尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶的基因克隆及在原核细胞中的表达
张群伟 张雪峰 黎文亮 葛忠良
摘 要 目的：尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶是催化黄原胶生成的酶类之一,设想通过增加酶量来达到提高黄原胶产量的最终目的。方法：提取基因组DNA作为模板,通过PCR扩增得到酶基因,经DNA体外重组构建表达质粒。结果：实现在大肠杆菌中的表达,并成功转化黄原胶菌株。转化过程提示黄原胶菌株可能具有某些特殊性。与文献报道比较有异同点。
关键词：尿苷二磷酸葡糖脱氢酶；黄单胞菌属；基因表达
黄原胶是由野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)分泌的胞外杂多糖,是目前产量最高的微生物多糖之一，具有假塑性、温度和pH稳定性，以及与盐类良好的相容性,广泛应用于食品、石油、化工、医药等领域[1]。国外关于黄原胶的研究从20世纪60年代起步，国内自70年代开始，包括菌种选育、发酵工艺研究、黄原胶理化性质探讨及其免疫学活性分析等。经查阅资料发现，在黄原胶的合成过程中，含糖的底物需要尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶(uridine diphosphate glucose dehydrogenase,UDPGD)的催化才能生成葡萄糖醛酸，而后者是黄原胶生物合成的前体之一。故此，我们设想以黄原胶菌株基因组DNA为模板,通过合成引物、扩增、克隆得到UDPGD基因，在实现大肠杆菌的表达后，再转入原黄原胶菌株，希望UDPGD酶量的增加能够带来黄原胶产量增加的正效应。文献报道UDPGD基因全长1 338 bp，285 bp处含PstⅠ切点，740 bp处含BamHⅠ切点，编码445个氨基酸，蛋白相对分子质量48 432[2]。经过实验，我们对UDPGD的研究工作取得了初步结果。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 黄原胶菌株4-2由江苏金湖黄原胶厂提供的4号菌株选育而来,为假单胞菌科黄单胞菌属,G-杆菌,严格需氧,最适生长温度28～30℃。大肠菌JM101、JM109、HB101、DH5α为本室保存。
1.1.2 质粒 克隆载体pGEM-T Easy购自华美公司,两末端为T，紧接包括EcoRI在内的多克隆位点。表达载体pBV321、pBV220为本室保存。
1.1.3 工具酶及试剂 蛋白酶K、Taq酶、PCR产物纯化试剂盒、T4连接酶、EcoRⅠ、BamHⅠ和分子量标准分别购自华美公司和经科公司，试剂为国产分析纯。
1.2 基因组DNA的制备和质粒高压电转法
, 百拇医药
参考文献[3]。电转条件：电压1.5 kV,电容330 μF,电阻400 Ω。
1.3 聚合酶链反应
计算机辅助设计引物,上游引物5′-ACCCATGCGAGTTGCGATCT-3′,下游引物5′-CGGCGAGAGAGTTGCTCATGCA-3′,由赛佰盛公司合成。扩增条件:95℃10 min，94.5℃90 s，58℃90 s，72℃90 s共30个循环，72℃10 min。
1.4 DNA连接、转化、提取、酶切、回收
参考文献[4]。
1.5 序列测定及分析
DNA序列由上海博亚公司测定。结果分析使用Goldkey软件完成。
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1.6 表达产物的SDS-PAGE
含重组质粒的细菌30℃过夜培养，次晨以1%复种，培养至D600 nm 0.4～0.5时升温至42℃诱导表达不同时间。取培养液1.5 ml离心收菌，以25 μl H2O重悬菌体，振匀后加入等体积2倍上样缓冲液，煮沸5 min，取适量电泳，并染色、脱色。
1.7 假单胞菌的转化
参考文献[5]。
2 结果
2.1 基因扩增
提取4-2菌株基因组DNA为模板作PCR。取扩增产物进行电泳鉴定，可见在约1 300 bp处有较浓的扩增带(图1)，与预期大小一致，回收。
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图1 UDPGD基因的扩增
1.λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ；2.PCR产物
2.2 克隆质粒的构建
利用扩增片段末端为A的特点，将回收的UDPGD DNA片段与pGEM-T Easy载体通过T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，挑选重组子扩大培养，提取质粒酶切鉴定。经EcoRⅠ单酶切，得到1 338 bp片段；经EooRⅠ和BamHⅠ双酶切，得到598 bp和740 bp两个片段；经EcoRⅠ和PstⅠ双酶切，得到285 bp和1 053 bp两个片段(图2)，表明UDPGD DNA片段已被正确重组至pGEM-T Easy载体中。
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图2 UDPGD的酶切鉴定
1.λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ；2.EcoRⅠ；
3.EcoRⅠ+BamHⅠ；4.EcoRⅠ+PstⅠ
2.3 表达质粒的构建和在大肠菌中的表达
考虑到pBV321的诱导温度与黄原胶4-2菌株较为接近，故先选用。将克隆质粒以EcoRⅠ酶切，回收UDPGD DNA片段，pBV321同样酶切，二者连接成为表达质粒，用氯化钙法转化DH5α，鉴定正确后挑选重组子以终浓度50 μg/ml吲哚乙酸37℃诱导1～6 h，未见蛋白表达。遂用pBV200按上述同样方法酶切、连接；转化至JM101、JM109、HB101和DH5α。将鉴定正确的重组子以42℃诱导表达4 h，SDS-PAGE显示在相对分子质量约48 000处均有明确表达条带，似以JM109略好。进一步选择JM109用高压电转法导入上述表达质粒，42℃诱导1～6 h，经扫描5 h蛋白表达量约8.5%(图3)。
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图3 JM109-UDPGD/pBV220的表达
1.相对分子质量标准；2.未诱导对照；3～8.诱导1～6 h
2.4 表达质粒对黄原胶菌株的转化
将上述表达质粒转入黄原胶4-2菌株时，单纯使用大肠杆菌常用的氯化钙法未转化成功，使用与黄原胶菌株同科的假单胞细菌转化方法亦未成功，经过多次实验，最终使用假单胞菌法而细胞量需浓缩3倍制成4-2感受态，使用大肠杆菌高压电转法的一般条件，将表达质粒pBV220-UDPGD成功转入4-2菌株中，在含氨苄西林(Amp)平板上生长良好。其菌落与转化前的普通4-2菌落相比，胶状菌落略有增大(图4)。
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图4 UDPGD转化4-2菌株前后菌落形态比较
1.转化前；2.转化后
3 讨论
我们经克隆得到了UDPGD基因片段，酶切鉴定正确，实现在大肠杆菌中表达并成功转入黄原胶菌株，与实验设想一致。在与文献比较时我们注意到，本实验得到的UDPGD DNA大小、酶切点位置及表达产物相对分子质量与文献报道[2]一致，但序列中不同处较多，主要表现在810 bp前有十余处碱基并编码的氨基酸不同，810 bp后有7处分别增加G或C。如果同报道的氨基酸序列比较，有4个不同点可能处于蛋白功能位点上。这些差异可能因菌株不同而处于不同的DNA基因组[6]，与细菌DNA的多态性有关，尚需进一步证实。在本实验中黄原胶菌株的转化是以改进的假单胞菌法制备感受态并与一般大肠杆菌高压电转条件的结合完成的,提示了黄原胶菌株这种G-杆菌可能具有某些特殊性。文献报道是将UDPGD转入野生菌株的突变株，但转入原产胶株的尚未见报道。经初步测定,转化后黄原胶菌株内UDPGD酶活性有增高趋势。含UDPGD的菌落有所增大，提示有产胶量增加的可能性。本工作可能为研究黄原胶提供新的途径，对于黄原胶的工业生产具有潜在应用价值。
, 百拇医药
[作者简介]张群伟(1960-)，女，北京人，实验师。
张群伟(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
张雪峰(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
黎文亮(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
葛忠良(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
参考文献
[1]陈陶声.近代工业微生物学(下册)[M].上海：上海科学技术出版社，1982.540～546.
[2]Lin CS,Lin NT,Yang BY，et al.Nucleotide sequence and expression of UDP-glucose dehydrogenase gene required for the synthesis of xanthan gum in Xanthomonas campestris[J].Biochem Biophys Res Commun,1995,207(1):223～230.
[3]Ausubel FM,Brent R,Kingston RE，et al.颜子颖,王海林译.精编分子生物学实验指南[M].北京：科学出版社，1998.23～39.
[4]Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.金冬雁,黎孟枫等译.分子克隆实验指南[M].第2版.北京.科学出版社，1992.19～324.
[5]李永明，赵玉琪.实用分子生物学方法手册[M].北京.科学出版社，1998.78.
[6]郭亚辉.黄单胞菌属的分类研究进展[J].微生物学杂志.1997，17(4):50., http://www.100md.com
摘 要 目的：尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶是催化黄原胶生成的酶类之一,设想通过增加酶量来达到提高黄原胶产量的最终目的。方法：提取基因组DNA作为模板,通过PCR扩增得到酶基因,经DNA体外重组构建表达质粒。结果：实现在大肠杆菌中的表达,并成功转化黄原胶菌株。转化过程提示黄原胶菌株可能具有某些特殊性。与文献报道比较有异同点。
关键词：尿苷二磷酸葡糖脱氢酶；黄单胞菌属；基因表达
黄原胶是由野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)分泌的胞外杂多糖,是目前产量最高的微生物多糖之一，具有假塑性、温度和pH稳定性，以及与盐类良好的相容性,广泛应用于食品、石油、化工、医药等领域[1]。国外关于黄原胶的研究从20世纪60年代起步，国内自70年代开始，包括菌种选育、发酵工艺研究、黄原胶理化性质探讨及其免疫学活性分析等。经查阅资料发现，在黄原胶的合成过程中，含糖的底物需要尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶(uridine diphosphate glucose dehydrogenase,UDPGD)的催化才能生成葡萄糖醛酸，而后者是黄原胶生物合成的前体之一。故此，我们设想以黄原胶菌株基因组DNA为模板,通过合成引物、扩增、克隆得到UDPGD基因，在实现大肠杆菌的表达后，再转入原黄原胶菌株，希望UDPGD酶量的增加能够带来黄原胶产量增加的正效应。文献报道UDPGD基因全长1 338 bp，285 bp处含PstⅠ切点，740 bp处含BamHⅠ切点，编码445个氨基酸，蛋白相对分子质量48 432[2]。经过实验，我们对UDPGD的研究工作取得了初步结果。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 黄原胶菌株4-2由江苏金湖黄原胶厂提供的4号菌株选育而来,为假单胞菌科黄单胞菌属,G-杆菌,严格需氧,最适生长温度28～30℃。大肠菌JM101、JM109、HB101、DH5α为本室保存。
1.1.2 质粒 克隆载体pGEM-T Easy购自华美公司,两末端为T，紧接包括EcoRI在内的多克隆位点。表达载体pBV321、pBV220为本室保存。
1.1.3 工具酶及试剂 蛋白酶K、Taq酶、PCR产物纯化试剂盒、T4连接酶、EcoRⅠ、BamHⅠ和分子量标准分别购自华美公司和经科公司，试剂为国产分析纯。
1.2 基因组DNA的制备和质粒高压电转法
, 百拇医药
参考文献[3]。电转条件：电压1.5 kV,电容330 μF,电阻400 Ω。
1.3 聚合酶链反应
计算机辅助设计引物,上游引物5′-ACCCATGCGAGTTGCGATCT-3′,下游引物5′-CGGCGAGAGAGTTGCTCATGCA-3′,由赛佰盛公司合成。扩增条件:95℃10 min，94.5℃90 s，58℃90 s，72℃90 s共30个循环，72℃10 min。
1.4 DNA连接、转化、提取、酶切、回收
参考文献[4]。
1.5 序列测定及分析
DNA序列由上海博亚公司测定。结果分析使用Goldkey软件完成。
, http://www.100md.com
1.6 表达产物的SDS-PAGE
含重组质粒的细菌30℃过夜培养，次晨以1%复种，培养至D600 nm 0.4～0.5时升温至42℃诱导表达不同时间。取培养液1.5 ml离心收菌，以25 μl H2O重悬菌体，振匀后加入等体积2倍上样缓冲液，煮沸5 min，取适量电泳，并染色、脱色。
1.7 假单胞菌的转化
参考文献[5]。
2 结果
2.1 基因扩增
提取4-2菌株基因组DNA为模板作PCR。取扩增产物进行电泳鉴定，可见在约1 300 bp处有较浓的扩增带(图1)，与预期大小一致，回收。
, 百拇医药
图1 UDPGD基因的扩增
1.λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ；2.PCR产物
2.2 克隆质粒的构建
利用扩增片段末端为A的特点，将回收的UDPGD DNA片段与pGEM-T Easy载体通过T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，挑选重组子扩大培养，提取质粒酶切鉴定。经EcoRⅠ单酶切，得到1 338 bp片段；经EooRⅠ和BamHⅠ双酶切，得到598 bp和740 bp两个片段；经EcoRⅠ和PstⅠ双酶切，得到285 bp和1 053 bp两个片段(图2)，表明UDPGD DNA片段已被正确重组至pGEM-T Easy载体中。
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图2 UDPGD的酶切鉴定
1.λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ；2.EcoRⅠ；
3.EcoRⅠ+BamHⅠ；4.EcoRⅠ+PstⅠ
2.3 表达质粒的构建和在大肠菌中的表达
考虑到pBV321的诱导温度与黄原胶4-2菌株较为接近，故先选用。将克隆质粒以EcoRⅠ酶切，回收UDPGD DNA片段，pBV321同样酶切，二者连接成为表达质粒，用氯化钙法转化DH5α，鉴定正确后挑选重组子以终浓度50 μg/ml吲哚乙酸37℃诱导1～6 h，未见蛋白表达。遂用pBV200按上述同样方法酶切、连接；转化至JM101、JM109、HB101和DH5α。将鉴定正确的重组子以42℃诱导表达4 h，SDS-PAGE显示在相对分子质量约48 000处均有明确表达条带，似以JM109略好。进一步选择JM109用高压电转法导入上述表达质粒，42℃诱导1～6 h，经扫描5 h蛋白表达量约8.5%(图3)。
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图3 JM109-UDPGD/pBV220的表达
1.相对分子质量标准；2.未诱导对照；3～8.诱导1～6 h
2.4 表达质粒对黄原胶菌株的转化
将上述表达质粒转入黄原胶4-2菌株时，单纯使用大肠杆菌常用的氯化钙法未转化成功，使用与黄原胶菌株同科的假单胞细菌转化方法亦未成功，经过多次实验，最终使用假单胞菌法而细胞量需浓缩3倍制成4-2感受态，使用大肠杆菌高压电转法的一般条件，将表达质粒pBV220-UDPGD成功转入4-2菌株中，在含氨苄西林(Amp)平板上生长良好。其菌落与转化前的普通4-2菌落相比，胶状菌落略有增大(图4)。
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图4 UDPGD转化4-2菌株前后菌落形态比较
1.转化前；2.转化后
3 讨论
我们经克隆得到了UDPGD基因片段，酶切鉴定正确，实现在大肠杆菌中表达并成功转入黄原胶菌株，与实验设想一致。在与文献比较时我们注意到，本实验得到的UDPGD DNA大小、酶切点位置及表达产物相对分子质量与文献报道[2]一致，但序列中不同处较多，主要表现在810 bp前有十余处碱基并编码的氨基酸不同，810 bp后有7处分别增加G或C。如果同报道的氨基酸序列比较，有4个不同点可能处于蛋白功能位点上。这些差异可能因菌株不同而处于不同的DNA基因组[6]，与细菌DNA的多态性有关，尚需进一步证实。在本实验中黄原胶菌株的转化是以改进的假单胞菌法制备感受态并与一般大肠杆菌高压电转条件的结合完成的,提示了黄原胶菌株这种G-杆菌可能具有某些特殊性。文献报道是将UDPGD转入野生菌株的突变株，但转入原产胶株的尚未见报道。经初步测定,转化后黄原胶菌株内UDPGD酶活性有增高趋势。含UDPGD的菌落有所增大，提示有产胶量增加的可能性。本工作可能为研究黄原胶提供新的途径，对于黄原胶的工业生产具有潜在应用价值。
, 百拇医药
[作者简介]张群伟(1960-)，女，北京人，实验师。
张群伟(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
张雪峰(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
黎文亮(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
葛忠良(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
参考文献
[1]陈陶声.近代工业微生物学(下册)[M].上海：上海科学技术出版社，1982.540～546.
[2]Lin CS,Lin NT,Yang BY，et al.Nucleotide sequence and expression of UDP-glucose dehydrogenase gene required for the synthesis of xanthan gum in Xanthomonas campestris[J].Biochem Biophys Res Commun,1995,207(1):223～230.
[3]Ausubel FM,Brent R,Kingston RE，et al.颜子颖,王海林译.精编分子生物学实验指南[M].北京：科学出版社，1998.23～39.
[4]Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.金冬雁,黎孟枫等译.分子克隆实验指南[M].第2版.北京.科学出版社，1992.19～324.
[5]李永明，赵玉琪.实用分子生物学方法手册[M].北京.科学出版社，1998.78.
[6]郭亚辉.黄单胞菌属的分类研究进展[J].微生物学杂志.1997，17(4):50., http://www.100md.com