碱性成纤维细胞生长因子与透明质酸对培养兔软骨细胞的作用
碱性成纤维细胞生长因子与透明质酸对培养兔软骨细胞的作用
沈雁 唐毅 李斯明 钟灿灿 梁佩红
摘 要 目的 探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)与透明质酸(HA)对兔软骨细胞的增殖影响及其协同作用。 方法 培养兔膝关节软骨细胞，加入 bFGF、HA，用四氮甲基唑蓝(MTT)方法测定其对软骨细胞增殖的影响。 结果 bFGF在 10 ng/ml 即可显著促进软骨细胞增殖，当 bFGF浓度增至50 ng/ml ，其促进作用达到最大值；单纯使用HA并不促进软骨细胞增殖；当联合应用 bFGF 与HA时，bFGF浓度为50～500 ng/ml、HA浓度为10～50 ng/ml出现协同作用。 结论 bFGF明显促进软骨细胞增殖，HA可以维持软骨细胞的正常生长而不影响细胞的增殖，与 bFGF联合应用时，更利于细胞生长。
关键词：成纤维细胞生长因子，碱性；透明质酸；软骨；细胞；增殖
, http://www.100md.com
在软骨的损伤修复中， 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达明显增强，提示 bFGF在软骨损伤修复中起着重要的调节作用[1]。透明质酸(HA)是软骨基质的重要成分之一，临床上常用做关节腔内注射剂，以缓解骨关节病的症状。因此，可以设想采用HA作为 bFGF的载体，在关节腔内局部使用，以促进关节软骨损伤的修复。笔者通过分离培养兔关节软骨细胞，观察 bFGF及HA对软骨细胞生长的影响，探讨HA作为 bFGF载体的可行性，为临床应用提供依据。
材料与方法
1. 主要试剂：Ham F-12培养液(Gibco公司，美国)，胎牛血清(杭州四季青公司)，HA(Sigma公司，美国)，海尔根(HY，为透明质酸的一种商品名，菲地亚药厂，意大利)，bFGF(暨南大学生物工程研究所)，四氮甲基唑蓝(MTT， Sigma公司，美国)。
2. 兔软骨细胞的分离和培养：方法参照文献[2]。无菌取4～5周龄的新西兰大白兔膝关节软骨。以解剖刀切成1 mm3左右的小碎片，分别用透明质酸酶、胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶消化关节软骨碎片，获得软骨细胞悬液。接种软骨细胞，加入含体积分数为10%的胎牛血清的Ham F-12培养液，置于37℃体积分数为5%的CO2培养箱培养，待细胞贴壁后隔天换液。当软骨细胞铺满平瓶底后用质量浓度为0.2 g/L的EDTA冲洗,2.5 g/L的胰蛋白酶消化，离心收集软骨细胞，用以传代。
, 百拇医药
3. MTT比色法分析软骨细胞增殖：用含体积分数为0.5%的胎牛血清的Ham F-12培养液将软骨细胞稀释成4×104/ml，以每孔100 μl细胞悬液接种于96孔板上，分别加入100 μl不同浓度的bFGF、HA或bFGF与HA的混合物，每组4个复孔。二氧化碳培养箱孵育72 h后，去上清液。每孔加入MTT试剂20 μl (5 g/L) 及无血清培养液100 μl，再孵育4 h。去上清，每孔加入 200 μl溶甲瓒液，以主波长570 nm，参比波长690 nm于酶标仪(Reder，日本)上比色，读取吸光度(A)值。
4. 统计学方法采用t检验。
结 果
1. bFGF对软骨细胞增殖的影响：1 ng/ml bFGF对软骨细胞增殖作用不明显(P>0.05)；10 ng/ml bFGF即可显著促进软骨细胞增殖(P<0.01 )；当bFGF浓度增至50 ng/ml 时，其对软骨细胞增殖的促进作用达到最大值 ( 图1) 。
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图1 bFGF对软骨细胞增殖的影响
2. HA和HY对软骨细胞增殖的影响：HA和HY对软骨细胞增殖无明显作用(图2)。
图2 透明质酸及海尔根对软骨细胞增殖的影响
3. bFGF联合应用透明质酸对软骨细胞增殖的影响：bFGF能促进软骨细胞的生长，而透明质酸对软骨细胞增殖无影响。 bFGF(10 ng/ml)联合应用HA (100 μg/ml)对软骨细胞增殖的作用大于单用 bFGF (10 ng/ml) (图3)。bFGF处于不同水平时 (50～500 ng/ml)，HA(10～50 μg/ml)的作用不同，两药联合应用效果更好，有协同作用。
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图3 bFGF联合应用透明质酸对软骨细胞增殖的影响
讨 论
一般认为，关节软骨缺损没有修复能力或修复过程极为缓慢。滑膜细胞分泌HA，保持关节的滑润。任何一方面的缺损，均可引起关节功能障碍[3]。目前，研究人员采用了骨膜、软骨膜或细胞移植等技术用以修复关节缺损，取得了一定的进展。但局部应用生长因子以修复软骨缺损的报道甚少，但其作用无疑是存在的，而且日益引起人们的关注[4]。本研究表明，bFGF对软骨细胞的增殖具有明显的促进作用，提示bFGF在软骨损伤修复中具有重要的调节作用，局部使用bFGF有可能加速或促进软骨损伤的修复。显然，bFGF在体内作用的量效关系还有待进一步研究。
HA是氨基葡聚糖类的天然多聚物，是细胞外基质的一种重要成分，在软骨和滑液中的含量很高。在软骨表面发生退行性病变和滑液发生病理性改变的关节腔内注射HA，可使滑液质量正常化，并激活关节软骨的组织修复过程，改善关节功能。本研究表明，HA可以维持软骨细胞的正常生长，但对软骨细胞的增殖行为并无影响，说明HA在软骨损伤修复中可为软骨细胞提供赖以生长的微环境，但并不直接刺激软骨细胞增殖。
, 百拇医药
bFGF为多肽生长因子，在体内容易降解。尤其是在炎性关节中，存在多种蛋白水解酶，直接注射 bFGF，作用效果必然不好。笔者将bFGF与HA联合应用于软骨细胞，其对细胞增殖的促进作用明显优于单纯使用bFGF。因此，在局部使用 bFGF时，以HA作为载体，使 bFGF缓慢释放，从而避免 bFGF过快水解。HA发挥其对关节保护作用的同时，还可提高 bFGF的作用效果。
研究表明，肝素可以增强 bFGF促进细胞增殖[5]，HA的结构与肝素相似，可能是HA协同 bFGF促进软骨细胞增殖的作用机制之一。当然两者协同作用的机制远非如此简单，尚需进一步研究。
Haart等[6]认为，bFGF对牛软骨细胞增殖行为并无影响。本研究中， 1 ng/ml bFGF对兔软骨细胞的增殖也无明显作用，但当bFGF浓度加大到10 ～ 500 ng/ml时,其对兔软骨细胞的增殖均有显著促进作用。因此，软骨细胞的来源以及bFGF的剂量，可能导致不同的实验结果。本实验证实，bFGF对兔软骨细胞增殖的促进作用是存在的。
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沈雁(510220 广州市红十字会医院创伤外科研究所)
唐毅(510220 广州市红十字会医院创伤外科研究所)
李斯明(510220 广州市红十字会医院创伤外科研究所)
钟灿灿(510220 广州市红十字会医院创伤外科研究所)
梁佩红(510220 广州市红十字会医院创伤外科研究所)
参考文献
1，Twal WO, Vasilatos YR, Gay CV, et al. Isolation and localization of basic fibroblast growth factor - immunoreactive substance in the epiphyseal growth plate. J Bone Miner Res, 1994, 9: 1737-1744.
, http://www.100md.com
2，Freshney RI. Culture of animal cells: a manual of basic technique. 3rd ed. New York: Wiley-liss Inc, 1994. 331-332.
3，王亦璁,孟继懋，郭子恒，等，主编.骨与关节损伤.第2版.北京：人民卫生出版社， 1990. 203-204.
4，刘晋才.细胞因子与骨和软骨的修复. 中华骨科杂志，1998，18：243-245.
5，Rogers ML, Belford DA, Francis GL, et al. Identification of fibroblast growth factors in bovine cheese whey. J Dairy Res， 1995, 62: 501-507.
6，Haart M, Marijnissen WJCM, Osch GJVM, et al. Optimization of chondrocyte expansion in culture - effect of TGF β-2, bFGF and L-ascorbic acid on bovine articular chondrocytes. Acta Orthop Scand, 1999, 70: 55-61., 百拇医药
沈雁 唐毅 李斯明 钟灿灿 梁佩红
摘 要 目的 探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)与透明质酸(HA)对兔软骨细胞的增殖影响及其协同作用。 方法 培养兔膝关节软骨细胞，加入 bFGF、HA，用四氮甲基唑蓝(MTT)方法测定其对软骨细胞增殖的影响。 结果 bFGF在 10 ng/ml 即可显著促进软骨细胞增殖，当 bFGF浓度增至50 ng/ml ，其促进作用达到最大值；单纯使用HA并不促进软骨细胞增殖；当联合应用 bFGF 与HA时，bFGF浓度为50～500 ng/ml、HA浓度为10～50 ng/ml出现协同作用。 结论 bFGF明显促进软骨细胞增殖，HA可以维持软骨细胞的正常生长而不影响细胞的增殖，与 bFGF联合应用时，更利于细胞生长。
关键词：成纤维细胞生长因子，碱性；透明质酸；软骨；细胞；增殖
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在软骨的损伤修复中， 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达明显增强，提示 bFGF在软骨损伤修复中起着重要的调节作用[1]。透明质酸(HA)是软骨基质的重要成分之一，临床上常用做关节腔内注射剂，以缓解骨关节病的症状。因此，可以设想采用HA作为 bFGF的载体，在关节腔内局部使用，以促进关节软骨损伤的修复。笔者通过分离培养兔关节软骨细胞，观察 bFGF及HA对软骨细胞生长的影响，探讨HA作为 bFGF载体的可行性，为临床应用提供依据。
材料与方法
1. 主要试剂：Ham F-12培养液(Gibco公司，美国)，胎牛血清(杭州四季青公司)，HA(Sigma公司，美国)，海尔根(HY，为透明质酸的一种商品名，菲地亚药厂，意大利)，bFGF(暨南大学生物工程研究所)，四氮甲基唑蓝(MTT， Sigma公司，美国)。
2. 兔软骨细胞的分离和培养：方法参照文献[2]。无菌取4～5周龄的新西兰大白兔膝关节软骨。以解剖刀切成1 mm3左右的小碎片，分别用透明质酸酶、胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶消化关节软骨碎片，获得软骨细胞悬液。接种软骨细胞，加入含体积分数为10%的胎牛血清的Ham F-12培养液，置于37℃体积分数为5%的CO2培养箱培养，待细胞贴壁后隔天换液。当软骨细胞铺满平瓶底后用质量浓度为0.2 g/L的EDTA冲洗,2.5 g/L的胰蛋白酶消化，离心收集软骨细胞，用以传代。
, 百拇医药
3. MTT比色法分析软骨细胞增殖：用含体积分数为0.5%的胎牛血清的Ham F-12培养液将软骨细胞稀释成4×104/ml，以每孔100 μl细胞悬液接种于96孔板上，分别加入100 μl不同浓度的bFGF、HA或bFGF与HA的混合物，每组4个复孔。二氧化碳培养箱孵育72 h后，去上清液。每孔加入MTT试剂20 μl (5 g/L) 及无血清培养液100 μl，再孵育4 h。去上清，每孔加入 200 μl溶甲瓒液，以主波长570 nm，参比波长690 nm于酶标仪(Reder，日本)上比色，读取吸光度(A)值。
4. 统计学方法采用t检验。
结 果
1. bFGF对软骨细胞增殖的影响：1 ng/ml bFGF对软骨细胞增殖作用不明显(P>0.05)；10 ng/ml bFGF即可显著促进软骨细胞增殖(P<0.01 )；当bFGF浓度增至50 ng/ml 时，其对软骨细胞增殖的促进作用达到最大值 ( 图1) 。
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图1 bFGF对软骨细胞增殖的影响
2. HA和HY对软骨细胞增殖的影响：HA和HY对软骨细胞增殖无明显作用(图2)。
图2 透明质酸及海尔根对软骨细胞增殖的影响
3. bFGF联合应用透明质酸对软骨细胞增殖的影响：bFGF能促进软骨细胞的生长，而透明质酸对软骨细胞增殖无影响。 bFGF(10 ng/ml)联合应用HA (100 μg/ml)对软骨细胞增殖的作用大于单用 bFGF (10 ng/ml) (图3)。bFGF处于不同水平时 (50～500 ng/ml)，HA(10～50 μg/ml)的作用不同，两药联合应用效果更好，有协同作用。
, 百拇医药
图3 bFGF联合应用透明质酸对软骨细胞增殖的影响
讨 论
一般认为，关节软骨缺损没有修复能力或修复过程极为缓慢。滑膜细胞分泌HA，保持关节的滑润。任何一方面的缺损，均可引起关节功能障碍[3]。目前，研究人员采用了骨膜、软骨膜或细胞移植等技术用以修复关节缺损，取得了一定的进展。但局部应用生长因子以修复软骨缺损的报道甚少，但其作用无疑是存在的，而且日益引起人们的关注[4]。本研究表明，bFGF对软骨细胞的增殖具有明显的促进作用，提示bFGF在软骨损伤修复中具有重要的调节作用，局部使用bFGF有可能加速或促进软骨损伤的修复。显然，bFGF在体内作用的量效关系还有待进一步研究。
HA是氨基葡聚糖类的天然多聚物，是细胞外基质的一种重要成分，在软骨和滑液中的含量很高。在软骨表面发生退行性病变和滑液发生病理性改变的关节腔内注射HA，可使滑液质量正常化，并激活关节软骨的组织修复过程，改善关节功能。本研究表明，HA可以维持软骨细胞的正常生长，但对软骨细胞的增殖行为并无影响，说明HA在软骨损伤修复中可为软骨细胞提供赖以生长的微环境，但并不直接刺激软骨细胞增殖。
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bFGF为多肽生长因子，在体内容易降解。尤其是在炎性关节中，存在多种蛋白水解酶，直接注射 bFGF，作用效果必然不好。笔者将bFGF与HA联合应用于软骨细胞，其对细胞增殖的促进作用明显优于单纯使用bFGF。因此，在局部使用 bFGF时，以HA作为载体，使 bFGF缓慢释放，从而避免 bFGF过快水解。HA发挥其对关节保护作用的同时，还可提高 bFGF的作用效果。
研究表明，肝素可以增强 bFGF促进细胞增殖[5]，HA的结构与肝素相似，可能是HA协同 bFGF促进软骨细胞增殖的作用机制之一。当然两者协同作用的机制远非如此简单，尚需进一步研究。
Haart等[6]认为，bFGF对牛软骨细胞增殖行为并无影响。本研究中， 1 ng/ml bFGF对兔软骨细胞的增殖也无明显作用，但当bFGF浓度加大到10 ～ 500 ng/ml时,其对兔软骨细胞的增殖均有显著促进作用。因此，软骨细胞的来源以及bFGF的剂量，可能导致不同的实验结果。本实验证实，bFGF对兔软骨细胞增殖的促进作用是存在的。
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沈雁(510220 广州市红十字会医院创伤外科研究所)
唐毅(510220 广州市红十字会医院创伤外科研究所)
李斯明(510220 广州市红十字会医院创伤外科研究所)
钟灿灿(510220 广州市红十字会医院创伤外科研究所)
梁佩红(510220 广州市红十字会医院创伤外科研究所)
参考文献
1，Twal WO, Vasilatos YR, Gay CV, et al. Isolation and localization of basic fibroblast growth factor - immunoreactive substance in the epiphyseal growth plate. J Bone Miner Res, 1994, 9: 1737-1744.
, http://www.100md.com
2，Freshney RI. Culture of animal cells: a manual of basic technique. 3rd ed. New York: Wiley-liss Inc, 1994. 331-332.
3，王亦璁,孟继懋，郭子恒，等，主编.骨与关节损伤.第2版.北京：人民卫生出版社， 1990. 203-204.
4，刘晋才.细胞因子与骨和软骨的修复. 中华骨科杂志，1998，18：243-245.
5，Rogers ML, Belford DA, Francis GL, et al. Identification of fibroblast growth factors in bovine cheese whey. J Dairy Res， 1995, 62: 501-507.
6，Haart M, Marijnissen WJCM, Osch GJVM, et al. Optimization of chondrocyte expansion in culture - effect of TGF β-2, bFGF and L-ascorbic acid on bovine articular chondrocytes. Acta Orthop Scand, 1999, 70: 55-61., 百拇医药