人原发性肝癌细胞株受照射后凋亡与癌基因表达
陈晓品 何少琴 冯炎
摘 要 目的 探讨人原发性肝癌细胞株受照射后凋亡与bcl-2、p53基因表达产物关系。 方法 选择人原发性肝癌细胞株QGY-7703，180KvX线照射，流式细胞仪技术定量测定凋亡发生率，单克隆抗体免疫组化法测定受照射后bcl-2、p53表达产物，Sony Mias-300 Spato图象分析仪分析结果。 结果 QGY-7730细胞株自发凋亡率为4.79%，随照射后时间延长及照射剂量增加凋亡发生率增加。Bcl-2、p53基因表达产物阳性率随照射后时间延长而增加，在照射后6h达峰值。 结论 照射后凋亡发生率与细胞群内在特性有关，p53及bcl-2基因表达产物阳性率峰值在照射后凋亡峰值之前数小时，提示它们共同参与了照射后凋亡的调控。
关键词：癌，肝细胞；辐射；凋亡；基因，p53；bcl-2
, http://www.100md.com
选择人原发性肝癌细胞株QGY-7703，研究其受照射后凋亡发生与p53、bcl-2基因表达产物关系，进一步了解肝癌的放射生物学特性及其内在机制。
材料与方法
1.细胞与培养：人原发性肝癌细胞株：QGY-7703来自中国科学院细胞生物研究所，为单层贴壁生长。培养液为RPMI-1640培养基，内含20%牛血清(上海放射医学研究所产品)，青霉素1万单位/100ml，链霉素10mg/100ml，将细胞置于37℃，5%CO2培养箱内培养至指数生长期进行实验，细胞消化用0.25%胰酶EDTA溶液。
2.照射条件：照射用深度X线机，管电压180kv，管电流15mA，0.25mm 铜滤过，照射野10cm×15cm，源皮距为80cm，剂量率为83cGy/min。
3.流式细胞仪检测凋亡：细胞用无水乙醇固定，Triton X-100穿透，RNA酶去除RNA，PI染色，Facsliber流式细胞仪检测，结果以直方图表示，分析用Modfit软件。
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4.基因表达产物免疫组化检测：滴片法制作细胞涂片，乙醚乙醇固定，单克隆抗体(Dokta公司)免疫组化法检测p53和bcl-2表达情况。p53及bcl-2单克隆抗体工作浓度分别为1:30，1:40；加鼠二抗，ABC试剂盒(华美公司，上海)底物DAB显色，以细胞核内有棕色颗粒者为阳性。结果分析用Sony Mias-300 Spato图像分析仪，以阳性率表示，简而言之，设定阳性细胞灰度值，以此值为标准，计数阳性细胞，其在受检细胞中所占比例即阳性率。
结 果
1.照射后凋亡发生规律：流式细胞仪定量测定表明，QGY-7703细胞株自发凋亡率为4.79%。随着照射后孵育时间延长，凋亡增加，在照射后12～24h内达峰值并稳定。在10Gy以下剂量范围内，照射后凋亡随剂量增加而增加，但增加幅度逐渐变小[1]。
2. p53，bcl-2表达产物免疫组化结果：未照射的QGY-7703细胞株在细胞涂片单克隆抗体免疫组化法测定时，有微弱的p53和bcl-2表达，随照射后时间延长，两种基因表达产物阳性率增加，在照射后6h达峰值，随后即下降。增加照射剂量可使二者表达增加，8Gy左右达峰值，此后即平稳，结果见表1、2。
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表1 QGY-7703受照射后p53及bcl-2表达与
时间关系(阳性率%)
组别
照射后时间(h)
0
4
6
12
p53
34.1±2.8
37.2±3.0
54.4±4.7
, 百拇医药
46.6±3.8
bcl-2
27.4±3.8
31.7±2.7
42.8±4.6
35.2±2.3
表2 QGY-7703受照射后6小时p53及
bcl-2表达与剂量关系(阳性率%)
组别
照射剂量(Gy)
0
4
, 百拇医药
8
10
p53
19.0±2.7
28.6±2.8
54.4±4.7
57.6±4.4
bcl-2
16.6±3.1
23.6±4.2
42.8±4.6
38.6±4.5
, 百拇医药
讨 论
未受治疗的肿瘤本身有一定程度的自发凋亡，其水平与肿瘤病理类型有关，以淋巴造血系统的肿瘤最为显著[2]。几种人类实体瘤及动物移植性肿瘤的研究提示，肿瘤治疗前的自发凋亡水平及照射后的凋亡情况与放射敏感性有关。自发凋亡明显者，其放射敏感性高，照射后凋亡增加明显者，肿瘤局部控制率和患者生存率较高[3]。
本研究提示，人原发性肝癌细胞株QGY-7703的自发凋亡率较低，可部分解释肝癌放射敏感性较差这一现象。而照射后凋亡增加达一定程度后稳定在一峰值，表明细胞群中凋亡易感细胞的比例较为恒定，代表了该肿瘤细胞群对照射的特征性反应。达峰值后持续一定时间则与体外实验中凋亡细胞不能及时清除有关。
p53基因是一种抑癌基因，与细胞凋亡有密切的关系。野生型p53基因对凋亡有促进作用，突变型p53则丧失了启动凋亡的能力，这种突变在大多数人类肿瘤中存在。突变型p53蛋白由于构型改变，半衰期延长而在瘤细胞中大量累积使其水平升高，可用免疫学方法测定[4]。bcl-2基因广泛存在于多种类型肿瘤细胞中，其基因产物通过抵抗细胞的死亡，延长细胞寿命导致细胞数目增加，对凋亡有抑制作用[5]。受照射后，QGY-7703细胞中此两种基因表达增强，是照射后肿瘤细胞基因改变中的一部分。它们在照射后6小时左右表达阳性率最高，此时间进程在照射后凋亡峰值之前数小时，随后即下降，此结果提示它们共同参与了照射后凋亡的调控。
, 百拇医药
陈晓品，男，36岁，主任，博士，主要从事肿瘤放射治疗临床工作，发表论文10篇
陈晓品(400016 重庆，重庆医科大学附属第一医院)
何少琴(上海医科大学肿瘤医院)
冯炎(上海医科大学肿瘤医院)
参考文献
[1]陈晓品，何少琴，冯炎. 照射诱发人肝癌细胞株凋亡观察. 中国癌症杂志，1998，2: 97-99.
[2]Staunton MJ，Gaffney EF. Tumor type is a determinant of susceptibility to apoptosis. Am J Clin Pathol，1995，103: 300-307.
, 百拇医药
[3]Levine EL，Renehan A，Gossiel R，et al. Apoptosis，intrinsic radiosensitivity and prediction of radiotherapy response in cervical carcinoma. Radiother Oncol，1995，37: 1.
[4]Steller H. Mechanisms and genes of cellular suicide. Science，1995，267: 1445-1449.
[5]Reed JC，Bcl-2 and the regulation of programmed cell death. J Cell Biol，1994，124: 1-6., 百拇医药
摘 要 目的 探讨人原发性肝癌细胞株受照射后凋亡与bcl-2、p53基因表达产物关系。 方法 选择人原发性肝癌细胞株QGY-7703，180KvX线照射，流式细胞仪技术定量测定凋亡发生率，单克隆抗体免疫组化法测定受照射后bcl-2、p53表达产物，Sony Mias-300 Spato图象分析仪分析结果。 结果 QGY-7730细胞株自发凋亡率为4.79%，随照射后时间延长及照射剂量增加凋亡发生率增加。Bcl-2、p53基因表达产物阳性率随照射后时间延长而增加，在照射后6h达峰值。 结论 照射后凋亡发生率与细胞群内在特性有关，p53及bcl-2基因表达产物阳性率峰值在照射后凋亡峰值之前数小时，提示它们共同参与了照射后凋亡的调控。
关键词：癌，肝细胞；辐射；凋亡；基因，p53；bcl-2
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选择人原发性肝癌细胞株QGY-7703，研究其受照射后凋亡发生与p53、bcl-2基因表达产物关系，进一步了解肝癌的放射生物学特性及其内在机制。
材料与方法
1.细胞与培养：人原发性肝癌细胞株：QGY-7703来自中国科学院细胞生物研究所，为单层贴壁生长。培养液为RPMI-1640培养基，内含20%牛血清(上海放射医学研究所产品)，青霉素1万单位/100ml，链霉素10mg/100ml，将细胞置于37℃，5%CO2培养箱内培养至指数生长期进行实验，细胞消化用0.25%胰酶EDTA溶液。
2.照射条件：照射用深度X线机，管电压180kv，管电流15mA，0.25mm 铜滤过，照射野10cm×15cm，源皮距为80cm，剂量率为83cGy/min。
3.流式细胞仪检测凋亡：细胞用无水乙醇固定，Triton X-100穿透，RNA酶去除RNA，PI染色，Facsliber流式细胞仪检测，结果以直方图表示，分析用Modfit软件。
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4.基因表达产物免疫组化检测：滴片法制作细胞涂片，乙醚乙醇固定，单克隆抗体(Dokta公司)免疫组化法检测p53和bcl-2表达情况。p53及bcl-2单克隆抗体工作浓度分别为1:30，1:40；加鼠二抗，ABC试剂盒(华美公司，上海)底物DAB显色，以细胞核内有棕色颗粒者为阳性。结果分析用Sony Mias-300 Spato图像分析仪，以阳性率表示，简而言之，设定阳性细胞灰度值，以此值为标准，计数阳性细胞，其在受检细胞中所占比例即阳性率。
结 果
1.照射后凋亡发生规律：流式细胞仪定量测定表明，QGY-7703细胞株自发凋亡率为4.79%。随着照射后孵育时间延长，凋亡增加，在照射后12～24h内达峰值并稳定。在10Gy以下剂量范围内，照射后凋亡随剂量增加而增加，但增加幅度逐渐变小[1]。
2. p53，bcl-2表达产物免疫组化结果：未照射的QGY-7703细胞株在细胞涂片单克隆抗体免疫组化法测定时，有微弱的p53和bcl-2表达，随照射后时间延长，两种基因表达产物阳性率增加，在照射后6h达峰值，随后即下降。增加照射剂量可使二者表达增加，8Gy左右达峰值，此后即平稳，结果见表1、2。
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表1 QGY-7703受照射后p53及bcl-2表达与
时间关系(阳性率%)
组别
照射后时间(h)
0
4
6
12
p53
34.1±2.8
37.2±3.0
54.4±4.7
, 百拇医药
46.6±3.8
bcl-2
27.4±3.8
31.7±2.7
42.8±4.6
35.2±2.3
表2 QGY-7703受照射后6小时p53及
bcl-2表达与剂量关系(阳性率%)
组别
照射剂量(Gy)
0
4
, 百拇医药
8
10
p53
19.0±2.7
28.6±2.8
54.4±4.7
57.6±4.4
bcl-2
16.6±3.1
23.6±4.2
42.8±4.6
38.6±4.5
, 百拇医药
讨 论
未受治疗的肿瘤本身有一定程度的自发凋亡，其水平与肿瘤病理类型有关，以淋巴造血系统的肿瘤最为显著[2]。几种人类实体瘤及动物移植性肿瘤的研究提示，肿瘤治疗前的自发凋亡水平及照射后的凋亡情况与放射敏感性有关。自发凋亡明显者，其放射敏感性高，照射后凋亡增加明显者，肿瘤局部控制率和患者生存率较高[3]。
本研究提示，人原发性肝癌细胞株QGY-7703的自发凋亡率较低，可部分解释肝癌放射敏感性较差这一现象。而照射后凋亡增加达一定程度后稳定在一峰值，表明细胞群中凋亡易感细胞的比例较为恒定，代表了该肿瘤细胞群对照射的特征性反应。达峰值后持续一定时间则与体外实验中凋亡细胞不能及时清除有关。
p53基因是一种抑癌基因，与细胞凋亡有密切的关系。野生型p53基因对凋亡有促进作用，突变型p53则丧失了启动凋亡的能力，这种突变在大多数人类肿瘤中存在。突变型p53蛋白由于构型改变，半衰期延长而在瘤细胞中大量累积使其水平升高，可用免疫学方法测定[4]。bcl-2基因广泛存在于多种类型肿瘤细胞中，其基因产物通过抵抗细胞的死亡，延长细胞寿命导致细胞数目增加，对凋亡有抑制作用[5]。受照射后，QGY-7703细胞中此两种基因表达增强，是照射后肿瘤细胞基因改变中的一部分。它们在照射后6小时左右表达阳性率最高，此时间进程在照射后凋亡峰值之前数小时，随后即下降，此结果提示它们共同参与了照射后凋亡的调控。
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陈晓品，男，36岁，主任，博士，主要从事肿瘤放射治疗临床工作，发表论文10篇
陈晓品(400016 重庆，重庆医科大学附属第一医院)
何少琴(上海医科大学肿瘤医院)
冯炎(上海医科大学肿瘤医院)
参考文献
[1]陈晓品，何少琴，冯炎. 照射诱发人肝癌细胞株凋亡观察. 中国癌症杂志，1998，2: 97-99.
[2]Staunton MJ，Gaffney EF. Tumor type is a determinant of susceptibility to apoptosis. Am J Clin Pathol，1995，103: 300-307.
, 百拇医药
[3]Levine EL，Renehan A，Gossiel R，et al. Apoptosis，intrinsic radiosensitivity and prediction of radiotherapy response in cervical carcinoma. Radiother Oncol，1995，37: 1.
[4]Steller H. Mechanisms and genes of cellular suicide. Science，1995，267: 1445-1449.
[5]Reed JC，Bcl-2 and the regulation of programmed cell death. J Cell Biol，1994，124: 1-6., 百拇医药