213., 百拇医药