周围神经损伤对脊髓运动神经元睫状神经营养因子表达的影响
周围神经损伤对脊髓运动神经元睫状神经营养因子表达的影响
石向群 范明 陆兵勋 米瑞发 杨金升
摘 要 目的 探讨周围神经损伤后脊髓运动神经元表达睫状神经营养因子(CNTF)水平的变化规律及其与神经元病理变化的相关性。 方法 选用出生后3 d和成年大鼠各30只，均分为对照组、伤后3，7，14，21，28 d 6组。切断不同鼠龄Wistar大鼠坐骨神经复制周围神经损伤模型，行免疫组织化学染色CNTF阳性脊髓运动神经元，利用图像分析系统计算脊髓CNTF阳性运动神经元的吸光度值，从而间接反映脊髓运动神经元CNTF水平。 结果 坐骨神经损伤后腰段脊髓运动神经元CNTF水平很快下降，至伤后第2周降至最低水平，随后逐渐恢复，至4周接近对照组水平；光镜病理改变情况与此过程相似。 结论 周围神经损伤后，脊髓运动神经元表达CNTF水平将发生变化，而且其变化规律与损伤后运动神经元的病理变化过程相似；运动神经元内源性CNTF水平与其病变程度呈负相关。
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关键词：周围神经；创伤和损伤；运动神经元；睫状神经营养因子
睫状神经营养因子( CNTF)最早发现于鸡胚眼组织中，因对睫状神经元有营养作用而命名[1]，属于神经调节细胞因子家族中的一员。其受体由3部分组成：(1)CNTF受体α(CNTFR-α);(2)白血病抑制因子(LIF)受体β(LIFR-β);(3)糖蛋白130(GP130)。CNTF与CNTFR-α结合诱导LIFR-β、GP130二聚体化，随即激活与其偶联的Janus酪氨酸激酶(Jak)家族，经 Jak-信号传导和转录激活因子(STAT)途径将信号传入细胞内产生生物效应。CNTF及其受体广泛存在于神经系统,对多种神经元具有营养作用，包括脊髓运动神经元、交感神经元、副交感神经元、感觉神经元、海马神经元等。笔者旨在观察坐骨神经损伤后的脊髓运动神经元的CNFT水平及其与运动神经元病理改变的相关性。
材料与方法
, 百拇医药 1.动物分组和模型制作：选用出生后 3 d的 Wistar大鼠及成年 Wistar大鼠(体重 160～180 g，雌雄不限)各30只(军事医学科学院实验动物中心提供)。实验分正常健康对照组、伤后3，7，14，21，28 d 6组，每组5只，共30只大鼠。
乳鼠模型参照Cheema等[2]的方法制作,乳鼠不予麻醉，右侧后肢股骨中段消毒，切开皮肤暴露坐骨神经,切断坐骨神经，并于远端切除约 1 mm，彻底止血后，缝合皮肤。术毕送回母鼠喂养。
成鼠模型参照 Pennica等[3]和Cheema等[2]的方法制作，用质量浓度为20 g/L的戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉(35 mg/kg)成功后，俯卧位固定于手术台。选取右侧后肢中部，备皮，消毒。切开皮肢，暴露坐骨神经于股方肌下缘10 mm处切断坐骨神经，远端游离并切除 5 mm。彻底止血，逐层缝合，待成鼠清醒后放回笼中常规饲料喂养。
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2.标本处理方法和试剂来源：动物常规麻醉、灌注固定(质量浓度为40 g/L的多聚甲醛， pH 7.4)成功后，背部正中暴露脊髓，取 L4，L5，S1脊髓节段，浸入4℃相同固定液后固定 48 h。标本用PBS(pH 7.4)冲洗，振动切片机切片，片厚 30 μm。每个脊髓取片 8张，常规免疫组织化学染色(ABC法)；另取4张片行尼氏染色。CNTF多克隆抗体由军事医学科学院第三研究所第一研究室制备[4]， ABC试剂盒购于北京中山生物技术公司。
3.图像分析和统计学分析：使用北京航空航天大学与空军总医院联合研制的图像分析统计软件进行图像分析,软件自动计算脊髓前角CNTF阳性运动神经元的平均吸光度值，每个脊髓取6张切片进行图像分析，取其均值使用SPSS 7.5 统计软件行单因素方差分析和样本间t检验。
结 果
, 百拇医药
1. 大体所见：乳鼠伤侧下肢失神经改变明显，肢体挛缩，表面皮肤营养不良，足趾破损；神经断端均有水肿，但无充血、坏死。成鼠损伤与乳鼠表现相似，但套接处神经断端有充血、坏死。
2. 光镜所见：乳鼠组伤后3 d即可见脊髓前角神经元出现胞体肿胀，尼氏染色Nissl小体溶解，核和核仁轻度移位，小部分神经元出现核浓缩、破碎；7 d大部分细胞改变同伤后3 d，核浓缩，破碎细胞增多，细胞皱缩，核三角形变，胶质细胞增多，细胞数明显减少； 14 d细胞核三角形变增多，神经元减少更加明显； 28 d神经元减少明显。成鼠组伤后病理改变与乳鼠组相似，但神经元急性肿胀和数量减少程度均较乳鼠组轻。
3. 免疫组织化学染色：CNTF染色以运动神经元胞浆为主，细胞核亦染色；胶质细胞着色不明显。
4. 图像分析：免疫组化染色CNTF阳性神经元平均吸光度值见表1。伤侧脊髓前角神经元细胞内CNTF水平与健侧及正常对照组比较：乳鼠组伤后7～28 d均显著降低，其中14 d最低,28 d尚未恢复至对照组水平；成鼠组仅在伤后7,14 d显著降低。
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讨 论
1. 神经元内源性CNTF的来源：神经元内源性CNTF 主要来源于周围神经雪旺细胞[5]、中枢神经胶质细胞[6]以及神经元的自分泌。在神经轴突损伤时，雪旺细胞分泌CNTF量增加,神经元轴突加速逆转运CNTF ,以促进对神经元的营养作用[5，7]。本研究结果显示，神经损伤后，神经元CNTF水平随即下降，术后2周为最低水平，4周仍未恢复至对照组水平，其原因可能与神经轴突损伤及损伤的形式有关。本模型系切断神经并使断端缺损，这样，远端雪旺细胞分泌的CNTF不能到达神经元胞体；同时该损伤的程度亦较挤压伤重，神经元胞体的生理功能将受到严重影响，近端雪旺细胞变性程度亦重，且它们的恢复过程亦受到相同影响。
2. 影响神经元损伤后再生的主要因素： (1)神经元的靶依赖性生长。神经系统生长发育具有靶依赖性,尤其胚胎期和新生期更加明显，成年后逐渐减弱。这点在临床上也得到证实，即周围神经损伤后，通过外科手术将离断的神经断端连接以恢复靶器官的刺激，有利于神经再生和功能的恢复。本实验所用模型为神经元永久性失去靶器官的刺激，故其引起神经元损伤的结果较一般的挤压模型为重。(2)神经营养因子的作用。神经元在生长发育过程中，需要一定数量和种类的神经营养因子的营养，否则神经元将死亡。在发育过程中，因神经营养因子的相对缺乏，导致一定数量的神经元凋亡，这也说明了神经营养因子对神经元的重要性。作为脊髓运动神经元，它主要接受CNTF的营养，同时也接受其他神经营养因子的营养。本实验结果显示，内源性CNTF水平与神经元病变程度呈负相关，因此，升高CNTF水平将有利于损伤后神经元的恢复。另有实验证明，剔除CNTF基因的小鼠出生时虽然无明显神经系统功能缺损体征，但至成年时面神经核神经元脱失 22%，且肢体肌肉发育差，如果同时给予外源性CNTF可以防止这一变化的发生[8]。有实验证明，损伤局部应用外源性CNTF可预防损伤后运动神经元的变性和死亡[9]，其原因可能是通过提高内源性CNTF水平而达到治疗作用。目前，将一内装能分泌CNTF活细胞的半透膜微囊植入病变局部，提高局部CNTF浓度，达到更好的效果[10]。相信经过进一步研究，可望使CNTF安全有效地在临床上应用于治疗周围神经损伤和退行性疾病。 (3)神经元损伤的部位。神经轴突损伤的部位距离胞体越近，其引起神经元胞体变性的程度越重。(4)神经元细胞表型的分化程度。
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表1 大鼠腰骶段脊髓腹角 CNTF阳性运动神经元吸光度值(±s)
组别
鼠数
伤前
伤后时间(d)
3
7
14
21
28
乳鼠组
30
健侧
, 百拇医药
353.4±35.8
355.6±37.2
364.0±38.5
354.8±24.1
375.8±32.1
359.8±27.4
伤侧
364.4±27.7
338.2±27.7
307.6±33.2*
276.4±32.9*
, 百拇医药
332.5±36.5*
341.8±33.6*
成鼠组
30
健侧
358.4±29.4
343.0±44.4
356.8±33.5
375.2±39.9
361.2±26.0
373.8±33.7
, 百拇医药
伤侧
366.4±35.2
368.1±42.5
308.3±39.0*
328.6±37.6*
346.8±28.9
352.4±37.9
与健侧比较：*P<0.05 周围神经损伤后脊髓运动神经元表达睫状神经营养因子水平会发生变化，而且其变化规律与损伤后运动神经元的病理变化过程相似。脊髓运动神经元内源性CNTF水平与其病变程度呈负相关。
石向群(730050 兰州，兰州军区总医院神经内科)
, 百拇医药
杨金升(730050 兰州，兰州军区总医院神经内科)
范明(军事医学科学院第三研究所第一研究室)
米瑞发(军事医学科学院第三研究所第一研究室)
陆兵勋(第一军医大学附属南方医院神经内科)
参考文献
1，Adler R, Landa KB, Manthorpe M, et al. Cholinergic neurotrophic factors intraocular distribution of trophic activity for ciliary neurons. Science, 1979, 204: 1434-1436.
2，Cheema SS, Ricards LJ, Murphy M, et al. Leukaemia inhibitory factor rescues motoneurons from axotomy-induced cell death. Neuro Report,1994,5:989-992.
, http://www.100md.com
3，Pennica D, Arce V, Swanson TA, et al. Caraiotraphin-1, a cytokine present in embryonic muscle, supports long-term survival of spinal motoneurons. Neuron, 1996, 17: 63-74.
4，杨青峰，咸海青，谭湘陵，等. CNTF多克隆抗体的制备与初步应用. 中国神经免疫学和神经病学杂志， 1997，4：29-31.
5，Sendter M, Stockli KA, Thoenen H. Synthesis and localization of ciliary neurotrophic factor in the sciatic nerve of the adult rat after lesion and during regeneration. J Cell Biol, 1992, 118: 139-148.
, 百拇医药
6，Stockli KA, Lillien LE, Naher NM, et al. Regional distribution, development change cellular localization of CNTF-mRNA and protein in the rat brain. J Cell Biol, 1991, 115: 447-459.
7，Curtis R, Adryan KH, Zhu Y, et al. Retrograda axonal transport of CNTF is increased by peripheral nerve injury. Nature, 1993, 365: 253-255.
8，Stendter M, Schmalbruch H, Stockli KH, et al. Ciliary neurotrophic factor prevents degeneration of motor neurons in mouse mutant progressive motor neuropathy. Nature, 1992, 358: 502-504.
, http://www.100md.com
9，Cllenkate HJLM, Gispen WH, Jennekens FGI. Effects of CNTF on retrograde cell reaction after facial nerve crush in young adult rats. Brain Res, 1996,717: 29-37.
10，Aebicher P, Schluep P, Deglon M, et al. Intrathecal delivery of CNTF using encapsulated genetically modified xenogenic cells in amyotrophic later sclerosis patients. Nature Med, 1996, 2,1996-1999., http://www.100md.com
石向群 范明 陆兵勋 米瑞发 杨金升
摘 要 目的 探讨周围神经损伤后脊髓运动神经元表达睫状神经营养因子(CNTF)水平的变化规律及其与神经元病理变化的相关性。 方法 选用出生后3 d和成年大鼠各30只，均分为对照组、伤后3，7，14，21，28 d 6组。切断不同鼠龄Wistar大鼠坐骨神经复制周围神经损伤模型，行免疫组织化学染色CNTF阳性脊髓运动神经元，利用图像分析系统计算脊髓CNTF阳性运动神经元的吸光度值，从而间接反映脊髓运动神经元CNTF水平。 结果 坐骨神经损伤后腰段脊髓运动神经元CNTF水平很快下降，至伤后第2周降至最低水平，随后逐渐恢复，至4周接近对照组水平；光镜病理改变情况与此过程相似。 结论 周围神经损伤后，脊髓运动神经元表达CNTF水平将发生变化，而且其变化规律与损伤后运动神经元的病理变化过程相似；运动神经元内源性CNTF水平与其病变程度呈负相关。
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关键词：周围神经；创伤和损伤；运动神经元；睫状神经营养因子
睫状神经营养因子( CNTF)最早发现于鸡胚眼组织中，因对睫状神经元有营养作用而命名[1]，属于神经调节细胞因子家族中的一员。其受体由3部分组成：(1)CNTF受体α(CNTFR-α);(2)白血病抑制因子(LIF)受体β(LIFR-β);(3)糖蛋白130(GP130)。CNTF与CNTFR-α结合诱导LIFR-β、GP130二聚体化，随即激活与其偶联的Janus酪氨酸激酶(Jak)家族，经 Jak-信号传导和转录激活因子(STAT)途径将信号传入细胞内产生生物效应。CNTF及其受体广泛存在于神经系统,对多种神经元具有营养作用，包括脊髓运动神经元、交感神经元、副交感神经元、感觉神经元、海马神经元等。笔者旨在观察坐骨神经损伤后的脊髓运动神经元的CNFT水平及其与运动神经元病理改变的相关性。
材料与方法
, 百拇医药 1.动物分组和模型制作：选用出生后 3 d的 Wistar大鼠及成年 Wistar大鼠(体重 160～180 g，雌雄不限)各30只(军事医学科学院实验动物中心提供)。实验分正常健康对照组、伤后3，7，14，21，28 d 6组，每组5只，共30只大鼠。
乳鼠模型参照Cheema等[2]的方法制作,乳鼠不予麻醉，右侧后肢股骨中段消毒，切开皮肤暴露坐骨神经,切断坐骨神经，并于远端切除约 1 mm，彻底止血后，缝合皮肤。术毕送回母鼠喂养。
成鼠模型参照 Pennica等[3]和Cheema等[2]的方法制作，用质量浓度为20 g/L的戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉(35 mg/kg)成功后，俯卧位固定于手术台。选取右侧后肢中部，备皮，消毒。切开皮肢，暴露坐骨神经于股方肌下缘10 mm处切断坐骨神经，远端游离并切除 5 mm。彻底止血，逐层缝合，待成鼠清醒后放回笼中常规饲料喂养。
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2.标本处理方法和试剂来源：动物常规麻醉、灌注固定(质量浓度为40 g/L的多聚甲醛， pH 7.4)成功后，背部正中暴露脊髓，取 L4，L5，S1脊髓节段，浸入4℃相同固定液后固定 48 h。标本用PBS(pH 7.4)冲洗，振动切片机切片，片厚 30 μm。每个脊髓取片 8张，常规免疫组织化学染色(ABC法)；另取4张片行尼氏染色。CNTF多克隆抗体由军事医学科学院第三研究所第一研究室制备[4]， ABC试剂盒购于北京中山生物技术公司。
3.图像分析和统计学分析：使用北京航空航天大学与空军总医院联合研制的图像分析统计软件进行图像分析,软件自动计算脊髓前角CNTF阳性运动神经元的平均吸光度值，每个脊髓取6张切片进行图像分析，取其均值使用SPSS 7.5 统计软件行单因素方差分析和样本间t检验。
结 果
, 百拇医药
1. 大体所见：乳鼠伤侧下肢失神经改变明显，肢体挛缩，表面皮肤营养不良，足趾破损；神经断端均有水肿，但无充血、坏死。成鼠损伤与乳鼠表现相似，但套接处神经断端有充血、坏死。
2. 光镜所见：乳鼠组伤后3 d即可见脊髓前角神经元出现胞体肿胀，尼氏染色Nissl小体溶解，核和核仁轻度移位，小部分神经元出现核浓缩、破碎；7 d大部分细胞改变同伤后3 d，核浓缩，破碎细胞增多，细胞皱缩，核三角形变，胶质细胞增多，细胞数明显减少； 14 d细胞核三角形变增多，神经元减少更加明显； 28 d神经元减少明显。成鼠组伤后病理改变与乳鼠组相似，但神经元急性肿胀和数量减少程度均较乳鼠组轻。
3. 免疫组织化学染色：CNTF染色以运动神经元胞浆为主，细胞核亦染色；胶质细胞着色不明显。
4. 图像分析：免疫组化染色CNTF阳性神经元平均吸光度值见表1。伤侧脊髓前角神经元细胞内CNTF水平与健侧及正常对照组比较：乳鼠组伤后7～28 d均显著降低，其中14 d最低,28 d尚未恢复至对照组水平；成鼠组仅在伤后7,14 d显著降低。
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讨 论
1. 神经元内源性CNTF的来源：神经元内源性CNTF 主要来源于周围神经雪旺细胞[5]、中枢神经胶质细胞[6]以及神经元的自分泌。在神经轴突损伤时，雪旺细胞分泌CNTF量增加,神经元轴突加速逆转运CNTF ,以促进对神经元的营养作用[5，7]。本研究结果显示，神经损伤后，神经元CNTF水平随即下降，术后2周为最低水平，4周仍未恢复至对照组水平，其原因可能与神经轴突损伤及损伤的形式有关。本模型系切断神经并使断端缺损，这样，远端雪旺细胞分泌的CNTF不能到达神经元胞体；同时该损伤的程度亦较挤压伤重，神经元胞体的生理功能将受到严重影响，近端雪旺细胞变性程度亦重，且它们的恢复过程亦受到相同影响。
2. 影响神经元损伤后再生的主要因素： (1)神经元的靶依赖性生长。神经系统生长发育具有靶依赖性,尤其胚胎期和新生期更加明显，成年后逐渐减弱。这点在临床上也得到证实，即周围神经损伤后，通过外科手术将离断的神经断端连接以恢复靶器官的刺激，有利于神经再生和功能的恢复。本实验所用模型为神经元永久性失去靶器官的刺激，故其引起神经元损伤的结果较一般的挤压模型为重。(2)神经营养因子的作用。神经元在生长发育过程中，需要一定数量和种类的神经营养因子的营养，否则神经元将死亡。在发育过程中，因神经营养因子的相对缺乏，导致一定数量的神经元凋亡，这也说明了神经营养因子对神经元的重要性。作为脊髓运动神经元，它主要接受CNTF的营养，同时也接受其他神经营养因子的营养。本实验结果显示，内源性CNTF水平与神经元病变程度呈负相关，因此，升高CNTF水平将有利于损伤后神经元的恢复。另有实验证明，剔除CNTF基因的小鼠出生时虽然无明显神经系统功能缺损体征，但至成年时面神经核神经元脱失 22%，且肢体肌肉发育差，如果同时给予外源性CNTF可以防止这一变化的发生[8]。有实验证明，损伤局部应用外源性CNTF可预防损伤后运动神经元的变性和死亡[9]，其原因可能是通过提高内源性CNTF水平而达到治疗作用。目前，将一内装能分泌CNTF活细胞的半透膜微囊植入病变局部，提高局部CNTF浓度，达到更好的效果[10]。相信经过进一步研究，可望使CNTF安全有效地在临床上应用于治疗周围神经损伤和退行性疾病。 (3)神经元损伤的部位。神经轴突损伤的部位距离胞体越近，其引起神经元胞体变性的程度越重。(4)神经元细胞表型的分化程度。
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表1 大鼠腰骶段脊髓腹角 CNTF阳性运动神经元吸光度值(±s)
组别
鼠数
伤前
伤后时间(d)
3
7
14
21
28
乳鼠组
30
健侧
, 百拇医药
353.4±35.8
355.6±37.2
364.0±38.5
354.8±24.1
375.8±32.1
359.8±27.4
伤侧
364.4±27.7
338.2±27.7
307.6±33.2*
276.4±32.9*
, 百拇医药
332.5±36.5*
341.8±33.6*
成鼠组
30
健侧
358.4±29.4
343.0±44.4
356.8±33.5
375.2±39.9
361.2±26.0
373.8±33.7
, 百拇医药
伤侧
366.4±35.2
368.1±42.5
308.3±39.0*
328.6±37.6*
346.8±28.9
352.4±37.9
与健侧比较：*P<0.05 周围神经损伤后脊髓运动神经元表达睫状神经营养因子水平会发生变化，而且其变化规律与损伤后运动神经元的病理变化过程相似。脊髓运动神经元内源性CNTF水平与其病变程度呈负相关。
石向群(730050 兰州，兰州军区总医院神经内科)
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杨金升(730050 兰州，兰州军区总医院神经内科)
范明(军事医学科学院第三研究所第一研究室)
米瑞发(军事医学科学院第三研究所第一研究室)
陆兵勋(第一军医大学附属南方医院神经内科)
参考文献
1，Adler R, Landa KB, Manthorpe M, et al. Cholinergic neurotrophic factors intraocular distribution of trophic activity for ciliary neurons. Science, 1979, 204: 1434-1436.
2，Cheema SS, Ricards LJ, Murphy M, et al. Leukaemia inhibitory factor rescues motoneurons from axotomy-induced cell death. Neuro Report,1994,5:989-992.
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3，Pennica D, Arce V, Swanson TA, et al. Caraiotraphin-1, a cytokine present in embryonic muscle, supports long-term survival of spinal motoneurons. Neuron, 1996, 17: 63-74.
4，杨青峰，咸海青，谭湘陵，等. CNTF多克隆抗体的制备与初步应用. 中国神经免疫学和神经病学杂志， 1997，4：29-31.
5，Sendter M, Stockli KA, Thoenen H. Synthesis and localization of ciliary neurotrophic factor in the sciatic nerve of the adult rat after lesion and during regeneration. J Cell Biol, 1992, 118: 139-148.
, 百拇医药
6，Stockli KA, Lillien LE, Naher NM, et al. Regional distribution, development change cellular localization of CNTF-mRNA and protein in the rat brain. J Cell Biol, 1991, 115: 447-459.
7，Curtis R, Adryan KH, Zhu Y, et al. Retrograda axonal transport of CNTF is increased by peripheral nerve injury. Nature, 1993, 365: 253-255.
8，Stendter M, Schmalbruch H, Stockli KH, et al. Ciliary neurotrophic factor prevents degeneration of motor neurons in mouse mutant progressive motor neuropathy. Nature, 1992, 358: 502-504.
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9，Cllenkate HJLM, Gispen WH, Jennekens FGI. Effects of CNTF on retrograde cell reaction after facial nerve crush in young adult rats. Brain Res, 1996,717: 29-37.
10，Aebicher P, Schluep P, Deglon M, et al. Intrathecal delivery of CNTF using encapsulated genetically modified xenogenic cells in amyotrophic later sclerosis patients. Nature Med, 1996, 2,1996-1999., http://www.100md.com