粉防己碱对大鼠肝脏缺血和再灌注损伤的防护作用
粉防己碱对大鼠肝脏缺血和再灌注损伤的防护作用
曾荻洵 赵明 刘卫东 吕新生
摘 要 目的 观察粉防己碱(Tet)对大鼠肝再灌注损伤的防护作用及其机制。 方法 (1)Fura-2/AM检测Tet对离体肝细胞游离钙离子浓度([Ca2+]i)的影响。(2)制作大鼠缺血再灌注损伤模型。将实验大鼠随机分为对照组(Ctrl，鼠数=35)、粉防己碱(Tet)组(鼠数=35)和假手术组(Sham,鼠数=5)。Tet组大鼠按8 mg/kg Tet于缺血前、再灌注前静脉注射，动态观察血清谷丙转氨酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)、肝组织三磷酸腺苷(ATP)及能荷(EC)、血浆内皮素(ET)、肝细胞[Ca2+]i和肝组织学变化，并计算生存率。 结果 Tet能抑制ATP诱导细胞[Ca2+i]的增加，呈剂量依赖性(P<0.01)。再灌注后Tet组与Ctrl组相比，ALT、LDH、ET降低(P<0.05)，ATP、EC增高(P<0.01)；再灌注末[Ca2+]i Tet组低于Ctrl组(P<0.01)，Tet组肝组织破坏轻于Ctrl组，生存率高于Ctrl组(P<0.01)。 结论 Tet对大鼠肝缺血和再灌注损伤有明显的防护作用，其机制可能为选择性阻断肝细胞膜上受体操纵性钙通道，抑制细胞内Ca2+超载。
, 百拇医药
关键词：粉防己碱；肝；再灌注损伤；钙通道
肝脏再灌注损伤的机制仍未完全阐明，细胞内Ca2+超载越来越受到关注[1]。钙通道阻滞剂维拉帕米等对肝脏细胞损伤的防护已有报道[2]。笔者观察粉防己碱(Tetrandrine，Tet)对大鼠常温下肝脏缺血/再灌注损伤的防护作用，并探讨其机制。
材料与方法
1. 实验大鼠：雄性SD大鼠75只，体重220～280 g，由湖南医科大学附属湘雅医院大鼠中心提供。
2. 肝细胞胞浆游离钙离子浓度([Ca2+]i)的检测：采用卢绪萍等[3]的方法：(1)制备细胞悬液：取大鼠肝组织约3 g，预冷的无钙缓冲液洗4次，剪碎，加入质量浓度为1.25 g/L的胰蛋白酶，37℃ 搅拌20 min，200目尼龙网过滤，离心5 min (1 500 r/min)，重复3次，收集肝细胞于无钙缓冲液中并计数，调整细胞浓度约为1.6×106/ml，台盼蓝染色，检查细胞存活率>90%。(2)Fura-2/AM负载及[Ca2+]i荧光测定：在细胞悬液中加入Fura-2/AM(终浓度5 μmol/L，Sigma公司，美国)，置于30℃水浴箱中避光孵育30 min，Fura-2/AM负载后的肝细胞悬液离心3 min(1 000 r/min)，重复2次，以无钙缓冲液混悬细胞在日立R-4000荧光分光光度计上记录不同条件下的细胞荧光值，根据下列公式求肝细胞[Ca2+]i。
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式中Kd为Fura-2与Ca2+反应的解离常数值(224 nmol/L)，F、Fmax、Fmin系在340 nm激发波长测得的荧光值、最大和最小荧光值。
3. Tet对离体肝细胞[Ca2+]i变化的影响：(1)肝细胞悬液中分别加入不同浓度的Tet(40， 80， 160 μmol/L，浙江金华制药厂)，观察它们对三磷酸腺苷(ATP，200 μmol/L)诱导的细胞外钙内流的影响。(2)以乙二氨四乙酸(EDTA，5×10-5 mol/L)络合细胞外残存的Ca2+，观察Tet(80 μmol/L)对ATP(200 μmol/L)诱导的细胞内贮存钙释放的影响。
4. Tet对肝脏缺血/再灌注损伤的作用：(1)实验模型及分组：大鼠术前禁食18 h，不限制饮水，以质量浓度为30 g/L的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(30 mg/kg)，游离一侧股静脉，22号套管针穿刺置管以备给药、补液。上腹正中切口入腹，显露肝十二指肠韧带，缺血/再灌注模型采用全肝门阻断。大鼠随机分3组：①对照组(Ctrl, 鼠数=35)：阻断肝门40 min，再灌注50 min，术中按12 ml.kg-1.h-1输入林格液。②粉防己碱组(Tet, 鼠数=35)：开腹前30 min经股静脉按8 mg/kg注射Tet总量的2/3，再灌注前10 min注射完剩余的量，其余同Ctrl组。③假手术组(Sham,鼠数=5)：进腹后不行肝门阻断，以等渗盐水替代药物处理。(2)标本采集：肝组织取自右肝前叶，血标本取自肝上下腔静脉。Ctrl、Tet组于缺血前、缺血末、再灌注10，50 min时分别处死大鼠6，5，7，7只取样；Sham组于开腹后90 min取样。(3)观察指标及测定：①血清谷丙转氨酶(ALT)及乳酸脱氢酶(LDH)：标本室温下静置1 h，凝固后离心5 min(3 000 r/min)，取上清液测定。②肝组织ATP、能荷(EC)：液氮保存的肝组织，按1 g组织加质量浓度为50 g/L的HClO4 5 ml比例稀释，低温匀浆，离心10 min(15 000 r/min)，取上清液，加入1.65 mmol/L的K2CO3调pH值为6～7，再次离心10 min，取上清液测定[4]，计算AP及EC[AP=ATP+ADP+AMP，EC=(ATP+0.5 ADP)/AP]。③血浆内皮素(ET)：取1.5 ml静脉血置于含30 μl Aprotinin(4万U/ml)及30 μl EDTA(0.3 mol/L)的试管中，离心10 min(3 000 r/min)，取上层血浆，-20℃保存，按药盒说明测定。④肝细胞胞浆[Ca2+]i：再灌注50 min按前述方法测定离体肝细胞[Ca2+]i。⑤肝组织学检查：光镜：再灌注50 min取肝组织用体积分数为4%的甲醛固定24 h，包埋后HE染色，观察组织改变。电镜：再灌注50 min取肝组织约1 mm×1 mm×1 mm，放入质量浓度为25 g/L的戊二醛中固定3 h，PBS洗3遍，用质量浓度为10 g/L的锇酸固定2 h，PBS重洗3遍，梯度丙酮脱水，Epon-812浸泡包埋聚合，修块后超薄切片，铅铀双染色，观察超微结构。⑥生存率：Ctrl组(鼠数=10)、Tet组(鼠数=10)经过40 min肝门阻断及50 min再灌注后关腹，观察术后5 d生存率。
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5. 统计分析：数据以±s表示，采用SPSS统计软件行方差分析、q检验，生存率用Fisher exact检验。
结 果
1. Tet对大鼠ATP诱导细胞外钙内流的影响：不同浓度的Tet能有效抑制ATP诱导的细胞内[Ca2+]i的增加(P<0.01)，且呈剂量依赖性(表1)。
表1 Tet对大鼠ATP诱导的细胞外钙内流
所致[Ca2+]i变化的影响(nmol/L，±s)
组别
标本数
[Ca2+]i
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静息[Ca2+]i
7
159.11±9.16
CaCl2(5mmol/L)+ATP
7
1497.49±101.07△
Tet(40μmol/L)+CaCl2+ATP
7
775.75±65.73△**#
Tet(80μmol/L)+CaCl2+ATP
, 百拇医药
7
444.88±46.16△**▲
Tet(160μmol/L)+CaCl2+ATP
7
233.48±20.24△**
与静息[Ca2+]i比较：△P<0.05； 与未加Tet比较：**P<0.01； Tet(40 μmol/L)与Tet(80 μmol/L)比较：#P<0.05； Tet(80 μmol/L)与Tet(160 μmol/L)比较：▲P<0.05
2. Tet对大鼠ATP诱导细胞内钙释放的影响：肝细胞悬液加入Tet后，[Ca2+]i浓度为(127.56±12.72) nmol/L，与正常大鼠肝细胞静息[Ca2+]i[(134.92±20.94) nmol/L)]几乎相等，说明Tet不影响肝细胞静息[Ca2+]i；无细胞外Ca2+时，ATP诱导细胞内钙释放，[Ca2+]i为(154.93±15.19) nmol/L，与无Tet 时肝细胞[Ca2+]i [(177.37±18.70) nmol/L]差别不明显(P>0.05)，说明Tet对ATP诱导细胞内钙释放无明显抑制作用。
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3. 缺血/再灌注损伤大鼠血清ALT、LDH的变化：见表2。
4. 缺血/再灌注损伤大鼠肝组织ATP及EC的变化：见表3。
5. 缺血/再灌注损伤大鼠血浆ET及再灌注50 min肝细胞[Ca2+]i的变化：见表4。
6. 组织学检查：光镜显示，Ctrl组肝细胞明显肿胀，间质炎性细胞浸润，少量肝细胞坏死；Tet组肝窦索结构清晰，细胞肿胀轻微，无细胞坏死。 电镜显示，Ctrl组肝细胞内质网、线粒体扩张，线粒体嵴紊乱、空泡化，内质网囊泡化，微胆管扩张，微绒毛脱落；Tet组细胞膜结构基本正常，线粒体、内质网轻微肿胀，微胆管结构正常，微绒毛清晰。
7. 生存率：大鼠缺血/再灌注损伤后5 d生存率，Ctrl组(10%)明显低于Tet组(70%)(P<0.05)。
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表2 缺血/再灌注损伤大鼠血清ALT、LDH的变化(U/L，±s)
组别
ALT
LDH
缺血前
缺血末
再灌注10 min
再灌注50 min
缺血前
缺血末
再灌注10 min
再灌注50 min
, 百拇医药
对照组
34.77±
240.04±
1636.64±
1024.40±
1079.95±
1767.82±
5553.61±
3818.80±
4.12(6)
31.93(5)
176.65(7)
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119.92(7)△
105.55(6)
170.19(5)
439.69(7)
417.99(7)△
Tet组
34.77±
221.12±
802.91±
649.67±
1079.95±
, 百拇医药 1231.22±
2699.10±
2017.04±
4.12(6)
22.14(5)
62.63(7)*
39.87(7)*△
105.55(6)
126.43(5)*
188.91(7)*
222.38(7)*△
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假手术组
-
-
-
42.83±
-
-
-
1275.83±
4.36(5)*
182.19(5)*
注：表中括号内数字为鼠数。与同时相对照组比较：*P<0.05； 与同时相假手术组比较：△P<0.05表3 缺血/再灌注损伤大鼠肝组织ATP及EC的变化(±s)
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组别
ATP(μmol/g)
EC
缺血前
缺血末
再灌注10 min
再灌注50 min
缺血前
缺血末
再灌注10 min
再灌注50 min
对照组
2.52±
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0.22±
0.52±
0.85±
0.83±
0.24±
0.53±
0.70±
0.40(6)
0.08(5)
0.06(7)
0.09(7)△△
0.02(6)
, 百拇医药
0.06(5)
0.04(7)
0.04(7)△△
Tet组
2.52±
0.23±
0.77±
1.43±
0.83±
0.24±
0.59±
0.78±
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0.40(6)
0.06(5)
0.08(7)**
0.17(7)**△△
0.02(6)
0.04(5)
0.04(7)
0.03(7)**△
假手术组
-
-
, 百拇医药 -
2.45±
-
-
-
0.83±
0.08(5)**
0.02(5)**
注：表中括号内数字为鼠数。与同时相对照组比较：**P<0.01； 与同时相假手术组比较：△P<0.05 △△P<0.01表4 缺血/再灌注损伤大鼠血浆ET及再灌注50 min肝细胞[Ca2+]i的变化(±s)
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组别
ET(pg/ml)
缺血前
缺血末
再灌注10 min
再灌注50 min
[Ca2+]i (nmol/L)
对照组
43.70±5.74(6)
63.97±8.39(5)
103.94±11.01(7)
, 百拇医药 170.39±21.22(7)△△
492.91±63.23(7)△△
Tet组
43.70±5.74(6)
56.43±8.56(5)
88.15±10.25(7)*
121.25±16.34(7)**△△
316.89±33.84(7)**△△
假手术组
-
, 百拇医药
-
-
54.66±8.89(5)**
130.01±14.93(5)**
注：表中括号内数字为鼠数。与同时相对照组比较：*P<0.05 **P<0.01； 与同时相假手术组比较：△△P<0.01
讨 论
肝脏缺血再灌注损伤不仅在缺血的当时，而且可能在再灌注恢复后一段时间内阻碍肝脏功能的恢复，但原因仍不十分清楚，细胞内Ca2+超载可能是其重要机制。如能有效抑制细胞内Ca2+超载，将有可能改善这种损伤的发生。维拉帕米能减轻肝再灌注损伤，但其属于电压依赖性钙通道(PDC)阻滞剂，而肝细胞Ca2+内流以受体操纵性钙通道(ROC)为主。所以，如能找到选择性阻断细胞ROC的药物，阻断Ca2+内流就更完全，防护作用可能更理想。曾有报道称，Tet可能是一种非选择性钙通道阻滞剂[5]。
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外源性ATP增加细胞[Ca2+]i主要是由于细胞外Ca2+内流或内贮存钙释放[6]，本研究中也得到证实。肝细胞Ca2+内流的ROC不受离子交换的影响，不涉及膜去极化，难以观察K+等诱导剂所激发的细胞内高Ca2+现象，这与心肌细胞不同[7]。笔者曾用K+(30 mmol/L)替代ATP诱导Ca2+内流，细胞荧光值无明显变化，也说明肝细胞Ca2+内流与PDC关系不明显。本研究提示Tet对肝细胞静息[Ca2+]i无影响，而对ATP诱导的Ca2+内流有明显抑制作用，且呈浓度依赖性，但对细胞内钙释放抑制不明显。另外，Tet用于肝脏缺血/再灌注损伤大鼠，大鼠血浆ALT和LDH在缺血前与缺血末变化不大，而真正升高是在再灌注阶段，此阶段Tet组酶水平明显低于Ctrl组。从能量代谢角度看，缺血末ATP急剧消耗，再灌注恢复后ATP浓度回升，说明缺血引起的能量降解是可逆的，EC变化与ATP相似。结果显示，Tet能明显加速肝细胞能量代谢的恢复。ET是由内皮细胞产生的血管活性肽，缺氧能引起ET基因表达，ET作为一种典型的钙动员激素能明显刺激[Ca2+]i的增加[8]。ET在再灌注期升高更明显，原因可能是缺血时肝血窦内皮细胞、肝小叶中央静脉内皮细胞等产生ET和门脉血管床因瘀血、内皮受损而使ET积累。再灌注阶段高ET的门脉血进入肝脏，加重肝微循环损害，而Tet处理能减轻再灌注引起的高ET血症和细胞内Ca2+增高。
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经典钙通道阻滞剂对肝再灌注损伤的防护因药物对PDC阻滞强于对ROC，效果不如对心脏明显。本研究结果表明，Tet能抑制ATP诱导的肝细胞Ca2+内流， 它可能以肝细胞ROC阻滞剂的身份抑制细胞内Ca2+超载，从而在再灌注损伤时发挥对肝脏的防护作用。
曾荻洵(410073 长沙，国防科学技术大学附属医院普外科)
赵明(410073 长沙，国防科学技术大学附属医院普外科)
刘卫东(410073 长沙，国防科学技术大学附属医院普外科)
吕新生(湖南医科大学附属湘雅医院普外科)
参考文献
1，Yushinari T, Masaaki U, Naofumi N， et al. Changes in calcium content of liver during hepatic ischemia-reperfusion in dogs. J Hepatol， 1994，21:743-747.
, http://www.100md.com
2，Cobreros A. Hepatotoxicity of ethanol: protective effect of calcium channel blocker in isolated hepatocytes. Liver， 1997，17:76-82.
3，卢绪萍，史陈让. 用Fura-2和显微荧光技术定量检测活性肝细胞内游离钙离子. 中国病理生理杂志， 1996， 12:446-448.
4，向群辉，胡随瑜，朱崇学，等. 五兔颗粒剂对大鼠脑组织腺苷酸含量的影响. 湖南医科大学学报， 1996， 21:31-33.
5，Chiu Yin KWAN, Deng HW, Guan YY. Tetrandrine is not a selective calcium channel blocker in vascular smooth muscle. Acta Pharmacologica Sinica， 1992， 13:385-390.
, 百拇医药
6，Ikari A. ATP, thapsigargin and cAMP increase Ca2+ in rat hepatocytes by activating 3 different Ca2+ influx pathways. Jpn J Physiol， 1997，47:235-239.
7，Gopalakrishnan M, Tsimoyiannis E. ATP-sensitive K+ channels: pharmacologic properties, regulation and therapeutical potential. Drug Dev Res， 1993，28:95-127.
8，Housset C, Stein J, Thurman R， et al. Endothelin receptor in the liver: Lipocytes as a contractile target for endothelin-1. Proc Natl Acad Sci USA， 1993， 90:9266-9272., http://www.100md.com
曾荻洵 赵明 刘卫东 吕新生
摘 要 目的 观察粉防己碱(Tet)对大鼠肝再灌注损伤的防护作用及其机制。 方法 (1)Fura-2/AM检测Tet对离体肝细胞游离钙离子浓度([Ca2+]i)的影响。(2)制作大鼠缺血再灌注损伤模型。将实验大鼠随机分为对照组(Ctrl，鼠数=35)、粉防己碱(Tet)组(鼠数=35)和假手术组(Sham,鼠数=5)。Tet组大鼠按8 mg/kg Tet于缺血前、再灌注前静脉注射，动态观察血清谷丙转氨酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)、肝组织三磷酸腺苷(ATP)及能荷(EC)、血浆内皮素(ET)、肝细胞[Ca2+]i和肝组织学变化，并计算生存率。 结果 Tet能抑制ATP诱导细胞[Ca2+i]的增加，呈剂量依赖性(P<0.01)。再灌注后Tet组与Ctrl组相比，ALT、LDH、ET降低(P<0.05)，ATP、EC增高(P<0.01)；再灌注末[Ca2+]i Tet组低于Ctrl组(P<0.01)，Tet组肝组织破坏轻于Ctrl组，生存率高于Ctrl组(P<0.01)。 结论 Tet对大鼠肝缺血和再灌注损伤有明显的防护作用，其机制可能为选择性阻断肝细胞膜上受体操纵性钙通道，抑制细胞内Ca2+超载。
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关键词：粉防己碱；肝；再灌注损伤；钙通道
肝脏再灌注损伤的机制仍未完全阐明，细胞内Ca2+超载越来越受到关注[1]。钙通道阻滞剂维拉帕米等对肝脏细胞损伤的防护已有报道[2]。笔者观察粉防己碱(Tetrandrine，Tet)对大鼠常温下肝脏缺血/再灌注损伤的防护作用，并探讨其机制。
材料与方法
1. 实验大鼠：雄性SD大鼠75只，体重220～280 g，由湖南医科大学附属湘雅医院大鼠中心提供。
2. 肝细胞胞浆游离钙离子浓度([Ca2+]i)的检测：采用卢绪萍等[3]的方法：(1)制备细胞悬液：取大鼠肝组织约3 g，预冷的无钙缓冲液洗4次，剪碎，加入质量浓度为1.25 g/L的胰蛋白酶，37℃ 搅拌20 min，200目尼龙网过滤，离心5 min (1 500 r/min)，重复3次，收集肝细胞于无钙缓冲液中并计数，调整细胞浓度约为1.6×106/ml，台盼蓝染色，检查细胞存活率>90%。(2)Fura-2/AM负载及[Ca2+]i荧光测定：在细胞悬液中加入Fura-2/AM(终浓度5 μmol/L，Sigma公司，美国)，置于30℃水浴箱中避光孵育30 min，Fura-2/AM负载后的肝细胞悬液离心3 min(1 000 r/min)，重复2次，以无钙缓冲液混悬细胞在日立R-4000荧光分光光度计上记录不同条件下的细胞荧光值，根据下列公式求肝细胞[Ca2+]i。
, 百拇医药
式中Kd为Fura-2与Ca2+反应的解离常数值(224 nmol/L)，F、Fmax、Fmin系在340 nm激发波长测得的荧光值、最大和最小荧光值。
3. Tet对离体肝细胞[Ca2+]i变化的影响：(1)肝细胞悬液中分别加入不同浓度的Tet(40， 80， 160 μmol/L，浙江金华制药厂)，观察它们对三磷酸腺苷(ATP，200 μmol/L)诱导的细胞外钙内流的影响。(2)以乙二氨四乙酸(EDTA，5×10-5 mol/L)络合细胞外残存的Ca2+，观察Tet(80 μmol/L)对ATP(200 μmol/L)诱导的细胞内贮存钙释放的影响。
4. Tet对肝脏缺血/再灌注损伤的作用：(1)实验模型及分组：大鼠术前禁食18 h，不限制饮水，以质量浓度为30 g/L的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(30 mg/kg)，游离一侧股静脉，22号套管针穿刺置管以备给药、补液。上腹正中切口入腹，显露肝十二指肠韧带，缺血/再灌注模型采用全肝门阻断。大鼠随机分3组：①对照组(Ctrl, 鼠数=35)：阻断肝门40 min，再灌注50 min，术中按12 ml.kg-1.h-1输入林格液。②粉防己碱组(Tet, 鼠数=35)：开腹前30 min经股静脉按8 mg/kg注射Tet总量的2/3，再灌注前10 min注射完剩余的量，其余同Ctrl组。③假手术组(Sham,鼠数=5)：进腹后不行肝门阻断，以等渗盐水替代药物处理。(2)标本采集：肝组织取自右肝前叶，血标本取自肝上下腔静脉。Ctrl、Tet组于缺血前、缺血末、再灌注10，50 min时分别处死大鼠6，5，7，7只取样；Sham组于开腹后90 min取样。(3)观察指标及测定：①血清谷丙转氨酶(ALT)及乳酸脱氢酶(LDH)：标本室温下静置1 h，凝固后离心5 min(3 000 r/min)，取上清液测定。②肝组织ATP、能荷(EC)：液氮保存的肝组织，按1 g组织加质量浓度为50 g/L的HClO4 5 ml比例稀释，低温匀浆，离心10 min(15 000 r/min)，取上清液，加入1.65 mmol/L的K2CO3调pH值为6～7，再次离心10 min，取上清液测定[4]，计算AP及EC[AP=ATP+ADP+AMP，EC=(ATP+0.5 ADP)/AP]。③血浆内皮素(ET)：取1.5 ml静脉血置于含30 μl Aprotinin(4万U/ml)及30 μl EDTA(0.3 mol/L)的试管中，离心10 min(3 000 r/min)，取上层血浆，-20℃保存，按药盒说明测定。④肝细胞胞浆[Ca2+]i：再灌注50 min按前述方法测定离体肝细胞[Ca2+]i。⑤肝组织学检查：光镜：再灌注50 min取肝组织用体积分数为4%的甲醛固定24 h，包埋后HE染色，观察组织改变。电镜：再灌注50 min取肝组织约1 mm×1 mm×1 mm，放入质量浓度为25 g/L的戊二醛中固定3 h，PBS洗3遍，用质量浓度为10 g/L的锇酸固定2 h，PBS重洗3遍，梯度丙酮脱水，Epon-812浸泡包埋聚合，修块后超薄切片，铅铀双染色，观察超微结构。⑥生存率：Ctrl组(鼠数=10)、Tet组(鼠数=10)经过40 min肝门阻断及50 min再灌注后关腹，观察术后5 d生存率。
, http://www.100md.com
5. 统计分析：数据以±s表示，采用SPSS统计软件行方差分析、q检验，生存率用Fisher exact检验。
结 果
1. Tet对大鼠ATP诱导细胞外钙内流的影响：不同浓度的Tet能有效抑制ATP诱导的细胞内[Ca2+]i的增加(P<0.01)，且呈剂量依赖性(表1)。
表1 Tet对大鼠ATP诱导的细胞外钙内流
所致[Ca2+]i变化的影响(nmol/L，±s)
组别
标本数
[Ca2+]i
, 百拇医药
静息[Ca2+]i
7
159.11±9.16
CaCl2(5mmol/L)+ATP
7
1497.49±101.07△
Tet(40μmol/L)+CaCl2+ATP
7
775.75±65.73△**#
Tet(80μmol/L)+CaCl2+ATP
, 百拇医药
7
444.88±46.16△**▲
Tet(160μmol/L)+CaCl2+ATP
7
233.48±20.24△**
与静息[Ca2+]i比较：△P<0.05； 与未加Tet比较：**P<0.01； Tet(40 μmol/L)与Tet(80 μmol/L)比较：#P<0.05； Tet(80 μmol/L)与Tet(160 μmol/L)比较：▲P<0.05
2. Tet对大鼠ATP诱导细胞内钙释放的影响：肝细胞悬液加入Tet后，[Ca2+]i浓度为(127.56±12.72) nmol/L，与正常大鼠肝细胞静息[Ca2+]i[(134.92±20.94) nmol/L)]几乎相等，说明Tet不影响肝细胞静息[Ca2+]i；无细胞外Ca2+时，ATP诱导细胞内钙释放，[Ca2+]i为(154.93±15.19) nmol/L，与无Tet 时肝细胞[Ca2+]i [(177.37±18.70) nmol/L]差别不明显(P>0.05)，说明Tet对ATP诱导细胞内钙释放无明显抑制作用。
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3. 缺血/再灌注损伤大鼠血清ALT、LDH的变化：见表2。
4. 缺血/再灌注损伤大鼠肝组织ATP及EC的变化：见表3。
5. 缺血/再灌注损伤大鼠血浆ET及再灌注50 min肝细胞[Ca2+]i的变化：见表4。
6. 组织学检查：光镜显示，Ctrl组肝细胞明显肿胀，间质炎性细胞浸润，少量肝细胞坏死；Tet组肝窦索结构清晰，细胞肿胀轻微，无细胞坏死。 电镜显示，Ctrl组肝细胞内质网、线粒体扩张，线粒体嵴紊乱、空泡化，内质网囊泡化，微胆管扩张，微绒毛脱落；Tet组细胞膜结构基本正常，线粒体、内质网轻微肿胀，微胆管结构正常，微绒毛清晰。
7. 生存率：大鼠缺血/再灌注损伤后5 d生存率，Ctrl组(10%)明显低于Tet组(70%)(P<0.05)。
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表2 缺血/再灌注损伤大鼠血清ALT、LDH的变化(U/L，±s)
组别
ALT
LDH
缺血前
缺血末
再灌注10 min
再灌注50 min
缺血前
缺血末
再灌注10 min
再灌注50 min
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对照组
34.77±
240.04±
1636.64±
1024.40±
1079.95±
1767.82±
5553.61±
3818.80±
4.12(6)
31.93(5)
176.65(7)
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119.92(7)△
105.55(6)
170.19(5)
439.69(7)
417.99(7)△
Tet组
34.77±
221.12±
802.91±
649.67±
1079.95±
, 百拇医药 1231.22±
2699.10±
2017.04±
4.12(6)
22.14(5)
62.63(7)*
39.87(7)*△
105.55(6)
126.43(5)*
188.91(7)*
222.38(7)*△
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假手术组
-
-
-
42.83±
-
-
-
1275.83±
4.36(5)*
182.19(5)*
注：表中括号内数字为鼠数。与同时相对照组比较：*P<0.05； 与同时相假手术组比较：△P<0.05表3 缺血/再灌注损伤大鼠肝组织ATP及EC的变化(±s)
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组别
ATP(μmol/g)
EC
缺血前
缺血末
再灌注10 min
再灌注50 min
缺血前
缺血末
再灌注10 min
再灌注50 min
对照组
2.52±
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0.22±
0.52±
0.85±
0.83±
0.24±
0.53±
0.70±
0.40(6)
0.08(5)
0.06(7)
0.09(7)△△
0.02(6)
, 百拇医药
0.06(5)
0.04(7)
0.04(7)△△
Tet组
2.52±
0.23±
0.77±
1.43±
0.83±
0.24±
0.59±
0.78±
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0.40(6)
0.06(5)
0.08(7)**
0.17(7)**△△
0.02(6)
0.04(5)
0.04(7)
0.03(7)**△
假手术组
-
-
, 百拇医药 -
2.45±
-
-
-
0.83±
0.08(5)**
0.02(5)**
注：表中括号内数字为鼠数。与同时相对照组比较：**P<0.01； 与同时相假手术组比较：△P<0.05 △△P<0.01表4 缺血/再灌注损伤大鼠血浆ET及再灌注50 min肝细胞[Ca2+]i的变化(±s)
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组别
ET(pg/ml)
缺血前
缺血末
再灌注10 min
再灌注50 min
[Ca2+]i (nmol/L)
对照组
43.70±5.74(6)
63.97±8.39(5)
103.94±11.01(7)
, 百拇医药 170.39±21.22(7)△△
492.91±63.23(7)△△
Tet组
43.70±5.74(6)
56.43±8.56(5)
88.15±10.25(7)*
121.25±16.34(7)**△△
316.89±33.84(7)**△△
假手术组
-
, 百拇医药
-
-
54.66±8.89(5)**
130.01±14.93(5)**
注：表中括号内数字为鼠数。与同时相对照组比较：*P<0.05 **P<0.01； 与同时相假手术组比较：△△P<0.01
讨 论
肝脏缺血再灌注损伤不仅在缺血的当时，而且可能在再灌注恢复后一段时间内阻碍肝脏功能的恢复，但原因仍不十分清楚，细胞内Ca2+超载可能是其重要机制。如能有效抑制细胞内Ca2+超载，将有可能改善这种损伤的发生。维拉帕米能减轻肝再灌注损伤，但其属于电压依赖性钙通道(PDC)阻滞剂，而肝细胞Ca2+内流以受体操纵性钙通道(ROC)为主。所以，如能找到选择性阻断细胞ROC的药物，阻断Ca2+内流就更完全，防护作用可能更理想。曾有报道称，Tet可能是一种非选择性钙通道阻滞剂[5]。
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外源性ATP增加细胞[Ca2+]i主要是由于细胞外Ca2+内流或内贮存钙释放[6]，本研究中也得到证实。肝细胞Ca2+内流的ROC不受离子交换的影响，不涉及膜去极化，难以观察K+等诱导剂所激发的细胞内高Ca2+现象，这与心肌细胞不同[7]。笔者曾用K+(30 mmol/L)替代ATP诱导Ca2+内流，细胞荧光值无明显变化，也说明肝细胞Ca2+内流与PDC关系不明显。本研究提示Tet对肝细胞静息[Ca2+]i无影响，而对ATP诱导的Ca2+内流有明显抑制作用，且呈浓度依赖性，但对细胞内钙释放抑制不明显。另外，Tet用于肝脏缺血/再灌注损伤大鼠，大鼠血浆ALT和LDH在缺血前与缺血末变化不大，而真正升高是在再灌注阶段，此阶段Tet组酶水平明显低于Ctrl组。从能量代谢角度看，缺血末ATP急剧消耗，再灌注恢复后ATP浓度回升，说明缺血引起的能量降解是可逆的，EC变化与ATP相似。结果显示，Tet能明显加速肝细胞能量代谢的恢复。ET是由内皮细胞产生的血管活性肽，缺氧能引起ET基因表达，ET作为一种典型的钙动员激素能明显刺激[Ca2+]i的增加[8]。ET在再灌注期升高更明显，原因可能是缺血时肝血窦内皮细胞、肝小叶中央静脉内皮细胞等产生ET和门脉血管床因瘀血、内皮受损而使ET积累。再灌注阶段高ET的门脉血进入肝脏，加重肝微循环损害，而Tet处理能减轻再灌注引起的高ET血症和细胞内Ca2+增高。
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经典钙通道阻滞剂对肝再灌注损伤的防护因药物对PDC阻滞强于对ROC，效果不如对心脏明显。本研究结果表明，Tet能抑制ATP诱导的肝细胞Ca2+内流， 它可能以肝细胞ROC阻滞剂的身份抑制细胞内Ca2+超载，从而在再灌注损伤时发挥对肝脏的防护作用。
曾荻洵(410073 长沙，国防科学技术大学附属医院普外科)
赵明(410073 长沙，国防科学技术大学附属医院普外科)
刘卫东(410073 长沙，国防科学技术大学附属医院普外科)
吕新生(湖南医科大学附属湘雅医院普外科)
参考文献
1，Yushinari T, Masaaki U, Naofumi N， et al. Changes in calcium content of liver during hepatic ischemia-reperfusion in dogs. J Hepatol， 1994，21:743-747.
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2，Cobreros A. Hepatotoxicity of ethanol: protective effect of calcium channel blocker in isolated hepatocytes. Liver， 1997，17:76-82.
3，卢绪萍，史陈让. 用Fura-2和显微荧光技术定量检测活性肝细胞内游离钙离子. 中国病理生理杂志， 1996， 12:446-448.
4，向群辉，胡随瑜，朱崇学，等. 五兔颗粒剂对大鼠脑组织腺苷酸含量的影响. 湖南医科大学学报， 1996， 21:31-33.
5，Chiu Yin KWAN, Deng HW, Guan YY. Tetrandrine is not a selective calcium channel blocker in vascular smooth muscle. Acta Pharmacologica Sinica， 1992， 13:385-390.
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6，Ikari A. ATP, thapsigargin and cAMP increase Ca2+ in rat hepatocytes by activating 3 different Ca2+ influx pathways. Jpn J Physiol， 1997，47:235-239.
7，Gopalakrishnan M, Tsimoyiannis E. ATP-sensitive K+ channels: pharmacologic properties, regulation and therapeutical potential. Drug Dev Res， 1993，28:95-127.
8，Housset C, Stein J, Thurman R， et al. Endothelin receptor in the liver: Lipocytes as a contractile target for endothelin-1. Proc Natl Acad Sci USA， 1993， 90:9266-9272., http://www.100md.com