干细胞因子对红白血病细胞系TF-1凋亡的抑制作用
王利红 胡志远 王嘉玺 贺福初
摘 要 目的：探讨干细胞因子(stem cell factor, SCF)阻止红白血病细胞系TF-1进入凋亡程序的作用。方法：进行3H-TdR掺入实验、细胞存活实验、细胞基因组DNA电泳分析和流式细胞术分析。结果：发现TF-1细胞对SCF的反应存在量-半高效关系, 在SCF存在时细胞存活率明显提高，TF-1细胞系在SCF饥饿24 h时出现DNA 梯型条带；流式细胞术检测显示，在SCF饥饿36 h后，在G1峰前出现凋亡特有的AP峰。结论：SCF有阻滞或抑制红白血病细胞系TF-1凋亡的作用。
关键词：干细胞因子；细胞因子依赖细胞系；细胞凋亡
造血生长因子在造血祖细胞的增殖、分化、成熟及存活过程中起着重要的作用。已有文献报道了某些生长因子有阻滞不同造血细胞系凋亡过程的作用[1，2]。干细胞因子(stem cell factor , SCF)又称为c-kit 配基或肥大细胞生长因子(mast cell growth factor , MCGF)，是一种细胞表面受体蛋白c-kit的配基，它可以与粒-巨噬细胞集落刺激因子、红细胞生成素、白介素3等协同作用，刺激和促进多种造血集落的生成，如CFU-GEMM，BFU-E，CFU-GM等[3]，但这类作用在SCF单独作用时很微弱，因此，它可能是加强其他因子的作用信号[4]。此外，它是否参与了阻滞造血祖细胞进入凋亡的作用并不清楚[5]，对此我们进行了研究。
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1 材料和方法
1.1 细胞系及细胞培养
人红白血病细胞系(TF-1)由本室保存，按常规方法体外培养，用RPMI-1640培养液(Gibco公司产品)，含10% FBS(Hyclone公司产品)。浓度为100 ng/ml的SCF(Sigma公司产品)。GM-CSF浓度从10 ng/ml逐步减至1 ng/ml, 在37℃、 5%CO2条件下培养。
1.2 3H-TdR掺入实验
离心收集正常培养的TF-1细胞，用不含细胞因子的培养液(含5%FBS)洗涤3次，调整细胞浓度为5×105个/ml，取100 μl接种于96孔细胞培养板，于37℃、5%CO2条件下培养12 h，加入不同浓度的SCF作用48 h后加入3H-TdR (0.5 μCi/孔)，4 h后收集细胞进行液闪计数。
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1.3 细胞存活实验
细胞培养方法同1.1。实验组加150 ng/ml SCF，37℃、5%CO2培养72 h后台盼蓝染色，用细胞计数板在显微镜下计细胞总数和活细胞数，计算活细胞比例。
1.4 细胞基因组DNA电泳分析
培养12，24，36和48h后，分别收集5×106个细胞，用含2 mmol/L EDTA的PBS洗两次，加入TBE缓冲液(含0.25%NP-40)400 μl，加入RNA酶 A至终浓度为1 mg/ml, 37℃水浴30 min, 再加入蛋白酶K，终浓度为1 mg/ml，继续37℃水浴孵育30 min, 4℃、12 000 r/min离心10 min，取50 μl上清液，1.5%琼脂糖凝胶电泳观察。
1.5 流式细胞术分析
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培养36 h后每个样品收集1×106 细胞，用冷PBS洗两次，70%冷乙醇固定细胞，置4℃保存。染色前将细胞悬浮于PBS中，加RNA酶至终浓度50 μg/ml, 37℃反应30 min, 然后加入碘化丙锭(propidium iodide)至终浓度50 μg/ml，4℃反应30 min，上流式细胞仪测定。观察是否在G1峰前出现凋亡特有的AP峰(apoptosis peak, AP)。
2 结果
2.1 3H-TdR掺入实验
经过长期培养，TF-1细胞系逐渐产生对SCF的依赖性。3H-TdR掺入实验表明，TF-1细胞对SCF有量-半高效关系，在150 ng/ml浓度时达到平台值(图1)。
2.2 细胞存活实验
, 百拇医药
如图2所示，在150 ng/ml SCF存在时，活细胞比例达72%，而对照组只有21%，实验组明显比对照组存活率高(n=3, P<0.05)。
2.3 细胞基因组DNA电泳分析
如图3所示，TF-1细胞系在SCF饥饿24 h时出现DNA梯状条带(ladder)，随着时间延长，此现象逐渐明显。这是典型的细胞凋亡特征。
2.4 流式细胞术分析
流式细胞术检测显示，在SCF饥饿36h 后，在G1峰前出现凋亡特有的AP峰(图4)。
图1 SCF对TF-1细胞系的剂量-效应曲线
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图2 TF-1细胞系在有或无SCF 存在条件下的存活率
图3 TF-1细胞系在SCF饥饿不同时间的基因组
DNA电泳分析
A.48 h; B. 36 h; C. 24 h; D. 12 h; E. DL2000 DNA marker
图4 TF-1细胞系在SCF饥饿后的流式细胞术分析
, 百拇医药
A.对照组含SCF(SCF+); B.实验组无SCF(SCF-)
3 讨论
细胞凋亡过程与正常的胚胎发育、形态改变和各类原始干细胞的分化发育密切相关。对造血系统，在造血中心从卵黄囊迁移到胎肝再到骨髓的过程中细胞凋亡也起重要作用。造血生长因子不仅对造血细胞有促进增殖、分化、成熟的作用，近来还发现造血生长因子有阻滞造血细胞凋亡的作用。
我们在实验中还发现SCF有阻滞或抑制红白血病细胞系TF-1凋亡的作用，其具体机理还不清楚，可能与c-myc表达失调，bcl-2 表达异常及P53对凋亡调控障碍有关。本实验提供了一个研究此机理的体外模型，可以藉此进一步研究白血病细胞的生长和存活以及造血系统与分化发育的机理。■
基金项目 国家自然科学基金重点项目资助课题(39730270)
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作者简介 王利红(1968～)，女，山西阳泉人，助理实验师
王利红(军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850)
胡志远(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
王嘉玺(军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850)
贺福初(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
参考文献
[1]Williams GT. Programmed cell death: apoptosis and oncogenesis[J]. Cell, 1991，65(7):1097
, http://www.100md.com
[2]Liesveld JL, Harbol AW, Abboud CN. Stem cell factor and stromal cell co-culture prevent apoptosis in a subculture of the megakaryoblastic cell line, UT-7[J]. Leuk Res, 1996, 20(7): 591
[3]Broxmeyer HE, Hangoc G, Cooper S et al. Influence of murine mast cell growth factor (c-kit ligand) on colony formation by mouse marrow hematopoietic progenitor cells[J]. Exp Hematol, 1991, 19(2):143
[4]Hendrie PC, Miyazawa K, Yang YC et al. Mast cell growth factor (c-kit) enhances cytokine stimulation of proliferation of the human factor-dependent cell line, M07e[J]Exp Hematol, 1991, 19(10): 1031
[5]Ritchie A, Vadhan-Raj S, Broxmeyer HE. Thrombopoietin suppresses apoptosis and behaves as a survival factor for the human growth factor-dependent cell line, M07e[J]Stem Cells, 1996; 14(3): 330, 百拇医药
摘 要 目的：探讨干细胞因子(stem cell factor, SCF)阻止红白血病细胞系TF-1进入凋亡程序的作用。方法：进行3H-TdR掺入实验、细胞存活实验、细胞基因组DNA电泳分析和流式细胞术分析。结果：发现TF-1细胞对SCF的反应存在量-半高效关系, 在SCF存在时细胞存活率明显提高，TF-1细胞系在SCF饥饿24 h时出现DNA 梯型条带；流式细胞术检测显示，在SCF饥饿36 h后，在G1峰前出现凋亡特有的AP峰。结论：SCF有阻滞或抑制红白血病细胞系TF-1凋亡的作用。
关键词：干细胞因子；细胞因子依赖细胞系；细胞凋亡
造血生长因子在造血祖细胞的增殖、分化、成熟及存活过程中起着重要的作用。已有文献报道了某些生长因子有阻滞不同造血细胞系凋亡过程的作用[1，2]。干细胞因子(stem cell factor , SCF)又称为c-kit 配基或肥大细胞生长因子(mast cell growth factor , MCGF)，是一种细胞表面受体蛋白c-kit的配基，它可以与粒-巨噬细胞集落刺激因子、红细胞生成素、白介素3等协同作用，刺激和促进多种造血集落的生成，如CFU-GEMM，BFU-E，CFU-GM等[3]，但这类作用在SCF单独作用时很微弱，因此，它可能是加强其他因子的作用信号[4]。此外，它是否参与了阻滞造血祖细胞进入凋亡的作用并不清楚[5]，对此我们进行了研究。
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1 材料和方法
1.1 细胞系及细胞培养
人红白血病细胞系(TF-1)由本室保存，按常规方法体外培养，用RPMI-1640培养液(Gibco公司产品)，含10% FBS(Hyclone公司产品)。浓度为100 ng/ml的SCF(Sigma公司产品)。GM-CSF浓度从10 ng/ml逐步减至1 ng/ml, 在37℃、 5%CO2条件下培养。
1.2 3H-TdR掺入实验
离心收集正常培养的TF-1细胞，用不含细胞因子的培养液(含5%FBS)洗涤3次，调整细胞浓度为5×105个/ml，取100 μl接种于96孔细胞培养板，于37℃、5%CO2条件下培养12 h，加入不同浓度的SCF作用48 h后加入3H-TdR (0.5 μCi/孔)，4 h后收集细胞进行液闪计数。
, 百拇医药
1.3 细胞存活实验
细胞培养方法同1.1。实验组加150 ng/ml SCF，37℃、5%CO2培养72 h后台盼蓝染色，用细胞计数板在显微镜下计细胞总数和活细胞数，计算活细胞比例。
1.4 细胞基因组DNA电泳分析
培养12，24，36和48h后，分别收集5×106个细胞，用含2 mmol/L EDTA的PBS洗两次，加入TBE缓冲液(含0.25%NP-40)400 μl，加入RNA酶 A至终浓度为1 mg/ml, 37℃水浴30 min, 再加入蛋白酶K，终浓度为1 mg/ml，继续37℃水浴孵育30 min, 4℃、12 000 r/min离心10 min，取50 μl上清液，1.5%琼脂糖凝胶电泳观察。
1.5 流式细胞术分析
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培养36 h后每个样品收集1×106 细胞，用冷PBS洗两次，70%冷乙醇固定细胞，置4℃保存。染色前将细胞悬浮于PBS中，加RNA酶至终浓度50 μg/ml, 37℃反应30 min, 然后加入碘化丙锭(propidium iodide)至终浓度50 μg/ml，4℃反应30 min，上流式细胞仪测定。观察是否在G1峰前出现凋亡特有的AP峰(apoptosis peak, AP)。
2 结果
2.1 3H-TdR掺入实验
经过长期培养，TF-1细胞系逐渐产生对SCF的依赖性。3H-TdR掺入实验表明，TF-1细胞对SCF有量-半高效关系，在150 ng/ml浓度时达到平台值(图1)。
2.2 细胞存活实验
, 百拇医药
如图2所示，在150 ng/ml SCF存在时，活细胞比例达72%，而对照组只有21%，实验组明显比对照组存活率高(n=3, P<0.05)。
2.3 细胞基因组DNA电泳分析
如图3所示，TF-1细胞系在SCF饥饿24 h时出现DNA梯状条带(ladder)，随着时间延长，此现象逐渐明显。这是典型的细胞凋亡特征。
2.4 流式细胞术分析
流式细胞术检测显示，在SCF饥饿36h 后，在G1峰前出现凋亡特有的AP峰(图4)。
图1 SCF对TF-1细胞系的剂量-效应曲线
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图2 TF-1细胞系在有或无SCF 存在条件下的存活率
图3 TF-1细胞系在SCF饥饿不同时间的基因组
DNA电泳分析
A.48 h; B. 36 h; C. 24 h; D. 12 h; E. DL2000 DNA marker
图4 TF-1细胞系在SCF饥饿后的流式细胞术分析
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A.对照组含SCF(SCF+); B.实验组无SCF(SCF-)
3 讨论
细胞凋亡过程与正常的胚胎发育、形态改变和各类原始干细胞的分化发育密切相关。对造血系统，在造血中心从卵黄囊迁移到胎肝再到骨髓的过程中细胞凋亡也起重要作用。造血生长因子不仅对造血细胞有促进增殖、分化、成熟的作用，近来还发现造血生长因子有阻滞造血细胞凋亡的作用。
我们在实验中还发现SCF有阻滞或抑制红白血病细胞系TF-1凋亡的作用，其具体机理还不清楚，可能与c-myc表达失调，bcl-2 表达异常及P53对凋亡调控障碍有关。本实验提供了一个研究此机理的体外模型，可以藉此进一步研究白血病细胞的生长和存活以及造血系统与分化发育的机理。■
基金项目 国家自然科学基金重点项目资助课题(39730270)
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作者简介 王利红(1968～)，女，山西阳泉人，助理实验师
王利红(军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850)
胡志远(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
王嘉玺(军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850)
贺福初(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
参考文献
[1]Williams GT. Programmed cell death: apoptosis and oncogenesis[J]. Cell, 1991，65(7):1097
, http://www.100md.com
[2]Liesveld JL, Harbol AW, Abboud CN. Stem cell factor and stromal cell co-culture prevent apoptosis in a subculture of the megakaryoblastic cell line, UT-7[J]. Leuk Res, 1996, 20(7): 591
[3]Broxmeyer HE, Hangoc G, Cooper S et al. Influence of murine mast cell growth factor (c-kit ligand) on colony formation by mouse marrow hematopoietic progenitor cells[J]. Exp Hematol, 1991, 19(2):143
[4]Hendrie PC, Miyazawa K, Yang YC et al. Mast cell growth factor (c-kit) enhances cytokine stimulation of proliferation of the human factor-dependent cell line, M07e[J]Exp Hematol, 1991, 19(10): 1031
[5]Ritchie A, Vadhan-Raj S, Broxmeyer HE. Thrombopoietin suppresses apoptosis and behaves as a survival factor for the human growth factor-dependent cell line, M07e[J]Stem Cells, 1996; 14(3): 330, 百拇医药